La diagnostica mediante
NMR
Raffaele Lamanna CR Trisaia – Biotec-Agro
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La NMR è una tecnica spettroscopica in cui le transizioni
osservate sono quelle fra i livelli energetici creati per effetto
Zeeman quando il campione è sottoposto ad un forte campo
magnetico.
Effetto Zeeman: In presenza di un campo magnetico esterno
la degenerazione sui livelli si spin è rimossa e la
magnetizzazione nucleare è diversa da zero.
Em    Bo mI
Mz
Condizione di risonanza
 o  E
 o   Bo
mI = ± 1
1H
13C
1,4 T 60 MHz
1T
10.7 MHz
9.4 T 400 MHz
Nella moderna NMR l’insieme di spin è eccitato mediante
impulsi a r.f. e il segnale rivelato è nel dominio del tempo.
Solo dopo una Trasformata di Fourier è possibile ottenere lo
spettro in frequenza.
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Esistono essenzialmente quattro tipi di
interazione:
• Zeeman e chemical sheilding
• Interazione indiretta mediata dagli
elettroni.
• Interazione diretta (dipolare)
• Interazione di quadrupolo
Le interazioni fra gli spin nucleare hanno intensità
dell’ordine di KT. Ciò ci permette di modificare tali
interazioni mediante delle perturbazioni esterne
facendo in modo da evidenziare in un determinato
esperimento solo alcuni tipi di interazione piuttosto
che altri.
La potenza è la versatilità dell’NMR sta proprio in
questa capacità.
3
Differenze fra solidi, liquidi e semisolidi (soft matter)
• I liquidi sono caratterizzati da moti browniani traslazionali e
rotazionali veloci che mediano tutte le anisotropie delle interazioni.
•La conseguenza è che lo spettro NMR è composto da righe
generalmente strette e ben risolte.
• In un solido gli atomi assumomo posizioni fisse così piccole
differenze nelle loro posizioni ed orientazioni o nell’ambiente che li
circonda modulano le interazioni fra nuclei che risultano eseere così
leggermente diverse da atomo ad atomo.
•Questa distribuzione anisotropa delle interazioni induce una
distribuzione delle frequenze NMR, che essendo molto vicine le
une alle altre si sovrappongono dando origine ad una riga molto
larga.
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Chemical fingerprinting
Informazioni Strutturali
• Struttura stereochimica di molecole in
soluzione
Informazioni Dinamiche
• Moti intramolecolari
• Rotazioni di gruppi chimici
• Moti intermolecolari
• Processi diffusivi
Informazioni Chimiche
• Analisi qualitativa e quantitativa di miscele
• Reazioni chimiche : cinetica e rivelazione di
specie transienti
• Transizioni di fase
5
Spettro 1H NMR a 600 MHz di succo
di pomodoro
• In uno spettro 1H di succo di pomodoro ci sono
diverse centinaia di righe di cui alcune sovrapposte.
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Spettro Homonuclear 2D J-resolved di
succo di pomodoro
L’analisi dello spettro 2D J-resolved permette di
assegnare le componenti dei multipletti e permette di
misurare le costanti di accoppiamento 1H-1H J7
couplings.
Spettro 1H-1H COSY di succo di
pomodoro
Glu
Asp
Ala
Gln
Asn
Thr
8
Spettro 1H-1H TOCSY di succo di
pomodoro
ppm
b-glucose
4.8
5.0
5.2
a-glucose
5.4
5.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
ppm
OH
H
H
H
H
OH
OH
H
O OH
H
H
OH
9
Spettro di correlazione 1H-13C di succo di
pomodoro
13C
1H
10
•In un liquido a causa dell’energia termica le molecole sono
sottoposte ad un moto casuale (Moto Browniano).
•Le caratteristiche di questo moto diffusivo sono funzione della
forma della perticella diffondente e dell’interazione con il
solvente e con le altre particelle.
P
 D 2 P
t
II legge di Fick
•I moti diffusivi possono essere misurati mediante NMR
facendo uso di gradienti di campo magnetico
• Ciascun nucleo emette O.E.M. a frequenza proporzionale
al campo magnetico che esso sente.
•Un gradiente lineare di campo fa si che nuclei aventi
posizioni differenti sentano campi magnetici differenti e
quindi risuonino a frequenza diversa. Ciò equivale a fare
una codifica fra la frequenza e la posizione dei nuclei..
11
Gli spin raggiungono insieme la linea di partenza solo se non
cambiano la loro posizione.
Ripetendo l’esperimento a diversi tempi di diffusione o con
diverse intensità di gradiente è possibile contare gli spin che
hanno rifocalizzato e quindi determinare il loro coefficiente di
diffusione.
La Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY) permette di
individuare le righe NMR associate con i nuclei della medesima
molecola attraverso il suo coefficiente di diffusione.
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Spetto DOSY di succo di pomodoro
13
Software commerciale
TNMR
Importanza dell’algoritmo di analisi
R. Lamanna “NMR Data Processing:The TNMR SoftwarePackage”
XXXII National Congress on Magnetic Resonance Pavia 18-21 settembre 2002
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List of components of tomato juice fully
assigned in 1H NMR spectra
Sugars
a-D-Glucose, b-D-Glucose,
b-D-Fructopyranose, b-D-Fructofyranose
Organic acids
Citric acid, Malic acid, Acetic acid, Formic
acid
Amino acids
Alanine, Threonine, Glutamic acid,
Glutammin, Aspartic acid, Asparagin,
Phenylalanine, Triptophane, Tyrosine,
Valine, Ileucine, -Aminobutyric acid
Alcohols
Ethanol, Methanol.
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Monitoraggio della maturazione
del pomodoro mediante NMR
Contenuto molare relativo dei componenti
principali del pomodoro a tre diversi gradi di
maturazione.
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Idrolisi Enzimatica dell’amido in
miscele acqua-farina
A
30 min
B
270 min
“B-A”
b-maltose
b-glucose
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Il Modello Cinetico
dM
 f S , M , t   g ( M , t )
dt
dG
 g (M , t )
dt
La forma delle funzioni f e g dipende dal tipo di reazioni coinvolte
Nel caso di una cinetica di tipo Michaelis-Menten si ha:
f S , M   V M
g M   VG
S
S  KS
M
M  KM
f S , M   V M
se
M
g M   VG
KM
S>>KS
M<<KM.
ki
E a 
Ei
Iniattivazione enzimatica del primo ordine
dE a
 k i E a
dt
E a  E 0 e  ki t
f S , M , t   VM 0 e  kiM t
g M .t   VG 0 e kiGt
V  k cat E a
M
KM
 a GK0M 1ea t 
VM 0 K M VM 0 K M
M (t ) 

