I Vertebrati ectotermi
del Parco Regionale del Matese, 2002
A cura di Odierna G. e Guarino F.M., pp. 29-55
Caratteristiche genomiche dei Vertebrati ectotermi
del Parco del Matese. I. Risultati dell’analisi cromosomica
GIGANTINO RAFFAELA, APREA GENNARO, CAPRIGLIONE TERESA,
GUARINO FABIO MARIA, ODIERNA GAETANO
Dipartimento di Biologia Evolutiva e Comparata
Università degli Studi di Napoli Federico II
Abstract
This paper reports the results of a chromosomal study carried out by standard and
banding stainings (C-banding, Ag-NOR-banding, Chromomycin A3/methyl green
(CMA3/MG), sequential staining of C-banding+DAPI+CMA3) in three freshwaterfish,
Gasterosteus aculeatus, Scardinius erythrophthalmus and Salmo trutta, and several
herpetological species inhabiting into the Matese Regional Park , namely Rana synklepton
esculenta, R. italica, Bufo bufo, Podarcis sicula, P. muralis, Lacerta bilineata, Chalcides
chalcides, Anguis fragilis, Natrix natrix, Coluber viridiflavus, and Viper aspis. The obtained
results were compared with the available literature data of the corresponding taxa from
regions out the Matese Regional Park. The comparison showed in the Park the presence
of: (i) populations displaying no difference from the corresponding taxa of other regions
out the Park, namely G. aculeatus, S. erythrophthalmus, S. trutta, R. synklepton
esculenta, R. italica, P. sicula, P. muralis, C. chalcides, and N. natrix; (ii) populations
of species, namely, C. viridiflavus and V. aspis, where banding methods were applied
for the first time so that the comparison of the results between the populations within
and out the Park was limited only to the standard chromosome morphology; (iii)
lastly, populations of B. bufo, A. fragilis, and L. bilineata, showing chromosomal
peculiarities and then could represent interesting endemisms into the Matese Regional
Park.
Introduzione
Le caratteristiche dei cariotipi sono spesso impiegate per evidenziare lo stato
tassonomico e i rapporti filogenetici esistenti tra vari gruppi tassonomici. Infatti,
i cromosomi rappresentano i gruppi di associazione entro cui sono organizzati i
vari geni che costituiscono il genoma di un individuo. Inoltre, il cariotipo, in altre
parole numero e forma dei cromosomi, è specie specifico.
Esistono meccanismi di riarrangiamenti cromosomici, quali ad esempio fusioni,
delezioni, inversioni, traslocazioni, che portano inevitabilmente a cambiamenti
genetici anche molto importanti. Quindi, l’individuazione dei riarrangiamenti
cromosomici, responsabili del differenziamento cariologico di dati gruppi
30
GIGANTINO ET AL
tassonomici, spesso contribuisce a stabilire le affinità tassonomiche e a tracciare le
diverse ipotesi filogenetiche all’interno del gruppo considerato.
Qualsiasi analisi filogenetica o sistematica, basata esclusivamente sulla morfologia
e il numero dei cromosomi, è limitata dal fatto che spesso tra le diverse specie di
un gruppo tassonomico tali caratteristiche cariologiche restano fondamentalmente invariate.
Ad esempio, nella famiglia Ranidae che comprende almeno 623 specie, di cui
per circa un terzo è noto il cariotipo, è stato ritrovato nella maggior parte dei
casi (90% circa) un corredo diploide di 2n=26 cromosomi a due braccia, con le
prime cinque coppie nettamente più grandi delle restanti otto coppie (King,
1990).
L’introduzione, a partire dagli anni ’70, di metodiche di bandeggio sempre più
raffinate e potenti (quali C-, G-, NOR-banding, digestioni in situ con enzimi di
restrizione, colorazioni con fluorocromi base specifici per il DNA, pattern di
replicazione, ibridazioni in situ con specifiche sonde a DNA o a RNA), ha consentito la distinzione su base cromosomica di specie con cariotipi apparentemente
simili per numero e morfologia dei cromosomi.
Le tecniche cromosomiche attualmente disponibili permettono di evidenziare le
seguenti caratteristiche: numero dei cromosomi; morfologia dei cromosomi
mitotici, con relativa analisi morfometrica (indice centromerico, I.C., lunghezza
relativa, L.R.); localizzazione delle costrizioni secondarie o di regioni
eteropicnotiche; localizzazione delle regioni nucleolo organizzatrici, tramite AgNOR-banding; distribuzione e composizione dell’eterocromatina, attraverso tecniche di bandeggio–C, o di colorazioni con fluorocromi, o con digestioni con
enzimi di restrizione; G-, R-banding e pattern di replicazione; ibridazione in situ
con sonde a DNA o a RNA; PRINS con specifici primers.
Nel presente lavoro alle popolazioni di numerose specie di vertebrati ectotermi
presenti nel Parco sono state per la prima volta applicate le tecniche per studiare il
numero e la morfologia dei cromosomi, la localizzazione dei NORs e localizzazione e composizione dell’eterocromatina. I risultati ottenuti sono stati comparati
con i dati noti in letteratura dei corrispondenti taxa, evidenziando delle peculiarità soprattutto a carico dell’eterocromatina delle popolazioni del Parco di B. bufo,
A. fragilis e di L. bilineata. Nell’ultima specie è stata intrapresa anche un’analisi
molecolare, in particolare lo studio di sequenze di DNA microsatellitare, allo scopo di verificare se il differenziamento rilevato a livello cromosomico fosse esteso
anche a livello molecolare. In merito alle proprietà dell’eterocromatina e dei
microsatelliti, utili informazioni possono essere trovate rispettivamente nella review
di Hennig (1999) o in quella di Redi et al. (2001) e nel volume di Goldstein &
Schlotterer (1999).
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
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Materiale e metodi
Di seguito è riportato il sesso, numero e provenienza degli esemplari studiati (il
numero tra parentesi indica il toponimo riportato in Guarino et al. di questo
volume):
Gasterosteus aculeatus: 3 maschi e 3 femmine [presso Fontana del Colle, Gallo
(21)]; Scardinius erythrophthalmus: 4 maschi [Lago Matese, San Gregorio Matese
(29)]; Salmo trutta: 3 juveniles [Fiume Lete, c/o fontana del Cannello e la Licia,
Letino (3)]; Bufo bufo: 1 maschio [torrente Reviola, Cusano Mutri (18)]; Rana
synklepton esculenta: 2 maschi [presso Ponte Fossaceca, Gallo (20)], 5 maschi e 1
femmina [presso Fontana del Colle, Gallo (21)]; R. italica: 4 maschi e 1 femmina
[presso Fontana del Colle, Gallo (21)], 2 femmine [Rio Fosso, località Filette
Petraroja (40)], 1 femmina [torrente Reviola, Cusano Mutri (18)], 2 maschi e 3
femmine [acquedotto romano, Fontevecchia, Faicchio (5)]; Podarcis sicula: 2 femmine [Lago Letino, Letino (9)], 1 femmina [Nocelle presso Pozzo Capuano, Civitella
Licinia (12)], 1 maschio [Fontana Nicandro, Valle Agricola (34)], 2 maschi [sponde
del Lago Matese, San Gregorio Matese (29)], 2 maschi [Vallone dell’Inferno,
Piedimonte Matese (32)], 5 femmine e 1 maschio [Strada Gallo-Letino, Gallo
(25)], 2 maschi e 2 femmine [Rio Fosco presso Masseria Gagliardi, Petraroja (45)];
P. muralis: 2 femmine [sponde Lago Letino, Letino (9)], 2 femmine e 2 maschi [il
Campo, Civitella Licinia (15)], 2 maschi e 2 femmine [presso Fontana Nicandro,
Valle Agricola (34)], 2 maschi [sponde del Lago Matese, San Gregorio Matese
(29)], 5 femmine e un maschio [Strada Gallo-Letino, Gallo (25)]; Lacerta bilineata:
2 maschi [sponde Lago Letino, Letino (9)], 1 maschio [Le mandre, Civitella Licinia
(14)], 1 femmina [Campo, Civitella Licinia (15)], 1 femmina [Chianezze, Civitella
Licinia (16)], 1 femmina [Tortora, San Gregorio Matese (26)], 2 femmine [Rio
Fosco presso Masseria Gagliardi, Petraroja (45)]; 1 giovane di femmina [bordo
strada strada Petraroja-Cusano Mutri (46)], 1 maschio [presso fontana Nicandro,
Valle Agricola (34)]; Chalcides chalcides: 4 femmine e 1 maschio [c/o fontana
Prati, Gallo (2)]; Anguis fragilis: 1 maschio e due femmine [presso Fontana
Nicandro, Valle Agricola (34)]; Natrix natrix: 1 maschio e 1 femmina [Vallone
dell’Inferno, Piedimonte Matese (32)], 2 giovani [Fiume Lete, c/o fontana del
Cannello e la Licia, Letino (3)], 1 giovane [Località Pantano, Civitella Licinia
(41)]; Coluber viridiflavus: 1 femmina [San Gregorio Matese (39)]; Viper aspis: 1
maschio [bivio Bocca della Selva-Sepino, Pietraroja (46)].
