UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI BARI
DIPARTIMENTO DI FARMACIA-SCIENZE DEL FARMACO
1st Research Day
Towards high-affinity ligands for CLC-K channel: optimal
pharmacophoric requirements of new ligands bearing 2benzofuran carboxylic acid scaffold
RELATORE: Giuseppe FRACCHIOLLA
Canali al cloro
Sono proteine implicate in diversi processi fisiologici tra cui i meccanismi di
eccitabilità delle cellule nervose e muscolari e la regolazione della diuresi e
dell’omeostasi idrico-salina
Recettori postsinaptici inibitori
attivati da GABA e glicina
Regolatori della conduttanza
transmembrana della fibrosi cistica
Famiglia dei CLC
CLC-1
CLC-2
CLC-Ka
CLC-Kb
CLC-3
CLC-4
CLC-5
CLC-6
CLC-7
CLC-K sono espressi nel rene dove esplicano un ruolo importante nel trasporto transepiteliale di sali.
CLC-Ka è il maggior canale che media il trasporto di cloro transepiteliale nel tratto ascendente sottile
dell’ansa di Henle.
CLC-Kb è un canale basolaterale presente nel TAL, nel DCT, nel CNT e nelle cellule intercalate del
dotto collettore. Mutazioni a carico di questo gene causa la sindrome di Bartter di tipo III patologia
caratterizzata da una eccessiva perdita di sali.
Presupposti della ricerca
L’importanza del ruolo dei CLC-K umani nel riassorbimento renale di sali ha
fatto crescere l’interesse verso la scoperta di ligandi utili come tools
farmacologici per lo studio delle correnti regolate da questi canali e
potenzialmente impiegabili per la terapia di alcune sindromi collegate a
questi canali e per il trattamento dell’ipertensione.
ATTIVATORI
CLC-Kb
SINDROME DI
BARTTER
CLC-Ka
REGOLAZIONE DEL
RIASSORBIMENTO
DI ACQUA
CLC-Kb
NUOVA CLASSE DI
DIURETICI
INIBITORI
BLOCCANTI
Presupposti della ricerca
Non sono noti attivatori o inibitori endogeni per i canali CLC-K per cui la
ricerca allo stato attuale è orientata verso lo studio delle relazioni strutturaattività di alcuni ligandi attivi riportati in letteratura e da noi sintetizzati
BLOCCANTE
PIU’ POTENTE
DEI CLC-K
Cl
CF3
NH
O
COOH
COOH
FFA
BLOCCANTI DEI CLC-K
(CLC-Ka >> CLC-Kb)
CF3
N
NH
COOH
GF47
NFA
ATTIVATORE
CLC-Ka
A. PINELLI, C. GODIO, A. LAGHEZZA, N. MITRO, G. FRACCHIOLLA, V. TORTORELLA, A. LAVECCHIA, E. NOVELLINO, J.-C. FRUCHART, B.
STAELS, M. CRESTANI, F. LOIODICE (2005). Synthesis, Biological Evaluation, and Molecular Modeling Investigation of New Chiral Fibrates with
PPARalpha and PPARgamma Agonist Activity. J. MED. CHEM., 48, 5509-5519.
A. LIANTONIO, A. PICOLLO, E. BABINI, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, F. LOIODICE, V. TORTORELLA, M. PUSCH, AND D. CONTE
CAMERINO (2006). Activation and Inhibition of Kidney CLC-K Chloride Channels by Fenamates. MOL. PHARM., 69, 165-173.
Presupposti della ricerca
Non sono noti attivatori o inibitori endogeni per i canali CLC-K per cui la
ricerca allo stato attuale è orientata verso lo studio delle relazioni strutturaattività di alcuni ligandi attivi riportati in letteratura e da noi sintetizzati
Bloccanti
Attivatore
L’EFFETTO FINALE DI ATTIVAZIONE O DI BLOCCO DEL CANALE E’ STRETTAMENTE
CORRELATO ALLA GEOMETRIA ASSUNTA DA QUESTE MOLECOLE
A. LIANTONIO, A. PICOLLO, E. BABINI, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, F. LOIODICE, V. TORTORELLA, M. PUSCH, AND D. CONTE
CAMERINO (2006). Activation and Inhibition of Kidney CLC-K Chloride Channels by Fenamates. MOL. PHARM., 69, 165-173.