 M 0 e
VG 0
V
 G0

V
G (t )  G0 
VM 0
a
1  e 
a t
V
 G 0 1ea t  
VM 0 K M

a KM

 M 0  1  e

V

 G0
 
18
100
Int (a.u.)
Int (a.u.)
50
Chey
CAP
0
0
Int (a.u.)
Int (a.u.)
100
AL1
0
50
SIM
0
100
Int (a.u.)
Int (a.u.)
50
AL2
[1]
0
Int (a.u.)
Int (a.u.)
0
10
ChSp
5
100
LAT
0
Int (a.u.)
0
40
Int (a.u.)
Lb45
AX
20
0
100
BxBy
0
20
Int (a.u.)
Int (a.u.)
50
DxDy
Lb42
0
0
4
Time, 10 s
2
4
Time, 104 s
2
4
 a GkM0 1ea t 
VM 0 k M VM 0 k M
M (t ) 

 M 0 e
VG 0
V
 G0

V
V
 G 0 1ea t  



V
k

G (t )  G0 
1  e a t    M 0 M  M 0  1  e a kM

a
V

 G0
 
VM 0
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D (cm2 s –1)
long chain
polysaccharides
Maltose
Glucose
d (ppm)
20
Pattern Recognition
PCA, Cluster Analysis, LDA, Anova, Logica Fuzzy, Reti
neurali, teniche Bayesiane etc.
Cluster Analysis
60
40
30
20
10
0
AL1
LAT
SIM
BXBY
CAP
Lb45
Lb42
AL2
ChSp
AX
Chey
DXDY
LDA
30
25
AL2
20
Chey
15
DxDy
M0
Linkage Distance
50
10
AX
5
ChSpLb45
0
Lb42
-5
-10
-4
BxBy LAT
CAP
-3
-2
-1
0
ROOT
1
SIM
2
3
4
S
H
21