Analisi cromosomica
Tutti gli esemplari sono stati iniettati intraperitonealmente con una dose (0.1 ml/
10 grammi di peso corporeo) di una soluzione di colchicina (0.5 mg/ml). Dopo due
ore, dagli esemplari preventivamente anestetizzati, sono stati prelevati l’intestino, le
gonadi e i polmoni. I tessuti sono stati incubati in una soluzione ipotonica costituita
32
GIGANTINO ET AL
da sodio citrato allo 0.5% e KCl 75 mM, in parti uguali. I cromosomi sono stati
ottenuti mediante il metodo dello scraping+air drying (Odierna et al. 1996). Lo
studio cromosomico è stato condotto sia mediante colorazioni convenzionali (soluzioni di Giemsa al 5%, pH 7) che mediante le seguenti colorazioni di bandeggio:
Ag-NOR banding (Howell & Black, 1980); cromomicina A3/Verde di metile (Sahar
& Latt, 1980); bandeggio C (Sumner, 1972), incubando i vetrini in idrossido di
bario per 5 min a 45°C, colorando i cromosomi sia separatamente che
sequenzialmente con CMA3 e DAPI (Odierna et al., 2000 a).
Per ciascuna specie esaminata gli indici morfometrici dei cromosomi (Lunghezza
relativa e Indice centromerico) sono stati ricavati da almeno 4 piastre colorate con
Giemsa e da 2 per ciascun tipo di bandeggio usato. I cariotipi sono stati ricostruiti
utilizzando un programma di elaborazioni d’immagini (Adobe Photoshop versione 5.0).
Analisi microsatellitare
Il DNA è stato estratto dalle sospensioni cellulari utilizzate per allestire i cromosomi. I tessuti sono stati sottoposti a diversi lavaggi in T.E. 1x (Tris 10 mM+
EDTA 1mM) per allontanare l’alcool o il fissativo. Quindi il DNA è stato estratto
mediante omogeneizzazione in SDS + digestione con proteinasi K e successive
estrazioni con cloroformio-fenolo-alcool isoamilico (25:24:1).
Le reazioni di PCR per l’amplificazione delle frazioni microsatellitari sono state
eseguite utilizzando tre coppie di primers capaci di amplificare specifiche regioni
microsatellitari dal DNA di Lacerta agilis (Gullberg et al., 1997), denominate:
La-1(F: 5’-AGG TTT CCT GGC TTG GAG-3’; R: 5’-ATT TGC ACA AAA CAG CAG C
–3’); La-2 (F:5’-GCT TTA ATT GGA ACC AGA TTG-3’; R: 5’AAG CAG CCA GAA
CAC AGA G -3’); La-3 (F: 5’- AGT AGC GAG AAG AAT CAG-3’; R: 5’- GAC ATA
TGG CAG AAG AGC AG -3’). Le reazioni sono state condotte in un volume finale
di 25 µl contenente: 1 µl di DNA, 2 µl di dNTP, 1 µl di primer (forward e
reverse), 2.5 µl di buffer, 1 µl di MgCl2 (sono state saggiate concentrazioni differenti di tale sale) e 0.25 unità di Taq polimerasi. Dopo 3 minuti di denaturazione
a 94°C sono stati condotti 35 cicli di amplificazone alle seguenti condizioni: 30
sec di denaturazione a 94°C, 1 minuto di appaiamento dei primers a 50°C, 1
minuto di estensione a 72°C ed una estensione finale di 7 minuti a 72°C. I prodotti di amplificazione sono stati visualizzati sia in gel d’agarosio che in gel
denaturante d’acrilamide al 10%. I gel d’agarosio sono stati colorati con ioduro di
propidio mentre i gel d’acrilamide sono stati colorati in “Silver staining”.
Risultati e discussione
In base ai risultati ottenuti e dal loro confronto con i dati in letteratura le
popolazioni matesane delle specie studiate di verterbrati ectotermi possono essere
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
33
suddivise in: a) popolazioni che non differivano cariologicamente rispetto alle
popolazioni extra-Matese; b) popolazioni per le quali le colorazioni di
bandeggio sono state per la prima volta applicate; c) popolazioni risultate
cariologicamente differenti da quelle
extra-Matese.
Nel primo gruppo di popolazioni
matesane, ovvero quelle cariologicamente uguali alle popolazioni extraMatese, possono essere incluse le popolazioni di G. aculeatus, S. trutta,
S. erythrophthalmus, R. synklepton
esculenta, R. italica, C. chalcides,
P. sicula, P. muralis e N. natrix.
- G. aculeatus
Tutti gli esemplari studiati di spinarello
hanno esibito il cariotipo standard della specie (Chen & Reisman, 1970),
costituito da 42 cromosomi di cui 14
coppie a due braccia (meta- o
submetacentriche) e 7 coppie
telocentriche (Fig. 1). Le regioni
nucleolo organizzatrici (NORs) erano
Fig. 1 - Piastra metafasica di G. aculeatus colorata
localizzate ai telomeri del braccio corto sequenzialmente con Cb-banding+CMA
3
di tre coppie di elementi submeta- (A)+DAPI (B).
centrici. Le colorazioni sequenziali di
bandeggio C+CMA3+DAPI hanno mostrato che l’eterocromatina nucleoloassociata
era positiva ad entrambi i fluorocromi, mentre quella centromerica risultava positiva solo al DAPI (Fig. 1). Il confronto con i risultati di parallele analisi condotte
su popolazioni di spinarello che vivono nel Sarno, fiume campano fortemente
inquinato, hanno rilevato assenze di aberrazioni cromosomiche nelle popolazioni
matesane diversamente da quanto osservato in quelle del Sarno [Rocco et al., 1997Abstr. 58° Congr. Naz. Unione Zoologica Italiana, Cattolica, 24-28 Settembre,
1997: 58].
