Lavoro di diploma di Sandra Jovic
Formazione tecnico in analisi biomediche
Scuola superiore medico tecnica, Locarno, 2009
CONFRONTO TRA QUATTRO TERRENI
SELETTIVI PER L’IDENTIFICAZIONE
RAPIDA PRESUNTIVA DI
ENTEROBATTERIACEAE PRODUTTRICI
DI ENZIMI ESBL
Lavoro svolto presso:
Istituto Cantonale di Microbiologia (ICM), Bellinzona
Dipartimento Medicina di Laboratorio dell’Ente Ospedaliero
Cantonale (EOC), Ospedale Regionale di Lugano (ORL),
sede Civico
Con la collaborazione di:
Supervisore Dr. Tiziano Balmelli
Dr. Antonella Demarta
INDICE
1. RIASSUNTO, ABSTRACT
4
2. ABBREVIAZIONI
5
3. INTRODUZIONE
3.1 Problematiche e obiettivi dello studio
3.2 Aspetti scientifici legati a ESBL
3.2.1 Bacilli Gram negativi
3.2.2 Le Enterobatteriaceae
3.2.3 Pseudomonas aeruginosa
3.2.4 Acinetobacter baumannii
3.2.5 Stenotrophomonas maltophilia
3.3 Gli antibiotici β-lattamici in medicina
3.4 Microrganismi multirestenti: MRSA e VRE
3.5 Meccanismi di azione delle β-lattamasi
3.6 Meccanismi di resistenza ai β-lattamici
3.7 Gli ESBL
3.7.1 Epidemiologia
3.8 Caratterizzazione degli ESBL: TEM, SHV, OXA, CTX-M
3.8.1 AmpC
3.8.2 K1
3.9 Rilevamento di ESBL all’ICM
3.9.1 Caratterizzazione fenotipica
3.9.2 Caratterizzazione genotipica
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4. MATERIALI E METODI
4.1 Piastre
4.2 Microrganismi
4.3 Produzione della piastra CIVA Agar
4.4 Ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae produttori e non di ESBL e ceppi non
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Enterobatteriaceae
4.4.1 Organizzazione del lavoro per i ceppi batterici
4.5 Messa in evidenza di batteri produttori di ESBL a partire da materiali biologici
4.5.1 Uricult
4.5.2 Feci
4.5.3 Secrezioni respiratorie, puntati e strisci
4.5.4 Organizzazione del lavoro per i materiali biologici
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5. RISULTATI
5.1 Caratteristiche delle colonie sulle piastre
5.2 Campioni
5.3 Tempo di incubazione 24 o 48 ore
5.4 Risultati ottenuti con le piastre
5.4.1 Risultati ottenuti con ChromIDTM ESBL Agar
5.4.2 Risultati ottenuti con BLSE Agar
5.4.3 Risultati ottenuti con EbSA Agar
5.4.4 Risultati ottenuti con CIVA Agar
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6. DISCUSSIONE
6.1 Sensitività e specificità
6.2 PPV (positive predictive value) e NPV (negative predictive value)
6.3 Ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae
6.3.1 Interpretazione dei risultati ottenuti
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2
6.3.2 Identificazione a livello di specie batterica
6.3.3 Possibilità di discriminare bacilli Gram negativi non Enterobatteriaceae
6.3.4 L’influenza di AmpC e K1
6.4 Materiale biologico
6.4.1 Interpretazione dei risultati ottenuti
6.4.2 Feci
6.4.3 Possibilità di discriminare le Enterobatteriace dalle non Enterobatteriaceae
6.5 Confronto con altri studi
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7. CONCLUSIONI
30
8. BIBLIOGRAFIA
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9. RINGRAZIAMENTI
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10. ALLEGATI
Allegato 1: Skim Milk (BBL)
Allegato 2: Agar Sangue (Oxoid)
Allegato 3: Mac Conkey (Difco)
Allegato 4: Drigalski Agar (Biokar Diagnostics)
Allegato 5: Ossidasi (Sigma)
Allegato 6: E-Test (AB Biodisk)
Allegato 7: Phoenix Epicenter (BD)
Allegato 8: MALDI-TOF MS (AXIMA)
Allegato 9: Geni ESBL, risultati ottenuti all’ICM
Allegato 10: Influenza di AmpC e K1
Allegato 11: Classificazione degli antibiotici β-lattamici
Allegato 12: Fotografie piastre
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1. RIASSUNTO
1. ABSTRACT
La resistenza batterica attribuita alle ESBL (βlattamasi a spettro esteso) è stata riscontrata
all’inizio degli anni ’80 per la prima volta nella
pratica clinica in Europa e successivamente
negli Stati Uniti dopo l’introduzione delle
cefalosporine
di
terza
generazione.
