Caratterizzazione strutturale
delle proteine
1. X-ray
2. NMR
1)Cristallografia a raggi X
2) NMR
(Nuclear Magnetic Resonance)
LA STORIA
1864
1895
Viene cristallizzata l’ emoglobina.
Röngten osserva che quando i raggi catodici (elettroni) colpiscono un bersaglio metallico si
origina una nuova forma di radiazione penetrante, che egli chiamò raggi X.
1912
Facendo attraversare dai raggi X un cristallo di solfuro di zinco Von Laue ottiene i primi
diffrattogrammi. W.L. Bragg e W.H. Bragg propongono una correlazione semplice tra la figura di
diffrazione ottenuta con i raggi X e la disposizione degli atomi nel cristallo che ha generato la
figura (legge di Bragg).
Anni ‘30 Bernal, Crowfoot, Bragg, ottengono i primi diffrattogrammi da cristalli di proteine (insulina,
emoglobina, mioglobina).
1941
Atsbury ottiene il primo diffrattogramma ai raggi X del DNA.
1951
Pauling e Corey propongono i concetti di struttura a-elica e foglietto b in base a considerazioni
teoriche.
1953
Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica del DNA sulla base delle analisi
diffrattometriche ai raggi X di Franklin e Wilkins.
1954
Perutz e coll. elaborano i metodi basati sull’ impiego dei metalli pesanti per risolvere il
problema delle fasi nella cristallografia ai raggi X.
1960
Kendrew descrive la struttura della mioglobina a una risoluzione di 2 Å. Perutz propone la
struttura della emoglobina, piu’ grande, ad una risoluzione inferiore.
Anni ‘80 Hartmut Michel risolve la struttura (3 Å) della prima proteina di membrana (centro di reazione
fotosintetico).
The paper
The model
Maurice Wilkins
M.H.F. Wilkins, A.R. Stokes, H.R. Wilson:
Molecular Structure of Deoxypentose Nucleic
Acids. Nature 171, 738 (1953)
Rosalind Franklin
R.E. Franklin and R.G. Gosling
Molecular Configuration in Sodium
Thymonucleate, Nature 171, 740 (1953)
Nobel laureates 1962
Wilkins, Perutz, Crick, Steinbeck, Watson, Kendrew
Cristallografia a raggi X
• Attualmente tecnica di elezione per la determinazione di
strutture 3D a risoluzione atomica
• Tecnica indiretta: l’immagine va ricostruita
• Non ci sono limitazioni nelle dimensioni delle
macromolecole
• Svantaggi:
– cristalli singoli
– altamente ordinati
– ragionevolmente grandi (80-100 μM)
Cristallografia a raggi X
Precisa determinazione della posizione atomica
Cristalli della proteina
– 0.3-1.0 mm
– Le singole molecole sono ordinate in modo periodico, ripetitivo
Salting out non è sufficiente
La solubilità della proteina è determinata
dalle interazioni soluto solvente dovute
alle cariche superficiali della proteina
Lys, Arg, Asp, Glu
L’aumento della forza ionica della
soluzione favorisce la interazione tra
le cariche superficiali della proteina
ed il solvente polare
Un eccesso di forza ionica della
soluzione favorisce le solvatazione
degli ioni stessi a scapito della
solvatazione della proteina. Il sale
compete con la proteina e la
solvatazione diminuisce
all’aumentare della forza ionica
Polietilenglicole: proteina precipita, ma rimane in contatto con l’acqua.
Struttura ordinata con indice di rifrazione diverso
rispetto a quello del mezzo in cui si trova
Perchè i raggi X?
Per poter visualizzare due oggetti come entità separate, la lunghezza
d’onda della radiazione elettromagnetica deve essere dello stesso
ordine di grandezza della distanza tra gli oggetti:
distanza interatomica ≈1Å (10 nm)
λraggiX= 0.1 ÷ 2 Å
con i raggi X “vedo” gli atomi
Visione d’insieme del processo
RX
Cristallizzazione
FFT
Diffrazione
Risoluzione della struttura
e affinamento
…perché un cristallo?