- S. erythrophthalmus e S. trutta
Gli esemplari di scardola e di trota fario esaminati hanno presentano il cariotipo
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GIGANTINO ET AL
Fig. 2 - Piastre metafasiche di S. erythrophthalmus (A,B e C) e di S. trutta (D, E e F) colorate con
Giemsa (A e D), C-banding+CMA3 (B e E)+DAPI (C e F).
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
35
tipico della specie costituita da 2n=50 cromosomi in S. erythrophthalmus (Cataudella
et al., 1977) e da 2n= 80 cromosomi in S. trutta (Nygren et al., 1971) (Fig. 2). Le
colorazioni sequenziali di bandeggio + fluorocromi hanno evidenziato la presenza
negli esemplari sia di scardola che di trota fario di una eterocromatina centromerica
su quasi tutti i cromosomi che risulta positiva ad entrambi i fluorocromi (Fig. 2).
Tali caratteristiche dell’eterocromatina sono state rinvenute in esemplari extramatesani di scardola (Bianco et al. manoscritto sottomesso) e di trota fario (Martínez
et al., 1991).
- R. synklepton esculenta
Gli esemplari studiati delle popolazioni matesane di R. synklepton esculenta hanno presentato un corredo diploide di 2n = 26 cromosomi, tutti a due braccia, con
le prime cinque coppie distintamente più grandi delle restanti otto coppie (Fig.
3). Le colorazioni con il Giemsa hanno evidenziato una costrizione secondaria,
probabile sede delle regioni nucleolo-organizzatrici (NORs) sul braccio lungo dei
cromosomi della decima coppia (Fig. 3). Tale locus dei NORs è stato confermato
dalle colorazioni di CMA3/MG (Fig. 3). L’eterocromatina è risultata dislocata soprattutto ai centromeri di quasi tutte le coppie di cromosomi, ed era negativa ad
entrambi i fluorocromi ad eccezione di una tra le coppie più piccole di cromosomi, dove l’eterocromatina centromerica risultava positiva solo al DAPI (Fig. 3).
Era presente, inoltre, una eterocromatina nucleolo associata CMA3 positiva. Tali
caratteristiche cromatiniche sono state rinvenute in esemplari di popolazioni di
Fig. 3. Cariotipi di R. synklepton esculenta colorati con Giemsa (A) e con C-banding+CMA3 (B)+DAPI (C).
36
GIGANTINO ET AL
altre regioni sia della Campania che
extracampane (Schmid, 1978; nostri
dati non pubblicati).
- R. italica
Gli esemplari studiati delle diverse popolazioni di rana appenninica hanno presentato come R. synklepton esculenta un
cariotipo con 2n = 26 cromosomi a due
braccia e con le prime cinque coppie distintamente più grandi delle restanti otto
e i NORs sul braccio lungo della decima
coppia di cromosomi (Fig. 4). D’altra
parte, la maggior parte delle specie del
genere Rana esibisce sia la stessa formula
cromosomica che i NORs sul braccio
lungo del decimo paio di cromosomi
(Schmid, 1978, King, 1990, Odierna et
al., 2000). In contrasto, in Rana, differenze inter-specifiche si osservano a carico della distribuzione e/o composizione
dell’etero-cromatina (Schmid, 1978,
Odierna et al., 2000b, 2001b). Sia in
R. italica che in R. synklepton esculenta
l’eterocromatina è risultata presente sui Fig. 4. Piastra metafasica di R.italica colorata
centromeri di tutti cromosomi ma nella sequenzialmente con Cb-banding+ CMA 3
prima specie era DAPI positiva (Fig. 4) (A)+DAPI (B).
mentre nella seconda era negativa ad entrambi i fluorocromi utilizzati. È da notare, inoltre, che almeno tre delle cinque
coppie di elementi più grandi di R. italica hanno esibito delle bande
paracentromeriche CMA3 positive, che erano assenti in R. synklepton esculenta. Tali
caratteristiche dell’eterocromatina delle popolazioni matesane di rana appenninica
sono state rinvenute in varie altre popolazione della stessa specie (Odierna et al.,
2000b).
- P. muralis e P. sicula
Le due specie sono nettamente distinte da differenze eco-etologiche oltre che
morfologiche. P. muralis è più igrofila e vive in ambienti poco antropizzati. È presente nelle regioni italiane più sentrentrionali e in quelle meridionali a quote generalmente superiori ai mille metri. P. sicula è invece più termofila, presente soprattutto
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
37
nelle regioni meridionali a quote inferiori a quelle di P. muralis, anche se spesso si
osservano in simpatria. A livello morfologico le due specie si distinguono anzitutto
per la livrea ventrale: P. muralis presenta nella zona giugulare e nel ventre una picchiettata in nero, che è meno accentuata nelle femmine e che manca del tutto in P.
sicula (Corti & Lo Cascio, 1999). A dispetto di tali differenze le due specie sono
considerate strettamente imparentate. A conferma della stretta parentela le due specie sono risultate indistingubili in base a test di immuno-complemetarietà dell’albumina (Mayer & Tidemann, 1982) o al pattern di ibridazione di una unità
monometrica della famiglia di DNA satellite taq I di P. sicula (Capriglione et al.,
1991). Anche a livello cromosomico P. sicula e P. muralis sono risultate indistinguibili.
Fig. 5. Piastre metafasiche di P. muralis (A, B e C) e di P. sicula (D, E e F) colorate con Giemsa (A e
D), C-banding+CMA3 (B e E)+DAPI (C e F).
38
GIGANTINO ET AL
Infatti, gli esemplari studiati delle due Podarcis hanno presentato un cariotipo di 2n
= 38 cromosomi di cui 36 sono macrocromosomi telocentrici e due sono
microcromosomi (Fig. 5). Tale formula cromosomica è, d’altra parte, il cariotipo
standard dei lacertidi (Olmo et al., 1993). P. sicula e P. muralis, al pari delle altre
specie congeneriche, hanno esibito i NORs sulle regioni telomeriche di un
macrocromosoma di media lunghezza (Odierna et al., 1987; Olmo et al., 1993). In
P. sicula e P. muralis l’eterocromatina è risultata abbondante e presente sui centromeri
di tutti cromosomi ed era positiva ad entrambi i fluorocromi (Fig. 5). In contrasto,
le analisi microsatellitari sono riuscite a discriminare le due specie. Infatti le reazioni
di PCR condotte con la coppia di
primers (La –2) capaci di isolare loci
microsatellitari dal DNA di L. agilis
(Gullberg et al., 1997) hanno amplificato un locus microsatellitare dal
DNA di P. sicula e P. muralis (Fig. 6).
È da evidenziare che anche le altre due
coppie di primers utilizzate, La-1 e La3, sono state capaci di amplificare loci
microsatellitare negli esemplari di delFig. 6. Bande di DNA microsatellitare di P. muralis le due specie di Podarcis studiate, non
(a) e di P. sicula (b) amplificate mediante PCR con la
evidenziando, tuttavia, differenze tra
coppia di primers La-2.
le due specie (risultati non mostrati).
Tale dato conferma ulteriormente che le regioni adiacenti ai microsatelliti sono altamente conservate in specie filoge-neticamente distanti (Fritz Simmons et al., 1994;
Rico et al., 1996). Infatti la divergenza tra L. agilis e Podarcis su basi immunologiche
è stimata ad almeno trentamilioni di anni fa, (Mayer & Lutz, 1998). Comunque, il
prodotto d’amplificazione di P. muralis risulta più pesante rispetto alla banda
microsatellitare di P. sicula. È da rilevare che nel Matese sono stati rinvenuti almeno
tre siti di sintopia tra i due lacertidi, dove sono stati rinvenuti esemplari con fenotipo
intermedio tra le due specie, facendo supporre una loro origine ibrida (Guarino et
al., questo volume). Per questi presunti ibridi le analisi microsatellitari, in progresso
presso il nostro laboratorio, potranno rivelarsi di notevole aiuto.