Attualmente questo meccanismo di resistenza
viene
riscontrato
ovunque
e
le
Enterobatteriaceae produttrici di enzimi ESBL
(E-ESBL) sono riconosciute in tutto il mondo
come patogeni ospedalieri.
Con questo lavoro si vuole determinare il
terreno di crescita migliore per la messa in
Enterobatteriaceae
evidenza
rapida
di
produttrici di ESBL, allo scopo di individuare
eventuali pazienti portatori di E-ESBL in breve
tempo.
Si è deciso quindi di testare quattro terreni
selettivi, tre pronti per l’uso ChromIDTM ESBL
Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e uno da
preparare all’ICM di nome CIVA Agar.
Sono stati analizzati 49 ceppi batterici
(colture
pure)
della
famiglia
Enterobatteriaceae e 32 materiali biologici
risultati positivi tramite il metodo di referenza
E-Test.
La specificità e la sensitività delle quattro
piastre sono state testate sia utilizzando i 49
ceppi che i 32 materiali biologici.
Per i 49 ceppi batterici testati i valori di
sensitività migliori sono stati ottenuti con le
piastre ChromIDTM ESBL Agar e BLSE Agar, e
quelli di specificità con la EbSA Agar.
Per i materiali biologici le piastre ChromIDTM
ESBL Agar e BLSE Agar hanno dato i risultati
più soddisfacenti.
Dal punto di vista del laboratorio di analisi
microbiologiche, si può concludere che l’uso
ESBL
Agar
della
piastra
ChromIDTM
permetterebbe uno screening efficace e
rapido
per
l’identificazione
di
Enterobatteriaceae produttrici di ESBL.
The bacterial resistance attributed to the
ESBL (Extended Spectrum β-Lactamases) was
found at the beginning of the 80s for the first
time in Europe and afterwards in the United
States, after the introduction of third
generation cephalosporins into clinical
practice.
Currently, this mechanism of resistance is
widespread and the Enterobacteriaceae
producing the enzymes ESBL (E-ESBL) are
recognised all over the world as hospital
pathogens.
The aim of this study was to determine the
culture medium most suitable for the rapid
identification of Enterobacteriaceae-producing
ESBL, in order to recognise in a short time
probable patient carriers of E-ESBL.
It was decided, therefore, to test four
selective culture media, three of which are
ready to use: ChromIDTM ESBL Agar, BLSE
Agar and EbSA Agar and one which has to be
prepared in ICM, namely CIVA Agar.
A collection of 49 bacterial strains (pure
culture) of the family Enterobacteriaceae and
32 biological samples which had resulted
positive through the reference method ETest, were analysed.
The specificity and sensitivity of the four
plates were tested either by using the 49
strains or the 32 the biological samples.
For the 49 bacterial strains tested the best
values of sensitivity were obtained using the
plates ChromIDTM ESBL Agar and BLSE Agar,
and those of specificity using the plate EbSA
Agar. For the biological samples the plates
ChromIDTM ESBL Agar and BLSE Agar gave
the most satisfactory results.
From the point of view of the microbiological
laboratory of analyses, it can be concluded
that the use of the plate ChromIDTM ESBL
Agar would allow an effective and rapid
screening
for
the
identification
of
Enterobacteriaceae-producing ESBL.
4
2. ABBREVIAZIONI
AmpC
ATCC
BLSE Agar
ChromIDTM ESBL Agar
CIVA Agar
CLSI
CMI
CT
CTL
CTX-M
EbSA Agar
EOC
ESBL
E-ESBL
ICM
ID
KESC
MALDI-TOF MS
MRSA
NCCLS
NEG
NPV
ORL
OXA
POS
PBPs
PCR
PM
PML
PPV
K1
SHV
TEM
TZ
TZL
VRE
Ampicillina C, gene di resistenza
American Type Culture Collection
β-Lactamase-Spectrum-Extended Agar (Axon Lab AG)
Chromogenic Identification ESBL Agar (Biomérieux)
Ceftazidime Inositol Vancomycin Amphotericin-B Agar
Clinical and Laboratory Standards Institute
Concentrazione minima inibente
Cefotaxima
Cefotaxima e acido clavulanico
Cefotoximasi
ESBL Screening Agar (Alpha Omega Development-Production B.V.)
