Spettroscopia di Risonanza
Magnetica Nucleare (NMR)
Altisonante
Misterioso
Inquietante
 Nucleare
 Magnetica
“Tutti gli anni, verso il mese di
marzo, una famiglia di zingari
cenciosi piantava la tenda vicino al
villaggio, e con grande frastuono di
zufoli e tamburi faceva conoscere le
nuove invenzioni.
Prima portarono la CALAMITA.”
Gabriel Garcia Marquez
Cent’anni di solitudine
Cronologia NMR
• 1945
Prima osservazione di un segnale NMR
Bloch e coll. Stanford Un. (1H in H2O)
Purcell e coll. Harvard Un. (1H in paraffina) (nobel 1952)
• 1950
Scoperta del Chemical Shift
• 1961
Primo spettrometro commerciale CW
• 1970
Primo spettrometro commerciale FT
• 1976
Primi esperimenti 2D ( Ernst 1991 Nobel)
• 1980
Spettrometri NMR di II generazione
L’origine fisica dell’NMR
 Pauli nel 1924 introdusse l’idea dello spin nucleare
 Protoni e neutroni possiedono un momento angolare di spin con
relativo numero quantico di spin I=1/2
 In nuclei diversi da 1H il numero quantico di spin può essere intero,
semiintero o nullo; in particolare:
numero di massa dispari
numero di massa pari e n. atomico pari
numero di massa pari e n. atomico dispari
spin semiintero
spin nullo
spin intero
 L’NMR dipende dall’esistenza dello spin nucleare quindi nuclei con
I=0 sono magneticamente inattivi.
L’energia classica di un momento magnetico μ in un campo magnetico B è
E = - μ.B
Spin e abbondanza nucleare
Isotopo
Spin I
%
1H
1/2
99.98
2H
1
0.016
12C
0
98.89
13C
1/2
1.11
14N
1
99.64
15N
1/2
0.36
16O
0
99.76
17O
5/2
0.037
31P
1/2
100
Diagramma
dell’energia
N-
-/N+=e-DE/kT
NDE=hn
DE= g h Ho
Livelli degeneri
Ho
N+
n=gHo
Differenza di energia tra i due livelli mI = +1/2 e mI=-1/2
di un nucleo con spin I = 1/2 in un campo magnetico B0
ΔE = Eα –Eβ = γ ħ B0
Condizione di risonanza
hν = γ ħ B0
NMR risonanza magnetica nucleare
B0 = 12 T
ν = 500 MHz
λ ≈ 60 cm
<< Le cose hanno vita propria >>
proclamava lo zingaro con aspro accento,
<< si tratta solo di risvegliargli l’anima.>>
2I+1 orientazioni possibili
Irradiando il campione con delle opportune
radiofrequenze e misurandone l’assorbimento
potremmo ottenere lo “spettro” del composto
in esame.
1H
13C
31P
15N
MH
z
Spettrometro NMR
Intensità del segnale  (Nα – Nβ)B0
NgB0
2kT
N = N  N 
N  N  =
L’eccesso di popolazione nello stato ad
energia inferiore è dell’ordine di 10-6
Intensità del segnale cresce
al crescere del campo magnetico B0
al crescere di γ 1H > 13C
al diminuire di T
Lo spostamento chimico
Se tutti i protoni assorbissero alla stessa frequenza in un campo
magnetico esterno B0, l’informazione sarebbe praticamente nulla.
Nucleo nel campo magnetico B0
Atomo nel campo magnetico B0
Ma il campo magnetico esterno B0 induce una circolazione di elettroni che
crea un campo magnetico addizionale δB0
δB0 = -σ B0
σ costante di schermo
I nuclei interagiscono con il campo magnetico locale.
Chemical shift
 Gli elettroni di un atomo inducono un
piccolo campo magnetico che si oppone a
quello principale
 Il campo magnetico sperimentato dal
nucleo è generalmente minore del campo
effettivo di un fattore s
H = Ho (1- s)
n=gH
Nuclei dello stesso atomo assorbono a
frequenze leggermente diverse a causa
del loro “intorno chimico”
Il campo magnetico locale
Bloc = B0 + δB0
δB0
B0
La corrente indotta dal campo magnetico esterno B0 (e quindi il campo
magnetico addizionale) dipende dai dettagli della struttura elettronica
attorno al nucleo.
Nuclei diversi in diversi gruppi chimici hanno diverse costanti di schermo.
A seconda dell’ambiente chimico, i protoni in una
molecola sono schermati in quantità diverse
Più schermati
assorbono a campi più alti
meno schermato
assorbe a campi più bassi
B0 →
Bloc = B0  B = 1  s B0
La frequenza di Larmor è
gBloc
gB0
nL =
= 1  s 
2
2
Al variare di B0 varia la frequenza di risonanza.
Si introduce lo spostamento chimico
n n 0
=
106
n0
Come frequenza di riferimento si conviene di utilizzare la
frequenza del tetrametilsilano.