Presupposti della ricerca
A. LIANTONIO, A. PICOLLO, E. BABINI, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, F. LOIODICE, V. TORTORELLA, M. PUSCH, AND D. CONTE
CAMERINO (2006). Activation and Inhibition of Kidney CLC-K Chloride Channels by Fenamates. MOL. PHARM., 69, 165-173.
Presupposti della ricerca
Ricerca di nuovi ligandi più selettivi e più potenti dei CLC-Ka/Kb umani
O
COOH
Cl
GF47 (1)
O
COOH
Cl
GF167 (2)
G. FRACCHIOLLA, A. LAGHEZZA, L. PIEMONTESE, G. CARBONARA, A.
LAVECCHIA, P. TORTORELLA, M. CRESTANI, E. NOVELLINO, F. LOIODICE
(2007). Synthesis, Biological Evaluation, and Molecular Modeling
Investigation of Chiral Phenoxyacetic Acid Analogues with PPARalpha and
PPARgamma Agonist Activity. CHEMMEDCHEM, 14;2(5), 641-654, 1860-7179.
Studi SAR
♦ Definire i requisiti essenziali per l’attività biologica
♦ Migliorare la potenza bloccante e/o l’affinità verso le due isoforme
H
N
S
COOH
Cl
COOH
Cl
O
COOH
O
COOH
3
Cl
1
4
5
O
COOH
Br
O
COOH
O
6
Cl
COOH
9
Cl
O
COOH
O
COOH
Cl
2
H3 C
CH3
10
7
O
O
O
COOH
COOH
COOH
Cl
Cl
Cl
8
12
11
A. LIANTONIO, A. PICOLLO, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, P. TORTORELLA, F. LOIODICE, A. LAGHEZZA, E. BABINI, G. ZIFARELLI, M.
PUSCH, AND D. CONTE CAMERINO. Molecular switch for CLC-K Cl channel block/activation: Optimal pharmacophoric requirements towards
high-affinity ligands. PNAS, 2008, 105, 4, 1369-1373.
Saggi biologici
O
100
COOH
CLC-Ka
> 200
O
COOH
90
Cl
Cl
1
80
9
O
O
70
COOH
COOH
Cl
Cl
Kd mM
60
2
H
N
COOH
10
50
O
COOH
Cl
40
Cl
Cl
30
3
11
20
O
COOH
S
COOH
10
Cl
Cl
4
0
1
2
3
O
4
5
6
O
COOH
5
8
O
COOH
Br
7
6
10
11
12
12
O
COOH
H3C
9
7
COOH
8
I test farmacologici sono stati eseguiti su CLC-Ka e CLC-Kb espressi in oociti di xenopus laevis attraverso la
tecnica del voltage-clamp
A. LIANTONIO, A. PICOLLO, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, P. TORTORELLA, F. LOIODICE, A. LAGHEZZA, E. BABINI, G. ZIFARELLI, M.
PUSCH, AND D. CONTE CAMERINO. Molecular switch for CLC-K Cl channel block/activation: Optimal pharmacophoric requirements towards
high-affinity ligands. PNAS, 2008, 105, 4, 1369-1373.
Saggi biologici
100
CLC-Ka
> 300
90
CLC-Kb
80
70
Kd mM
60
50
40
30
20
10
0
1
O
2
8
O
COOH
O
COOH
O
COOH
COOH
Cl
Cl
1
12
O
COOH
Cl
Cl
11
2
8
Cl
11
12
I test farmacologici sono stati eseguiti su CLC-Ka e CLC-Kb espressi in oociti di xenopus laevis attraverso la
tecnica del voltage-clamp
A. LIANTONIO, A. PICOLLO, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, P. TORTORELLA, F. LOIODICE, A. LAGHEZZA, E. BABINI, G. ZIFARELLI, M.
PUSCH, AND D. CONTE CAMERINO. Molecular switch for CLC-K Cl channel block/activation: Optimal pharmacophoric requirements towards
high-affinity ligands. PNAS, 2008, 105, 4, 1369-1373.
