Spettroscopia di Risonanza
Magnetica Nucleare (NMR)
UnicamAltisonante
incontri
Misterioso
Inquietante
Camerino 25-26 Settembre 2003
 Nucleare
 Magnetica
“Tutti gli anni, verso il mese di
marzo, una famiglia di zingari
cenciosi piantava la tenda vicino al
villaggio, e con grande frastuono di
zufoli e tamburi faceva conoscere le
nuove invenzioni.
Prima portarono la CALAMITA.”
Gabriel Garcia Marquez
Cent’anni di solitudine
Cronologia NMR

1945
Prima osservazione di un segnale NMR
Bloch e coll. Stanford Un. (1H in H2O)
Purcell e coll. Harvard Un. (1H in paraffina) (nobel 1952)





1950
1961
1970
1976
1980
Scoperta del Chemical Shift
Primo spettrometro commerciale CW
Primo spettrometro commerciale FT
Primi esperimenti 2D ( Ernst 1991 Nobel)
Spettrometri NMR di II generazione
L’origine fisica dell’NMR
 Pauli nel 1924 introdusse l’idea dello spin nucleare
 Protoni e neutroni possiedono un momento angolare di spin con
relativo numero quantico di spin I=1/2
 In nuclei diversi da 1H il numero quantico di spin può essere
intero, semiintero o nullo; in particolare:
numero di massa dispari
numero di massa pari e n. atomico pari
numero di massa pari e n. atomico dispari
spin semiintero
spin nullo
spin intero
 L’NMR dipende dall’esistenza dello spin nucleare quindi nuclei
con I=0 sono magneticamente inattivi.
Spin e abbondanza nucleare
Isotopo
Spin I
%
1H
1/2
99.98
2H
1
0.016
12C
0
98.89
13C
1/2
1.11
14N
1
99.64
15N
1/2
0.36
16O
0
99.76
17O
5/2
0.037
31P
1/2
100
Momenti magnetici nucleari
 I nuclei hanno spin e sono carichi +
ogni particella carica in moto produce un campo
magnetico.
 ogni nucleo con un momento angolare possiede
quindi un momento magnetico proporzionale.
m=gP
<< Le cose hanno vita propria >>
proclamava lo zingaro con aspro accento,
<< si tratta solo di risvegliargli l’anima.>>
2I+1 orientazioni possibili
g
g1
DE= g h Ho
E= g h IzHo
Diagramma
dell’energia
N-
-/N+=e-DE/kT
NDE=hn
DE= g h Ho
Livelli degeneri
Ho
N+
n=gHo
n= g H0
Risonanza?
H0
Frequenza di
precessione di
Larmor
Irradiando il campione con delle
opportune radiofrequenze e misurandone
l’assorbimento potremmo ottenere lo
“spettro” del composto in esame.
1H
13C
31P
15N
MHz
Chemical shift
 Gli elettroni di un atomo inducono
un piccolo campo magnetico che si
oppone a quello principale
 Il campo magnetico sperimentato
dal nucleo è generalmente minore del
campo effettivo di un fattore s
H = Ho (1- s)
n=gH
Nuclei dello stesso atomo assorbono
a frequenze leggermente diverse a
causa del loro “intorno chimico”
Diagramma di correlazione 1H NMR
“Molteplicità” dei segnali NMR
 Ad ogni protone (carbonio, azoto …) chimicamente diverso
corrisponde un segnale di diversa frequenza.
 La “forma” del segnale in uno spettro NMR spesso non è
un semplice picco di assorbimento ma può assumere
aspetti molto diversi.
Sigoletto
Doppietto
1:1
Tripletto
1:2:1
Quartetto
1:3:3:1
Quintetto
1:4:6:4:1
La molteplicità dei segnali è dovuta ai “vicini di casa”
HaHb
|
|
-C C|
|
Ho + d
Ho
—
b
a
b
Ho - d
n = g H0
Doppietto
1:1
HaHb
|
|
-C C-Hc
Ho + d
—
|
|
b c
a
Ho
2 Ho
Ho - d
Tripletto
1:2:1
Tempi di rilassamento
Mz
Tempo
Mxy
Mz=M0(1-e-t/T1)
Le Risonanze Magnetiche