- C. chalcides
Tutti gli esemplari di luscengola studiati hanno esibito un cariotipo con 2n =28
cromosomi che possono essere suddivisi in tre gruppi: il primo gruppo comprendete 4 coppie di elementi grandi e tutti metacentrici; il secondo gruppo costituito da 5 coppie di cromosomi di media dimensione, di cui due coppie a due
braccia e tre coppie telocentriche; il restante gruppo comprendente 5 coppie di
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
39
Fig. 7. Piastre metafasiche di C. chalcides colorate con Giemsa (A), C-banding (B) e C-banding+CMA3
(C)+DAPI (D).
piccoli elementi sia a due braccia che telocentrici (Fig. 7). L’eterocromatina ha
mostrato una distribuzione abbastanza peculiare. Negli elementi a due braccia,
infatti, tale materiale genomico era presente nelle regioni paracentromeriche, mentre
era centromerica negli elementi telocentrici (Fig. 7). Sia l’eterocromatina
centromerica che quella paracentromerica risultavano negative ad entrambi i
fluorocromi (Fig. 7). Negli esemplari di luscengole di altre di regioni extra-Matese
sono state rinvenute le stesse caratteristiche dell’eterocromatina (Caputo & Odierna,
1992; Odierna et al., dati non pubblicati).
- Natrix natrix
Gli esemplari studiati delle tre popolazioni matesane di biscia dal collare hanno
esibito il cariotipo tipico della specie (Kobel, 1967) costituito da 34 elementi (16
macrocromosomi a due braccia + 18 microcromosomi) (Fig. 8). Le femmine,
tuttavia, hanno presentano una coppia di elementi eteromorfi, corrispondente
alla coppia di cromosomi sessuali ZW. Il cromosoma W era un elemento
metacentrico di media dimensione (Fig. 8); i NORs sono risultati prossimali ai
telomeri del braccio lungo della prima coppia di cromosomi (Fig. 8).
L’eterocromatina era scarsamente rappresentata, essendo presenti deboli bande
centromeriche in alcune coppie di macrocromosomi e nelle regioni associate al
40
GIGANTINO ET AL
Fig. 8. Cariotipo (A) e piastre metafasiche di N. natrix, colorate con Ag-NOR banding (B), Cbanding (C), e C-banding+CMA3 (D)+DAPI (E). Le frecce vuote indicano i NORs, mentre quelle
piene indicano il cromosoma sessuale W.
nucleolo (Fig. 8). Le colorazioni sequenziali di C-banding+fluorocromi hanno
evidenziato che l’eterocromatina NORs associata era positiva ad entrambi i
fluorocromi, quella centromerica era DAPI positiva, mentre quella telomerica era
CMA3 (Fig. 8). Il cromosoma W è risultato completamente eterocromatico e positivo ad entrambi i fluorocromi (Fig. 8). Tali caratteristiche cromatiniche sia degli
autosomi che dei cromosomi sessuali sono state rinvenute in esemplari di altre
popolazioni italiane di N. natrix (Aprea et al., 2000; Odierna et al., evidenze non
pubblicate).
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
41
Nel secondo gruppo di popolazioni matesane, cioè quelle appartenenti a specie
per le quali le colorazioni di bandeggio sono state per la prima volta applicate
possono essere incluse le popolazioni di C. viridiflavus e di V. aspis.
- C. viridiflavus
L’ esemplare di biacco studiato ha esibito la formula cromosomica nota per la specie
e che caratterizza la sottofamiglia dei Colubrinae (Kobel, 1967; Gorman, 1973;
Olmo, 1986), ovvero ha presentato un cariotipo con 2n = 36 cromosomi, di cui 16
erano macrocromosomi metacentrici e 20 erano microcromosomi (Fig. 9). In seguito alle colorazioni di bandeggio C, bande eterocromatiche sono state osservate ai
centromeri e ai telomeri dei macrocromosomi e sui i microcromosomi (Fig. 9).
Inoltre il C banding ha evidenziato nella femmina di tale colubride un
eteromorfismo a carico di una tra le coppie più piccole di metacentrici, corrispondente alla coppia di cromosomi sessuali ZW che è tipica dei serpenti (Gorman,
1973; Olmo, 1986). Il cromosoma W era omomorfico rispetto allo Z ma differiva
Fig. 9. Piastre metafasiche di C. viridiflavus, colorate con Giemsa (A), C-banding (B), e Cbanding+CMA3 (D)+DAPI (E). Le frecce indicano il cromosoma sessuale W.
42
GIGANTINO ET AL
per essere completamente eterocromatico. L’eterocromatina autosomica è risultata negativa ad entrambi i fluorocromi, mentre l’eterocromatina del cromosoma W
era positiva ad entrambi i fluorocromi (Fig. 9).
- V. aspis
L’esemplare di aspide studiato ha presentato la formula tipica della specie costituita da 2n = 42 cromosomi (22 macro + 20 microcromosomi) (Fig. 8), che differisce
dalle specie congeneriche che presentano 2n = 36 cromosomi (16 macro + 20
microcromosomi) (Gorman, 1973).
L’eterocromatina, che è risultata negativa ad entrambi i fluorocromi, era presente
ai centromeri e ai telomeri della maggior parte dei macrocromosomi e su tutti i
microcromosomi (Fig. 10).
Sia in C. viridiflavus che in V. aspis le analisi di bandeggio allargati ad esemplari
extra-matesani potranno fornire utili informazioni tassonomiche e filogenetiche
Fig. 10. Piastre metafasiche di V. aspis, colorate con Giemsa (A), C-banding (B) e C-banding+CMA3
(C)+DAPI (D).
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
43
delle popolazioni italiane di biacco e di aspide.
Nel terzo gruppo di popolazioni matesane, ovvero quelle che hanno esibito
differenze cromosomiche, possono essere incluse le popolazioni di B. bufo, A.
fragilis, e L. bilineata.
- Bufo bufo
L’esemplare di rospo comune studiato ha presentato un cariotipo costituito da
2n=22 cromosomi tutti a due braccia e con le prime sei coppie di cromosomi
nettamente più grandi delle restanti cinque coppie (Fig. 11). Tale cariotipo è
Fig. 11. Piastre metafasiche dell’esemplare matesano (A, B e C) e calabrese (D, E e F), colorate con
C-banding (A e D) e C-banding+CMA3 (B e E)+DAPI (C e F).
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GIGANTINO ET AL
tipico della specie e d’altra parte si ritrova con poche eccezioni in tutte le specie
della famiglia dei Bufonidae (Schmid, 1978). I NORs erano localizzati ai telomeri
del braccio lungo della sesta coppia di cromosomi (Fig. 11). Anche la localizzazione dei NORs in B. bufo è poco significativa ai fini tassonomici e filogenetici.