L’immagine di diffrazione da una singola molecola si forma per
interazione dei raggi X con gli elettroni degli atomi della molecola
MA: - è troppo debole
- impossibile separarla dalla radiazione di fondo (soluzione)
Impossibile ricostruire la molecola
In un cristallo, miliardi di
molecole sono disposte
in modo ripetuto e
ordinato
nelle tre dimensioni
Cristallo è amplificatore del segnale
100 mg!!
buone immagini di diffrazione
si può ricostruire la molecola
Schmid, M. Trends in Microbiology, 10:s27-s31.
Instrumentation
or synchrotron X-rays
Instrumentation
ESRF - Grenoble
Instrumentation
Elettra - Trieste
The Bragg law
Facendo incidere un'opportuna onda elettromagnetica su di un cristallo si osservano
fenomeni di interferenza, causate dalla riflessione di onde riflesse da piani cristallini
diversi, ma paralleli.
l = 2 d sinq
sinq/l = 1/(2 d)
d = l / (2 sinq)
Dove:
- θ è l'angolo che il fascio incidente forma
con il piano cristallino
- λ è la lunghezza d’onda della radiazione
- d è la distanza tra due piani adiacenti.
Acqua
Agente precipitante
Soluzione cristallizzante
acqua/acetone cloroformio o cloruro di metilene/etere di petrolio o esano
Crystal growth
Crystal growth
Abbiamo ottenuto le MAPPE … e poi?
+
Densità iniziale
=
Interpretazione
Struttura 3D
• La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione.
• La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.
Risoluzione
Esempio: la proteasi del virus HIV
La cavità centrale è ampia e
può legare un polipeptide in conformazione estesa
KNI577
• La tasca è stata “riempita” con analoghi non idrolizzabili del
substrato: inibitori competitivi altamente specifici e selettivi
• Nuova generazione di farmaci “intelligenti” con pochi effetti
collaterali inibitori non competitivi altamente specifici e selettivi
MODULATION OF HEME AND MYRISTATE BINDING TO HUMAN
SERUM ALBUMIN BY ANTI-HIV DRUGS. AN OPTICAL AND NMR
SPECTROSCOPIC STUDY (FEBS J. 274 (2007) 4491-4502)
Superimposition of myristate and abacavir (panel A), nevirapine (panel B),
and atazanavir (panel C) in binding site FA6. Ligands are colored as follows:
myristate: green; abacavir: blue; nevirapine: orange; atazanavir: cyan.
Atomic coordinates were taken from the PDB entry 1O9X (Zunszain et al., 2003).
Heme Binding to Albuminoid
Proteins is the Result of Recent Evolution,
IUBMB Life 59, 436-440 (2007).
2) NMR
• Tecnica
spettroscopica per lo studio della struttura di
macromolecole a risoluzione atomica
• È basata sull’interazione dei singoli nuclei atomici
magneticamente attivi - 1H, 15N, 13C e 31P - con il campo
magnetico esterno e con i campi magnetici dei nuclei adiacenti
Informazioni di:
– dinamica
– conformazione
– folding
– interazioni intermolecolari
Campo magnetico
NOE (Nuclear Overhauser Effect)
Il campo magnetico
Magnete a 900 MHz
Magnete a 400 MHz
Costo commerciale di uno spettrometro a 900 MHz: ca. 5 M €
n. di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10
Magnetic Resonance Center - Firenze
The Magnet
History
First magnets were built using
ferromagnetic material=
permanent magnet
Then Electromagnets:
i.e. field was generated by
wiring of conducting material
Now: cyomagnets: i.e. electromagnets
made of superconducting wire.
A “cutted” magnet
La rotazione dei nuclei atomici su sé stessi è capace di procurare un momento
magnetico μ se i nuclei sono carichi.
Solo nuclei con numero atomico dispari mostrano proprietà magnetiche: si
dice che il loro numero quantico di spin è ±1/2.
Solo particelle dotate di spin sono in grado di disporsi in diversi livelli
energetici se immerse in un campo magnetico.
Orbita di precessione
B0
Dipolo
magnetico
Momento
magnetico
μN
Nucleo
Frequenza di Larmor
L’energia della transizione NMR
Si applica un campo magnetico B0:
il momento magnetico del protone tenderà ad allinearsi con il campo esterno.