NMR in soluzione (ad alta risoluzione)
NMR allo stato solido (CP-MAS)
NMR in vivo
Risonanza magnetica ( imaging)
NMR in soluzione
NMR dei chimici
I composti vanno sciolti in un
solvente deuterato
Massima omogeneità del campo
magnetico
Spettri affilati poiché il rapido moto
casuale delle molecole media a
zero le interazioni dipolari
anisotropiche
computer
controlli
electronici
magnete a
superconduzione
Tubo NMR
Solvente
deuterato
 spin
 lock
FT
 shim
Tempo
Sequenza d’impulsi
Frequenza
FT
CH2CH3
1H-NMR
{C8H10}
13C-NMR
2D NMR
NMR allo stato solido (MAS)

Nei solidi i nuclei sono costretti in una
determinata posizione quindi le interazioni dipolari
anisotropiche (dipendenti dall’orientazione) non si
annullano e gli spettri sono molto larghi.
• E.R. Andrew e I.J. Lowe dimostrarono che le
interazioni dipolari anisotropiche si annullano
se il campione è posto in rapida rotazione attorno
ad un asse orientato a 54.74° rispetto al campo
magnetico principale (Magic Angle Spinning MAS)
I campioni vengono polverizzati finemente, impaccati
nel rotore e quindi messi in rotazione ad una velocità
compresa tra 1 e 35 KHz
Limitata utilità nei nuclei come 1H
e 19F poiché gli accoppiamenti
dipolari superano i 100 KHz.
MRS in vivo e MRI (imaging)
 Sono due tecniche molto conosciute per il loro utilizzo in
campo biomedico ma in realtà possono essere usate in
moltissimi campi scientifici.
 I principi fisici fondamentali sono gli stessi dell’NMR in
soluzione o MAS ma le tecniche, la strumentazione e i dati
ottenuti da questi esperimenti sono molto differenti.
 La prima differenza è la scomparsa del
termine NUCLEARE dal nome delle
tecniche.
 Le differenze fondamentali derivano
dalle diversità dei “campioni” da analizzare:
- omogenei nei primi due casi
- assolutamente eterogenei nella MR
Gradiente
Ho
n = g H0
Frequenza
La frequenza di risonanza diventa
dipendente dallo spazio.
Vista della sezione orizzontale e verticale di un
tubo NMR riempito di acqua e con una barretta
di plastica al centro
XY
YZ
Come si ottengono
queste immagini?
Immagini per
retroproiezione

MR imaging
MRS in vivo
Tra le tecnologie emergenti della Medicina di
laboratorio, la spettroscopia di risonanza magnetica
in vivo (MRS) è particolarmente innovativa perché
consente di esplorare direttamente sul paziente e
in modo non invasivo la concentrazione
intracellulare di alcuni intermedi metabolici e la
funzionalità di diverse vie metaboliche.
Invece di ottenere immagini dettagliate
di tessuti con la MRS possiamo ottenere
gli spettri di composti biochimici presenti
all’interno di questi tessuti!
Con la spettroscopia RM del fosforo (31P-MRS):
• ATP
• fosfato inorganico (Pi)
• fosfocreatina (PCr)
• intermedi metabolici fosforilati (PME e PDE)
• concentrazione di Mg2+
• pH intracellulare
Si valuta la funzionalità di:
fosforilazione ossidativa,
glicogenonolisi, glicolisi …..
Con la spettroscopia RM del protone (1H-MRS):
• n-acetilaspartato (NAA)
• colina (Cho)
• creatina + fosfocreatina (Cr)
• glutammato e glutammina (Glx)
•mio-inositolo (m-I) e acido lattico (LA)
Si valuta la funzionalità di:
sistema glutamminergico ,metabolismo
energetico, la osmoregolazione del
SNC …….
In vivo 31P NMR di Corynebacterium glutamicum
.. José Arcadio Buendia … pensò che era
possibile servirsi di quella invenzione
inutile per sviscerare l’oro dalla terra.
Lo zingaro, che era un uomo onesto, lo
prevenne: << Per quello non serve >>
197Au