Modello farmacoforico
In base ai requisiti strutturali delle diverse classi di composti finora sintetizzati
e alle relazioni struttura-attività emerse è stato definito un modello di
farmacoforo per bloccanti e attivanti di questi canali
• GRUPPO CARBOSSILICO
• DUE ANELLI AROMATICI
IDROFOBICI
Angolo diedro TRA I DUE
ANELLI AROMATICI
0-8°
ATTIVANTI
20-80° BLOCCANTI
I REQUISITI INDIVIDUATI PER IL FARMACOFORO SONO STATI VALIDATI EFFETTUANDO
UN QUERY 3D NEL CCDS
A. LIANTONIO, A. PICOLLO, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, P. TORTORELLA, F. LOIODICE, A. LAGHEZZA, E. BABINI, G. ZIFARELLI, M.
PUSCH, AND D. CONTE CAMERINO. Molecular switch for CLC-K Cl channel block/activation: Optimal pharmacophoric requirements towards
high-affinity ligands. PNAS, 2008, 105, 4, 1369-1373.
Finalità della ricerca
Modificazioni dell'anello furanico
N
O
COOH
COOH
COOH
*
*
acidi 3H-indol-2-carbossilici
acidi 1H-inden-2-carbossilici
Modificazione -COOH
-SO3H, -PO3H2, -tetrazolo
Modificazioni del
gruppo idrofobico 5-R
Riduzione
del doppio legame
anelli isosteri
- 2 (20) e 3-furil (21)
- 3 e 4-piridinil
- 2 (22) e 3-tienil
7
6
O
1
5
R
anelli aromatici sotituiti
- p-metossi-fenil (17)
- p-cloro-fenil (18)
- p-fenil-fenil (19)
acidi 4H-cromen-2-carbossilici
4
2
COOH
O
3
R1
*
*
COOH
acidi 2,3-diidro-1-benzofuran2-carbossilici
gruppi alchilarilici
- benzil (15)
- feniletil (16)
3-phenyl-1-benzofuran2-carboxylic acid
Modificazioni del
gruppo idrofobico R1
-
o-metossi
o-nitro
o-tert-butile
o-Cl
Modificazioni del 3-fenil
anelli isosteri
- 2 e 4-piridinil
- 2 e 3-furil
- 2 e 3-tienil
gruppi alchilarilici
- benzil
- feniletil
Schema di sintesi
OH
X1
O
O
+
X2
O
O
O
a
COOEt
O
Br
X1
X2
X1; X2 = H, Cl, Br
b,c
O
COOH
R
X2
1-22
a) K2CO3, acetone anidro, riflusso b) RB(OH)2, Cs2CO3, Tetrakis Pd(0), toluene
anidro, mw; Resa: 72-80%; 20-30 min ; c) NaOH 1N, THF 1:1. t.a./HCl
L. PIEMONTESE, G. CARBONARA, G. FRACCHIOLLA, A. LAGHEZZA, P. TORTORELLA, AND F. LOIODICE. Convenient Synthesis of Some 3Phenyl-1-benzofuran-2-carboxylic Acid Derivatives as New Potential Inhibitors of CLC-Kb Channels. HETEROCYCLES, 2010, 81 (12), 2865-2872.
Lavori in corso…
DERIVATI SINTETICI
O
R
O
COOH
COOH
X
Lead compound
R = H, CH3, CH3O, CF3O
X = H, Cl
O
O
Gruppo Acido
R
HOOC
O
spacer
COOH
X
Gruppo Acido: SO3H,
PO3H2,
CONHSO2R,
tetrazolo
R; X = sostituenti vari
Ligandi doppi
NUOVI LIGANDI DISPONIBILI IN COMMERCIO
Valutazione dell’attività biologica di farmaci noti e di nuovi ligandi
commercialmente disponibili, derivati dall’esplorazione di differenti
banche dati utilizzando come query 3D il nuovo modello farmacoforico
da noi messo a punto
RINGRAZIAMENTI
DIPARTIMENTO DI FARMACIA – SCIENZE DEL FARMACO
Giuseppe Carbonara
Diana Conte-Camerino
Antonio Carrieri
Paola Imbrici
Carlo Franchini
Antonella Liantonio
Donato Giannico
Antonio Laghezza
Fulvio Loiodice
Luca Piemontese
Angela Sanrocco
Savino Sfregola
Sabina Sblano
Paolo Tortorella
Istituto di Biofisica, CNR, Genova
Michael Pusch e collaboratori