Infatti tale localizzazione dei cistroni ribosomiali si osserva in tutte le popolazioni
di rospo comune finora esaminate e in altre specie di Bufo, ad esempio B. viridis
(Schmid, 1978). In contrasto, le colorazioni di bandeggio C+Giemsa e quelle
sequenziali di C banding+fluorocromi hanno rilevato delle peculiarità nella popolazione matesana nei riguardi della distribuzione e composizione della
eterocromatina (Fig. 11). Le colorazioni di bandeggio C infatti evidenziavano nell’esemplare matesano una abbondante eterocromatina centromerica in tutti cromosomi. Erano, inoltre, presenti bande paracentromeriche nella prima, seconda,
quarta e quinta coppia e una eterocromatina NORs associata. Le bande
paracentromeriche e l’eterocromatina NORs associata erano positive sia al DAPI
che alla CMA3. Nelle popolazioni dell’Europa centrale (Schmid, 1978) e in una
popolazione della Calabria non sono state evidenziate bande paracentromeriche
positive ad entrambi i fluorocromi (Fig. 11). Tale pecularietà delle popolazioni
matesane sono interessanti e propongono l’estensione delle analisi ad altre popolazioni sia del Matese che di altre regioni italiane per valutare l’estensione del citotipo
matesano. L’interesse ad estendere tali analisi ad altre popolazioni è d’altra parte
ancora più interessante perché gli estensivi studi cariologici condotti nelle popolazioni di B. viridis non hanno evidenziato differenze nella distribuzione e composizioni dell’eterocromatina (Odierna et al., 1997 - Abstr. 3rd World Congress
Herpetology, Praga 2-10 August 1997: 152; Odierna et al., 2001 - Abstract 14th
International Chromosome Conference, Wurzburg 4-8 September. Chromosome
Research: 74). Inoltre, il differente C- banding pattern esibito dalle popolazioni
giapponesi di rospo comune, dapprima ascritte alla sottospecie japonicus rispetto
alle popolazioni nominali di B. bufo, ha costituito uno dei caratteri per l’elevazione delle popolazioni giapponesi al rango tassonomico specifico (Miura, 1995).
- A. fragilis
Tutti gli esemplari di orbettino studiati hanno presentato un cariotipo di 2n = 44
cromosomi, di cui 10 coppie erano macrocromosomi e 12 coppie erano
microcromosomi. Di questi ultimi la prima e la quinta coppia erano metacentriche,
la decima era subtelocentrica, le restanti coppie erano telocentriche (Fig. 12). Tale
formula cromosomica differisce da quella descritta da Margot (citato in Gorman,
1973) in esemplari dell’Europa centrale. In particolare la decima coppia, che è
subtelocentrica negli esemplari matesani, è, invece, telocentrica in quelli dell’Europa centrale. In altri taxa è stato mostrato che tali differenze si originano a causa
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
45
di differenti livelli di amplificazione dell’eterocromatina centromerica che può
trasformare un elemento telocentrico in subtelocentrico e viceversa (Odierna et
al., 2000a). Nel nostro caso, anche se mancano i dati relativa all’eterocromatina
degli esemplari studiati da Margot, le evidenze del bandeggio C farebbero escludere l’ipotesi dell’amplificazione dell’eterocromatina. Infatti, negli esemplari
matesani la decima coppia subtelocentrica presentava una scarsissima quantità di
eterocromatina (Fig. 12). Pertanto la differenza osservata per tale coppia di cromosomi è probabile che si sia originata per inversione pericentrica. Ciò potrebbe
Fig. 12. Cariotipo (A) e piastre metafasiche di A. fragilis, colorate con Ag-NOR banding (B), Cbanding (C), e C-banding+CMA3 (D)+DAPI (E). Le frecce indicano i NORs.
46
GIGANTINO ET AL
essere rilevante in quanto le differenze dovute a diversi livelli di amplificazione di
eterocromatina sono considerate neutrali, mentre quelle dovute ad inversioni rivestono un rilevante ruolo tassonomico (King, 1993). L’estensione delle analisi su
esemplari di orbettino di altre regioni potranno verificare se la decima coppia
subtelocentrica è ristretta alle popolazioni matesane e saranno anche utili per paragonare la localizzazione dei NORs e la distribuzione e composizione
dell’eterocromatina. Al riguardo, gli esemplari matesani di A. fragilis presentavano
i NORs ai telomeri di due coppie di elementi telocentrici (Fig. 12), mentre
l’eterocromatina era presente su quasi tutti i microcromosomi, ai telomeri e ai
centromeri dei macrocromosomi telocentrici, e ai centromeri dei macrocromosomi
metacentrici (Fig. 12). In alcune coppie di microcromosomi e in almeno tre coppie di macrocromosomi telocentrici l’etercromatina sia centromerica che telomerica
era positiva al DAPI e alla CMA3 (Fig. 12).
- Lacerta bilineata
Di notevoli interesse sono risultate le analisi cromosomiche condotte nelle popolazioni matesane del ramarro occidentale, L. bilineata. Gli esemplari di ramarro
occidentale di Gallo, di Civitella Licinia, di Tortora e di Valle Agricola hanno
presentato un cariotipo di 2n=38 cromosomi, con 36 macrocromosomi telocentrici
+ due microcromosomi (Fig. 13). Le femmine presentavano una coppia
eteromorfica, corrispondente alla coppia di cromosomi sessuali ZW. Il cromosoma W è risultato completamente eterocromatico con una dimensione intermedia
tra quelle del più piccolo degli autosomi e delle coppie di microcromosomi (Fig.
13). Gli autosomi presentavano una eterocromatina centromerica che era positiva
sia al DAPI che alla CMA3. Tali caratteristiche a carico degli autosomi e dei cromosomi sessuali ZW sono stati rinvenuti sia in altre popolazioni meridionali
(Serino, Avellino; Roscigno, Salerno) che in popolazioni francesi e spagnole (Olmo
et al., 1993; Odierna et al., dati non pubblicati) (Fig. 13). Gli esemplari di ramarro
occidentale di altre due popolazioni di Petraroja differivano sia dagli esemplari
matesani che da quelli extra matesani per presentare un W dalle dimensioni di un
microcromosoma (Fig. 13). Per comprendere le implicazioni tassonomiche e
filogenetiche delle differenze nella morfologia del cromosoma W delle popolazioni di Petraroja è necessario discutere le differenze osservate alla luce dell’origine ed
evoluzione dei cromosomi sessuali nei lacertidi.
Sulla base della teoria generale dell’origine dei cromosomi sessuali (Ohno, 1967),
la prima tappa di tale processo consiste nell’insorgere di geni che determinano il
sesso in uno dei due omologhi di una coppia di cromosomi. La tappa successiva
prevede l’inibizione del crossing over tra i cromosomi Z e W. L’abolizione del
crossing over determina il differenziamento dei cromosomi sessuali tramite una
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
47
Fig. 13. Piastre metafasiche di L. bilineata di Pietraroja (A, B, C e D) e di Letino ( E, F, G e H),
colorate con Giemsa (A e E), C-banding (B e F), e C-banding+CMA3 (C e G)+DAPI (D e H).Le frecce
indicano il cromosoma sessuale W. Notare che il W ha le dimensioni di un microcrosoma nell’esemplare di Petraroja, mentre nell’esemplare di Letino il W ha una dimensione intermedia tra il più piccolo
degli autonomi e la coppia di microcromosomi.
48
GIGANTINO ET AL
evoluzione separata e il decadimento della funzione dei geni nel cromosoma W.
Nei lacertidi l’abolizione del crossing over è raggiunta sia mediante riarrangiamenti
strutturali che tramite eterocromatinizzazione (Olmo et al., 1993, Odierna et al.,
2001a). Nel primo caso, cioè inibizione del crossing over tramite riarrangiamenti
strutturali, nei lacertidi riguarda la fusione tra il cromosoma W con un autosoma,
originando un sistema cromosomico sessuale del tipo Z1Z2W. La fusione può
essere sia centrica, cioè centromero-centromero, come si è osservato nel gruppo di
specie di L. bonnali (Odierna et al., 1996) oppure tandem, cioè telomerocentromero, come si è osservato in L. vivipara (Odierna et al., 1993; 2001a).