Si creano due livelli energetici: uno, ad energia più alta, in cui il suo momento
magnetico si oppone al campo esterno; uno, ad energia più bassa,
in cui è allineato.
m=-1/2
E= -m•B0
DE=h0
DE=g(h/2p)B0 E
m=+1/2
B0
Larmor Frequency
Il campo magnetico B0 serve per creare
la separazione di energia tra i 2 livelli
L’energia della
E= -m•B0
transizione NMR
DE=g(h/2p)B0
Devo applicare una
E
radiofrequenza = alla frequenza
DE=h0
Per stimolare la transizione!
m=-1/2
DE=h0
m=+1/2
B0
Il campo di radiofrequenza
utilizzato per eccitare la
transizione
si chiama anche B1
Larmor Frequency
B1 deve emettere una radiofrequenza in corrispondenza della frequenza di Larmor
Some paradigmatic examples
Why?
NMR is a unique method to obtain information in solution
AT THE ATOMIC LEVEL.
Each individual atom has a peculiar resonance frequency.
Because the resonance frequency depends on the environment of
the atom, EACH atom has a different resonance frequency and
can, therefore be identified
CH3-CH2-OH
equivalent
NMR Spectrum to 3D Structure
H
H
Interactions
Spectrum
H
H
H H H
H
H
H
H
Structure
Challenges For Determining
Protein Structures Using NMR
• Proteins have thousands of signals
• Assign the specific signal for each atom
• Thousands of interactions between atomsalso need to be assigned
• Need to transform from NMR spectrum
through interpretation of scalar and dipolar
interactions to generate 3D coordinates
Resonance Assignment
CH3-CH2-OH
OH
CH2 CH3
Which signal from which H atoms?
The key attribute: use the scalar and dipolar couplings to
match the set of signals with the molecular structure
Proteins Have Many Signals
1H
NMR Spectrum of Ubiquitin
~500 resonances
A large number of signals are overlapped
A Critical Feature of
Protein NMR Spectra
• Only some nuclei are coupled
Each amino acid gives rise to an independent NMR
sub-spectrum, which is much simpler than the
complete protein spectrum
Methods have been
developed to extract
each sub-spectrum
from the whole
Critical Features of
Protein NMR Spectra
• The nuclei are not all mutually coupled
• Regions of the spectrum correspond to
different parts of the amino acid
• Tertiary structure leads to increased
dispersion of resonances
Regions of the 1H NMR Spectrum
are Further Dispersed by the 3D Fold
What would the unfolded protein look like?
Proteins Have Overlapped
Signals
1H
NMR Spectrum of Ubiquitin
Spettri monodimensionali presentano differenze di c.s. < potere risolutore
Resolve resonances by multi-dimensional experiments
Resolve Peaks By Multi-D NMR
A BONUSregions in
2D spectra provide
protein fingerprints
If 2D cross peaks
overlap go to 3D
or 4D …..
Solution to the Protein Challenge
1. Increase dimensionality of spectra to
better resolve signals: 1234
2. Detect signals from heteronuclei
(13C,15N)
t2
t1
t3
NMR Structure Calculations
• Objective is to determine all conformations consistent
with the experimental observables
• NMR data is not perfect: noise, incomplete
Multiple solutions: caused by uncertainties
in the experimental constraints
Conformational Ensemble
Representing an NMR Structure
C
N
Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)
•
•
•
•
•
•
Proteine in soluzione
Limite di dimensione ~ 40 kDa
Proteine stabili a lungo
Marcatura con 15N, 13C, 2H.
Strumentazione molto costosa
Tempo per assegnare le risonanze
Pro e contro
X-ray
NMR
•
Richiede cristalli, problematico
•
Possibile in soluzione, più semplice
•
Non ha limiti (teorici) di grandezza
•
Limitato a proteine fino a circa 300
residui
•
Piú preciso
•
Meno preciso
•
Risoluzione
•
Numero di vincoli
•
Struttura può essere deformata dai
cristalli, rigida
•
Struttura nativa in soluzione,
flessibile
•
Una “soluzione“
•
Molti modelli
X-ray
NMR