CH3
H3C
Si CH3
Tetrametilsilano
CH3
• TMS è aggiunto al campione.
• Poiché Si è meno elettronegativo di C, i protoni
di TMS hanno schermo alto. Il loro segnale è
definito come zero.
• I protoni delle molecole organiche assorbono a
campi bassi (alla sinistra) del segnale TMS.
Scala delta
Il valore dello spostamento chimico δ non dipende dalla
potenza del magnete (dall’apparecchiatura utilizzata)
Diagramma di correlazione 1H NMR
Risonanza di diversi gruppi
Gli spettri NMR sono riportati per valori di δ
crescenti da destra verso sinistra.
Originariamente gli spettri venivano ottenuti
con una frequenza fissa e facendo crescere B0.
Quindi i segnali di atomi molto deschermati
comparivano a campi bassi e via via quelli a
campi più alti (e quindi δ più piccolo).
Lo spettro dell’etanolo può essere interpretato considerando la presenza
dell’ossigeno.
Sottrae carica all’H a cui è direttamente legato e che quindi è fortemente
deschermato (δ ≈ 4), ha minore effetto sugli H del gruppo CH2 (δ ≈ 3.6),
ha effetto trascurabile sugli H di CH3.
L’integrazione del segnale (area sotto i picchi) dei 3 gruppi porta a valori
1:2:3 legato ai numeri di H dei tre gruppi.
Spostamento chimico ed intensità dei segnali aiutano ad interpretare gli
spettri NMR.
Posizione dei segnali
• Atomi più elettronegativi
deschermano maggiormente e
generano spostamenti chimici δ più
grandi.
• Un maggior numero di atomi
elettronegativi causa un aumento
dello spostamento chimico δ.
• L’effetto decresce con la distanza.
CH3X Cl Br I

3.0 2.7 2.1
Correnti d’anello
Idrogeni legati ad anelli aromatici presentano valori di  elevati.
La corrente di anello è indotta in un campo magnetico dagli elettroni π
delocalizzati e genera un campo magnetico addizionale.
Nel centro dell’anello il campo indotto è in direzione opposta al campo
magnetico esterno.
I protoni nel piano dell’anello sono deschermati, un sostituente sopra
l’anello è schermato.
σ(solvente)
Interazioni specifiche soluto-solvente (es. legame ad
idrogeno) portano a effetti di schermo o di minor schermo
in dipendenza della posizione relativa del soluto rispetto al
solvente.
La struttura fine
1,2-dicloroetano
1,1-dicloroetano
“Molteplicità” dei segnali NMR
 Ad ogni protone (carbonio, azoto …) chimicamente diverso
corrisponde un segnale di diversa frequenza.
 La “forma” del segnale in uno spettro NMR spesso non è un
semplice picco di assorbimento ma può assumere aspetti molto
diversi.
Singoletto
Doppietto
1:1
Tripletto
1:2:1
Quartetto
1:3:3:1
Quintetto
1:4:6:4:1
• Protoni non equivalenti su atomi di C
adiacenti hanno campi magnetici che
possono allinearsi con il campo
esterno od opporsi ad esso.
• Questo accoppiamento magnetico fa
si che il protone assorba a campi
leggermente più bassi quando il
campo esterno è rinforzato e a campi
leggermente più alti quando il campo
esterno è opposto.
• Tutte le possibilità esistono, pertanto
il segnale è suddiviso.
L’interazione è espressa dalla
costante di accoppiamento scalare J (Hz)
La molteplicità dei segnali è dovuta ai “vicini di casa”
HaHb
| |
-C C|
|
Ho + 
Ho
—
b
a
b
Ho - 
n = g H0
Doppietto
1:1
HaHb
| |
-C C-Hc
Ho + 
—
|
|
b c
a
Ho
2 Ho
Ho - 
Tripletto
1:2:1
Sistema AX2
La risonanza dell’atomo A è divisa in
un doppietto di separazione J per
interazione con un nucleo X e
ciascuna linea è ulteriormente divisa
in un doppietto di separazione J per
interazione con un secondo nucleo X.
Tre linee con rapporto di intensità
1:2:1
Il campo sperimentato da A è
αα
αβ βα
ββ
Sistema AX3
La risonanza dell’atomo A è divisa in
un doppietto di separazione J per
interazione con il primo nucleo X,
ciascuna linea è ulteriormente divisa
in un doppietto di separazione J per
interazione con il secondo nucleo X,
ciascuna linea è ulteriormente divisa
in un doppietto di separazione J per
interazione con il terzo nucleo X.
Quattro linee con rapporto di
intensità 1:3:3:1
Il campo sperimentato da A è
ααα
ααβ αβα βαα
αββ βαβ ββα
βββ
L’interazione con nuclei con I = 1 porta a tre componenti
di uguale intensità.
1,1,2-Tribromoetano
Protoni non equivalenti su carboni adiacenti.
Doppietto: 1 Protone adiacente
Tripletto: 2 Protoni adiacenti
La regola N + 1
Se un segnale è diviso da N protoni equivalenti,
è diviso in N + 1 picchi.