Successivamente il cromosoma W va incontro ad altri riarrangiamenti, quali ad
esempio eterocromatinizzazione, inversioni, delezioni.
Nel secondo caso, le regioni adiacenti a quella in cui sono insorti i geni che determinano il sesso vanno incontro ad eterocromatinizzazione; segue, quindi, la sua
estensione lungo tutto il cromosoma W e una progressiva delezione del cromosoma W, che alla fine del processo risulta grande quanto un microcromosoma. Queste tappe evolutive sono state documentate in vari gruppi di specie di lacertidi,
incluso il Lacerta viridis group, che comprende L. bilineata (Olmo et al. 2001a,
Odierna et al., 1993). In quest’ultimo gruppo di specie, infatti, il cromosoma W
è eterocromatico e grande circa quanto l’ultima coppia di autosomi in L. schreiberi,
L. agilis e L. bilineata, o quanto la coppia dei microcromosomi come in L. viridis.
Su tale base il microcromosoma W delle due popolazioni di ramarro occidentale
di Petraroja potrebbe essere derivato dal cromosoma W di L. bilineata per ulteriore progressiva delezione. Tuttavia è da considerare che L. viridis presenta il cromosoma W grande quanto la coppia di microcromosomi, e che le popolazioni di tale
specie sono presenti nell’Italia nord-orientale oltre che nella penisola balcanica, e
che non è perfettamente noto lo stato tassonomico delle popolazioni italiane,
specialmente di quelle sud-orientali. Pertanto non si può escludere che le popolazioni di ramarro di Petraroja potrebbero essere affini a L. viridis. L’ultima ipotesi,
inoltre, potrebbe trovare una giustificazione anche su basi paleobiogeografiche. Si
può, infatti, ipotizzare che durante le glaciazioni pleistoceniche le popolazioni di
L. viridis abbiano trovato rifugio nelle regioni meridionali della penisola italiana e
in quella balcanica. Al termine delle glaciazioni le popolazioni balcaniche avrebbero colonizzato le regioni nord-orientali europee, mentre quelle italiane sarebbero state ristrette alle regioni meridionali dal sopravanzare nella nostra penisola
delle popolazioni di L. bilineata provenienti dalle regioni meridionali francesi. In
alternativa, considerato che nell’ultima gliaciazione del Würmiano (18.000 anni
fa) le foci del Po, a causa dell’abbassamento delle acque dell’Adriatico, erano all’altezza dell’attuale città di Pescara (Bianco, 1990), le popolazioni balcaniche
di L. viridis potrebbero aver colonizzato la costa adriatica durante quel periodo e
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
49
quindi le popolazioni di Petraroja potrebbero appartenere al ramarro orientale,
L. viridis.
Allo scopo di valutare le differenti ipotesi, nelle popolazioni studiate di ramarro
sono state intraprese le analisi microsatellitari, beneficiando dei primers capaci di
amplificare loci microsatellitari dal DNA di L. agilis (Gullberg et al., 1997). Inoltre
per tale tipo di studio le analisi sono state estese al DNA di altre popolazioni campane e di una popolazione francese di L. bilineata, cioè della terra tipica della specie.
In particolare sono stati saggiati tre coppie di primers per tre loci microsatellitari
di L. agilis, La-1, La-2, e La-3. Le tre coppie di primers hanno avuto successo nel-
Fig. 14. Bande microsatellitari di esemplari di differenti popolazioni di L. bilineata amplificate con le
coppie di primers LA-1 (A) e La-3 (B). In (C) sono riportate le bande microsatellitari in gel denaturante
di acrilamide, colorate con Silver Staining.
1 = Lago Letino; 2 e 3 = Loc. Filette, Pietraroja; 4 = Fontana Nicandro, Valle Agricola; 5 = Strada
Pietraroja-Cusano Mutri, Pietraroja; 6 e 7 = Castel San Vincenzo, Isernia; 8 = Rofrano, Cilento,
Salerno; 9 = Francia; 10 = Serino, Avellino. M = marker 100 bp.
50
GIGANTINO ET AL
l’amplificare microsatelliti dal DNA di tutti gli esemplari di ramarro studiati. La
coppia di primers La-1 e La-3 hanno prodotto una sola banda che ha migrato alla
stessa altezza in tutti gli esemplari indipendentemente dall’origine (Fig. 14). Anche
la successiva analisi nel gel d’acrilamide denaturante eseguita per la coppia di primers
La-3 non è risultata diagnostica, a causa dell’elevato polimorfismo intrapopolazionale.
Più interessanti sono risultati le evidenze con la coppia di primers La-2 (Fig. 15). In
accordo con i dati cromosomici, i risultati delle analisi microsatellitari con tale coppia di primers evidenziano che gli esemplari di ramarro di Petraroja differiscono da
quelli di Gallo, Valle Agricola e di Civitella Licinia e dalle popolazioni extramatesane
di ramarro (Fig. 15). Infatti, dal DNA degli esemplari delle ultime popolazioni la
coppia di primers La-2 ha amplificato un solo locus microsatellitare di circa 160 bp,
mentre dal DNA degli esemplari delle due popolazioni di Petraroja oltre alla banda
Fig. 15. Bande microsatellitari di esemplari di differenti popolazioni di L. bilineata amplificate con le
coppie di primers LA-2 (A). In (B) è riportato il gel d’agarosio del prodotto di riamplificazione del
DNA dell’esemplare di Lago di Letino recuperato dal gel in (A) e in (C) è riportata la relativa sequenza
dove è stata sottolineata il dinucleotide AT ripetuto 16 volte. 1= Lago Letino; 2 e 3 = Loc. Filette,
Pietraroja; 4 = Fontana Nicandro, Valle Agricola; 5 = Strada Pietraroja-Cusano Mutri, Pietraroja; 6 e 7
= Castel San Vincenzo, Isernia; 8 = Rofrano, Cilento, Salerno; 9 – Francia; 10 = Serino, Avellino. M =
marker 100 bp.
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
51
microsatelliatre di 160 bp erano presenti altre due bande, una di circa 170 bp e
l’altra di circa 150 bp (Fig. 15). La banda microsatellitare di 170 bp è stata isolata e
caratterizzata la sequenza. Questa è risultata lunga 175 coppie basi, contenente un
motivo microsatellitare perfetto del dinucleotide AT ripetuto 16 volte (Fig. 15).
Il confronto del pattern microsatellitare La-2 degli esemplari matesani con quelli
francesi evidenziano, in accordo con i dati cromosomici, che gli esemplari di Gallo-Cusano Mutri-Civitella Licinia e delle altre popolazioni campane sono affini
agli esemplari francesi, e pertanto appartenenti a L. bilineata (Fig. 15). In contrasto, lo stato tassonomico degli esemplari di ramarro di Pietraroja è ancora da definire. Al riguardo, l’estensione delle analisi microsatellitari su esemplari di ramarro
della fascia adriatica e di L. viridis dei Balcani, in progresso presso il nostro laboratorio, potranno dare rilevanti informazioni.
Conclusioni
In conclusione le indagini cromosomiche e molecolari condotte sull’ittiofauna
ed erpetofauna matesana hanno fornito rilevanti informazioni ai fini tassonomici e
filogenetici. In particolare, è stato evidenziato che le popolazioni di G. aculeatus,
S. erytrophthalmus, S. trutta, R. italica, R. synklepton esculenta, C. chalcides, N.
natrix, P. muralis e P. sicula presentano caratteristiche cromosomiche simili a quelle delle popolazioni presenti nelle altri regioni italiani. Per le popolazioni di altri
due taxa, C. viridiflavus e V. aspis è stata per la prima volta caratterizzata
citologicamente l’eterocromatina definendone i pattern distribuzionali lungo i
cromosomi. Tali pattern potranno essere utilizzati per analisi comparative con
esemplari dei due taxa di altre regioni. Infine le popolazioni di tre taxa, B. bufo, A.
fragilis, e L. bilineata possono rappresentare degli endemismi campani, essendo
state rilevate in esse delle peculiarità cromatiniche. Va evidenziato che le pecularità
rinvenute in B. bufo, A. fragilis e L. bilineata riguardano nelle prime due, rispettivamente, la distribuzione dell’eterocromatina e una inversione pericentrica, mentre nelle popolazioni del ramarro occidentale le differenze osservate riguardano
modificazioni a carico del cromosoma W. Le variazioni a carico del cromosoma W
potrebbero aver avuto un ruolo rilevante nel differenziamento delle popolazioni di
bilineata. Sono noti infatti parecchi casi di preferenziali fissazioni di cromosomi
sessuali modificati (McKee et al., 1992; 1993; 2000). Inoltre è stato osservato che
le alterazioni di uno dei due cromosomi sessuali potrebbero avere un impatto maggiore sulla fertilità degli ibridi rispetto a quello che ci si aspetterebbe (Hewitt et al.,
1989; Coyne & Orr, 1989a; McKee et al., 1992; King, 1993). Importanti potrebbero anche essere le variazioni nella quantità e composizione dell’eterocromatina dei
cromosomi (come quelle che si osservano nel sistema L.bilineata-L.viridis), poiché è
noto il loro coinvolgimento nell’appaiamento e nella segregazione meiotica di
52
GIGANTINO ET AL
questi cromosomi (King, 1993; McKee et al., 2000).
Meno facile da comprendere è l’importanza che potrebbero avere avuto le variazioni nell’eterocromatina in B.bufo, e l’inversione pericentrica in A. fragilis. Le
variazioni interspecifiche a carico dell’eterocromatina e dei DNA altamente ripetuti ad essa associati e le inversioni sono frequenti (Mengden & Stock, 1980;
Olmo et al., 1986; Capriglione et al., 1991; Yonenaga-Yassuda et al., 1996).
Inoltre in vari eucarioti sono noti casi in cui l’eterocromatina potrebbe influenzare la variabilità genetica, essendo in grado di attivare o sopprimere stabilmente
l’espressione di alcuni geni (King, 1993; Redi et al., 2001). Mentre sono noti casi
in cui le uniche differenze osservate tra due specie strettamente correlate riguardano una o più inversioni pericentriche (King, 1993). Tuttavia non c’è evidenza
convincente per una ridotta fertilità dell’ibrido tra citotipi aventi una eterozigosità
stutturale cromosomica derivata o per inversione o per una diversa quantità o
distribuzione dell’eterocromatina (John, 1988). La variazioni nell’eterocromatina
e nei DNA altamente ripetuti ad essa associati, potrebbero svolgere invece un
ruolo importante per favorire l’insorgere o la fissazione di altre mutazioni
(Charlesworth et al., 1994; Capriglione et al., 1998; Redi et al., 2001). Pertanto,
la rilevante variabilità inter-popolazionale che si nota nella quantità e composizione dell’eterocromatina in B. bufo, e il riarrangiamento strutturale rilevato in A.
fragilis sarebbe indizio di un’attiva propensione di queste specie alla variabilità
cromosomica, che a sua volta sarebbe importante come meccanismo per rafforzare
la barriera all’ibridazione tra specie incipienti.
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare il Prof. M. Milone e il Dott. D. Fulgione del Dipartimento
di Zoologia dell’Università degli Studi di Napoli Federico II per aver concesso l’uso
del materiale e della strumentazione per l’esecuzione del gel denaturante di acrilamide
e per i consigli e l’assistenza fornita nell’esecuzione dell’analisi microsatellitare.
Lavoro finanziato dalla Regione Campania. Esemplari catturati con autorizzazione del 1/06/2000 n. SCN/2D/2000/9213 del Ministero dell’Ambiente.
Riassunto
Nel presente lavoro sono riportati i risultati di una analisi cromosomica condotta con metodi di colorazioni convenzionali e di bandeggio (C-banding, Ag-NOR-banding, Cromomicina
A3/verde metile, colorazioni sequenziali di bandeggio C+DAPI+CMA3) in tre pesci d’acqua dolce, Gasterosteus aculeatus, Scardinius erythrophthalmus e Salmo trutta, e in
numerose specie di Anfibi e Rettili presenti nel Parco Regionale del Matese (Rana
synklepton esculenta, R. italica, Bufo bufo, Podarcis sicula, P. muralis, Lacerta bilineata,
Chalcides chalcides, Anguis fragilis, Natrix natrix, Coluber viridiflavus e Viper aspis). I
risultati ottenuti sono stati comparati con i dati bibliografici di popolazioni di corrispondenti taxa presenti in altre regioni. Il confronto ha evidenziato nel Parco la presenza di: (i)
popolazioni di taxa in cui non sono state rinvenute differenze cromosomiche rispetto a
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
53
popolazioni di corrispondenti taxa di altre regioni (G. aculeatus, S. erythrophthalmus, S.
trutta, R. synklepton esculenta, R. italica, P. sicula, P. muralis, C. chalcides, N. natrix; (ii)
popolazioni di specie, C. viridiflavus e V. aspis, in cui le colorazioni di bandeggio sono
state applicate per la prima volta e pertanto il confronto tra le popolazioni all’interno e
all’esterno del Parco è stato limitato solo al numero e morfologia dei cromosomi; (iii)
infine, popolazioni di taxa (B. bufo, A. fragilis e L. bilineata) in cui sono state rinvenute
distintive caratteristiche cromosomiche e che pertanto potrebbero costituire interessanti
endemismi nel Parco Regionale del Matese.
Bibliografia
Aprea G., Odierna G., Capriglione T., Caputo V., Guarino F.M., 2000 - Analisi
cromosomica in tre specie del genere Natrix Duméril (Reptila, Squamata): Mus.
Reg. Sci. Nat. Torino, 1999: 419-424.
Bianco P. G., 1990 - Potential role of the palaeohistory of the Mediterranean and Paratethys
basins on the early dispersal of Euro-Mediterranean freshwater fishes. Ichthyology
Exploration of Freshwaters 1(2): 167-184.
Capriglione T., Cardone A., Odierna G., Olmo E., 1991 - Evolution of a centromeric
satellite DNA and phylogeny of lacertid lizards. Comp., Biochem. Physiol., 100B:
641-645.
Capriglione T., De Santo M.G., Morescalchi, Odierna G., Olmo E., 1998 - Organization
of an alphoid-like satellite DNA sequence in the genome of the lacertid lizard, Lacerta
graeca. J. Mol. Evol., 46: 240-244.
Caputo V., Odierna G., 1992 - Karyological diffrentiation between two forms of the
Chacides chalcides . (Scincidae). Amphibia-Reptilia. 13: 193 – 196.
Cataudella S., Sola L., Accame Muratori R., Capanna E., 1977 - The chromosomes of
11 species of cyprinidae and one cobitidae from Italy, with some remarks on the
problem of the polyploidy in the cypriniformes. Genetica, 47: 161-171.
Charlesworth B., Sniegowski P., Stephan W., 1994 - The evolutionary dynamics of
repetitive DNA in eukaryotes. Nature, 371: 215-220.