=>
Estensione dell’accoppiamento
magnetico
• Protoni equivalenti non si suddividono .
• Protoni legati allo stesso carbonio si
suddividono solo se non sono equivalenti.
• Protoni su carboni adiacenti normalmente si
accoppiano.
• Protoni separati da quattro o più legami non
si accoppiano.
Costanti di accoppiamento
• J : distanze tra i picchi del multipletto.
• J misurate in Hz.
• Non dipendono dalla forza del campo
esterno.
• NJ costante di accoppiamento tra due nuclei
separati da N legami.
1J
13C-H
2J
13C-C-H
CH
CH
Le Risonanze Magnetiche




NMR in soluzione (ad alta risoluzione)
NMR allo stato solido (CP-MAS)
NMR in vivo
Risonanza magnetica ( imaging)
NMR in soluzione
NMR dei chimici
I composti vanno sciolti in un
solvente deuterato
Massima omogeneità del campo
magnetico
Spettri affilati poiché il rapido moto
casuale delle molecole media a zero le
interazioni dipolari anisotropiche
computer
controlli
elettronici
magnete a
superconduzione
Tubo NMR
Solvente
deuterato
Risonanza magnetica imaging (MRI)
la MRI e' una modalità di imaging usata principalmente
per costruire immagini a partire dal segnale NMR
proveniente dagli atomi di idrogeno presenti nell'oggetto
esaminato.
Nell'MRI
medica,
i
radiologi
sono
per
lo
più
interessati al segnale NMR proveniente da acqua e
grasso, essendo questi i componenti del corpo umano
che contengono le maggiori quantità di idrogeno.
L’ energia coinvolta nelle transizioni NMR è minima rispetto alle energie
coinvolte nelle emissioni di raggi X e gamma (1-100 Kev).
In un campo magnetico di 1 Tesla, il dislivello di energia tra i protoni
paralleli e antiparalleli è =
1.759 x 10-7 eV
Frequenze degli spettrometri NMR
usati per alta risoluzione
B0
n
200 MHz
4.7 T
300 MHz
7 T
400 MHz
9.4 T
500 MHz
11.7 T
600 MHz
14 T
900 MHZ
21 T
1 T ≈ 43 MHz
In MRI medica normalmente si utilizzano spettrometri da 1-2 T
La Risonanza Magnetica Nucleare è emersa come un nuovo
strumento non distruttivo e non invasivo per lo studio del
metabolismo e della struttura anatomica di sistemi biologici
intatti.
MRS in vivo e MRI (imaging)
 Sono
due tecniche molto conosciute per il loro
utilizzo in campo biomedico ma in realtà possono essere
usate in moltissimi campi scientifici.
 I principi fisici fondamentali sono gli stessi dell’NMR
in alta risoluzione ma le tecniche, la strumentazione e i
dati ottenuti da questi esperimenti sono molto
differenti.
 La prima differenza è la scomparsa del termine NUCLEARE dal nome delle
tecniche!!!!!
 Le differenze fondamentali derivano dalle diversità dei “campioni” da
analizzare:
- omogenei in NMR alta risoluzione
- assolutamente eterogenei in MRI
MRS in vivo
Tra le tecnologie emergenti della Medicina di laboratorio, la
spettroscopia di risonanza magnetica in vivo (MRS) è
particolarmente innovativa perché consente di esplorare
direttamente sul paziente e in modo non invasivo la
concentrazione intracellulare di alcuni intermedi metabolici e
la funzionalità di diverse vie metaboliche.
Invece di ottenere immagini dettagliate di
tessuti con la MRS possiamo ottenere gli
spettri
di
composti
biochimici
presenti
all’interno di questi tessuti!
Con la spettroscopia RM del fosforo (31P-MRS):
• ATP
Si valuta la funzionalità di:
• fosfato inorganico (Pi)
fosforilazione ossidativa,
glicogenolisi, glicolisi …..
• fosfocreatina (PCr)
• intermedi metabolici fosforilati (PME e PDE)
• concentrazione di Mg2+
• pH intracellulare
Con la spettroscopia RM del protone (1H-MRS):
• n-acetilaspartato (NAA)
• colina (Cho)
• creatina + fosfocreatina (Cr)
• glutammato e glutammina (Glx)
•mio-inositolo (m-I) e acido lattico (LA)
Si valuta la funzionalità di:
sistema glutamminergico,
metabolismo energetico, la
osmoregolazione del SNC …….
In vivo 31P NMR di Corynebacterium glutamicum
MRI
il segnale NMR
I principali parametri che influenzano il segnale NMR sono:
densità dei nuclei
tempi di rilassamento T1 e T2
diffusione dei nuclei
“chemical shift”
presenza di materiali che modificano il campo magnetico locale
Le immagini MR di routine sono
ottenute in modo da
rappresentare prevalentemente:
T1, T2 e D
utilizzando sequenze di impulsi
opportune
MR imaging