Chen T.R., Reisman H.M., 1970 - A comparative chromosome study of the North
American species of stickleback (Teleostei, Gasteroidae). Cytogenetics, 9: 331-332.
Corti C., Lo Cascio P, 1999 - I lacertidi italiani. L’Epos, Palermo, pp. 1-87
Coyne J.A., Orr H.A., 1989 - Patterns of speciation in Drosophila. Evolution, 43: 362381.
Fritz Simmons N.N., Moritz C., Moore S.S., 1995 - Conservation and dynamics of
microsatellite loci over 300 million years of marine turtle evolution. Mol. Biol. Evol.,
12: 432-440.
Goldstein D.B., Schlotterer C., 1999 - Microsatellites: Evolution and Applications.
Gorman G.C., 1973 - The chromosomes of the Reptilia, a cytotaxonomic interpretation.
In: A.B. Chiarelli, E. Capanna (eds.), Cytotaxonomy and vertebrate evolution.
Academic Press, London, New York, pp. 349-424.
Gullberg A., Tegelstrom H., Olsson M., 1997 - Microsatellites in the sand lizard (Lacerta
agilis): description, variation, inheritance, and applicability. Biochem. Genet., 35:
281-295.
Hennig W., 1999 - Heterochromatin. Chromosoma, 108: 1-9.
54
GIGANTINO ET AL
Hewitt G.M., Mason P., Nicols R.A., 1989 - Sperme precedence and homogamy
across a hybrid zone in the alpine grasshopper Pedisma pedestris. Heredity, 62:
343-353.
Howell W. M., Black D. A., 1980 - Controlled silver staining of nucleolus organizer
regions with a protective colloidal developer: 1-step method. Experientia, 36, 10141015.
John B., 1988 - The biology of heterochromatin. In: R. S. Verma (ed.) Heterochromatin.
Cambridge University Press, Cambridge, pp. 1-147.
King M., 1990 - Amphibia. In: B. John (ed), Animal Cytogenitcs, Vol 4, Choordata 2,
Gebrüder Borntraeger, Berlin, Stuttgart, pp vi+241.
King M., 1993 - Species evolution: the role of chromosome change. Cambridge, Univeristy
Press, pp. xxi+336.
Kobel H.R., 1967 - Morphometrische karyotypanalyse eineger Schlangenarten. Genetica, 38: 1-13.
Martínez P., Viñas A., Bouza C., Arias J., Amaro R., Sánchez L., 1991 - Cytogenitical
characterization of hatchery stocks and natural populations of sea and brown trout
from northwestern Spain. Heredity, 66: 9-17.
Mayer W., Tidemann F., 1982 - Chemotaxonomical investigation in the collective genus
Lacerta (Sauria, Lacertidae) by means of proteinelectrophoresis. Amphibia-Reptilia,
2: 349-355.
McKee B.D., Habera L., Verna J.L., 1992 - Evidence that the intergenic spacer of
Drosophila melanogaster rRNA genes function as X-Y pairing sites in male meiosis,
and a general model for achiasmate pairing. Genetics, 132: 529- 544.
McKee B. D., Lumsden S. E., Das S., 1993 - The distribution of male meiotic pairing
sites on chromosome 2 of Drosophila melanogaster: meiotic pairing and segregation
of 2Y transpositions. Chromosoma, 102: 180- 194.
McKee B.D., Hong C.S., Das S., 2000 - On the roles of heterochromatin and euchromatin
in meiosis in drosophila: mapping chromosomal pairing sites and testing candidate
mutations for effects on X-Y nondisjunction and meiotic drive in male meiosis. Genetica, 109: 77-93.
Mengden G.A, Stock D., 1980 - Chromosomal evolution in serpentes: a comparison of
G and C chromosome banding pattern of some colubrid and boid genera.
Chromosoma, 79: 52-61.
Miura I., 1995 - Two differentiated groups of the Japanese toad, Bufo japonicus iaponicus,
demonstrated by C-banding analysis of chromosomes. Caryologia, 48: 123-136.
Nygren A., Nilsson B., Jahnke M., 1971 - Cytological studies in Salmo trutta and Salmo
alpinus. Hereditas, 67: 259-268.
Odierna G., Olmo E., Cobror O., 1987 - Taxonomic implications of NOR localization
in lacertid lizards. Amphibia-Reptilia, 8: 373-382.
Odierna G., Aprea G., Arribas O. J., Capriglione T., Caputo V., Olmo E., 1996 - The
Karyology of the Iberian rock lizards. Herpetologica, 52: 542-550.
Odierna G., Andreone F., Aprea G., Arribas O., Capriglione T., Vences M., 2000a Cytological and molecular analysis in the rare discoglossid species, Alytes muletensis
(Sanchiz & Adrover, 1977), and its bearing on archaeobatrachian phylogeny.
Chromosome Research, 8: 435-442.
I cromosomi dei Vertebrati ectotermi del Matese
55
Odierna G., Aprea G., Arribas O., Capriglione T., 2000b - A chromosomal study of
the Pyrenean endemic brown frog species, Rana pyrenaica Serra-Cobo, 1993, and
various italian populations of R. dalmatina and R. italica. Folia, 49 (4): 75-84.
Odierna G., Heulin B. , Guillaume C.P., Vogrin N., Aprea G , Capriglione T., SurgetGroba Y, Kupriyanova LMS , 2001 - Further analysis of the karyological variations
existing within and between oviparous and viviparous forms of Lacerta (Zootoca)
vivipara: evolutionary and biogeographic implications. Ecography, 24: 332-340.
Odierna G., Vences M., Aprea G., Lötters S., Andreone F., 2001b - A karyological
phylogeny of Malagasy poison frogs (Amphibia: Ranidae: Mantella). Zool. Sci., 18:
505-514.
Ohno S., 1967 - Sex chromosomes and sex-linked genes. Springer. Berlin, Heidelber,
New York.
Olmo E., 1986 - A. Reptilia. In: B. Johm (ed.), Animal Cytogenetics, 4 Chordata 3.
Gebrueder Borntraeger, Berlin, Stuttgart, pp. IV +100.
Olmo E., Odierna G., Capriglione T., 1993 - The karyology of Mediterranean lacertid
lizards. In: E.D Valakos, W. Böhme , V. Perez-Mellado, , P. Maragou, (eds.). Lacertids
of the Mediterranean region. Hellenic Zoological Society, Athens, pp. 61-84.
Redi C.A., Garagna S., Zacharias H., Zuccotti M., Capanna E., 2001 - The other
chromatin. Chromosoma, 110: 136-147.
Rico C., Rico I., Hewitt G., 1996 - 470 million years of conservation of microsatellite
loci among fish species. Proc.R.Soc.Lond., B, 263: 549-557.
Sahar E., Latt S.A, 1980 - Energy Transfer and binding competition between dyes used
to enhance staining differentiation in metaphase chromosomes. Chromosoma, 79:
1-28.
Schmid M., 1978 - Chromosome banding in Amphibia. I. Constitutive heterochromatin
and nucleolus organizer regions in Bufo and Hyla. Chromosoma, 66: 361-388.
Sumner A. T., 1972 - A simple technique for demonstrating centromeric
heterochromatin. Experimental Cell Research, 75: 304-306.
Yanenaga-Yassuda Y., Mori L., Chu T.h., Rodriques M.T., 1996 - Chromosomal banding
patterns in the eyelid-less microteiid radation: Procellasauurinus and Vanzosaura (Squamata, Gymnophthalmidae). Cytogenet. Cell Genet., 74: 203-210.