Ente Ospedaliero Cantonale
Extended Spectrum β-Lactamases
Enterobatteriaceae produttrici di enzimi ESBL
Istituto Cantonale di Microbiologia
Identificazione
Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass
Spectrometry
Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus
National Committee for Clinical Laboratory Standards
Negativo
Negative predictive value
Ospedale Regionale di Lugano
Oxacillinasi
Positivo
Penicillin Binding Proteins
Polymerase Chain Reaction
Cefepima
Cefepima e acido clavulanico
Positive predictive value
Gene K1
Sulphydryl Variable
Temoniera
Ceftazidima
Ceftazidima e acido clavulanico
Vancomycin-Resistant Enterococcus
5
3. INTRODUZIONE
3.1 Problematiche e obiettivi dello studio
Questo lavoro nasce dalla sempre maggiore consapevolezza che la capacità di riconoscere le
farmacoresistenze batteriche, conseguenti allo svilupparsi di meccanismi di resistenza, è un
problema di grande rilevanza per la sanità pubblica [1].
L’EOC sta valutando un test rapido selettivo per l’identifcazione degli ESBL da introdurre nella
pratica quotidiana, allo scopo di prevenire eventuali epidemie ospedaliere.
Con questo lavoro si vuole determinare il terreno di crescita migliore, per sensitività e specificità,
per la messa in evidenza di E-ESBL in materiali biologici.
In funzione dei dati presentati in letteratura [2, 3, 4, 5] i Dr. Tiziano Balmelli e Dr. Antonella
Demarta hanno scelto i seguenti quattro terreni selettivi:
1.
2.
3.
4.
ChromIDTM ESBL Agar (Chromogenic Identification ESBL Agar) [2],
BLSE Agar (β-Lactamase-Spectrum-Extended Agar) [3],
EbSA Agar (ESBL Screening Agar) [4],
CIVA Agar (Ceftazidime Inositol Vancomycin Amphotericin-B Agar) [5].
Figura 1 ChormIDTM ESBL Agar
Figura 2 BLSE Agar
Figura 3 EbSA Agar
Figura 4 CIVA Agar
Il metodo di riferimento ritenuto come Gold Standard per la determinazione dei ceppi produttori di
ESBL è l’E-Test [Allegato 6].
Sapendo che alcuni generi di batteri hanno normalmente una resistenza conosciuta agli antibiotici
contenuti nelle piastre per il rilevamento degli ESBL (ceftazidima, cefotaxima), e presumendo la
possibilità per questi batteri di crescere sulle piastre scelte, si è voluto verificarne il comportamento
di crescita e la possibilità di distinguerli macroscopicamente da ceppi della famiglia
Enterobatteriaceae. Si sono perciò analizzati 6 ceppi batterici della famiglia Xanthomonadaceae, 6
ceppi batterici della famiglia Moraxellaceae e 5 ceppi batterici della famiglia Pseudomonadaceae
[Tabella 2].
In previsione di un’eventuale possibilità di utilizzo delle piastre per uno screening dei pazienti
tramite striscio anale con lo scopo di evidenziare eventuali portatori di ESBL, si sono presi in
considerazione 6 campioni di feci [Tabella 3]. L’importanza di questa analisi è di verificare
l’incidenza della flora commensale sulla messa in evidenza di ESBL.
6
3.2 Aspetti scientifici legati a ESBL
3.2.1 Bacilli Gram negativi
Figura 5 Batterio bacillo Gram negativo [7]
a = fimbria: struttura tubolare piena che consente al
batterio di aderire alla superficie
b = pilo: appendice filamentosa di batteri Gram negativi
c = capsula: strato mucoso che circonda la parete di
alcune specie batteriche; può avere potere immunogeno
d = parete cellulare: strato cellulare che circonda la
membrana plasmatica
e = membrana plasmatica: barriera selettivamente
permeabile tra il citoplasma e l’ambiente extracellulare
f = flagello: appendice flessibile che serve per il
movimento
g = plasmide: DNA extracromosomico circolare e
contenente informazioni accessorie. Può replicarsi
indipendentemente dal cromosoma principale e nella
coniugazione può essere trasferito da una cellula all’altra
(trasformazione).
h = nucleoide: conosciuto come regione nucleare o
corpo della cromatina, è una regione dalla forma
irregolare che contiene materiale genetico
Le famiglie di batteri appartenenti ai bacilli Gram
Enterobatteriaceae,
le
negativi
sono
le
Pseudomonadaceae,
le
Moraxellaceae,
le
Xanthomonadaceae e altre famiglie. Sono di piccole
dimensioni con lunghezza da 0.5-1.5 μm a 2-4 μm.
Possono essere anaerobi o aerobi. Possiedono dei
pili e alcuni presentano flagelli per la loro mobilità e
una capsula.
Lo strato esterno, tipico dei batteri Gram negativi, è
costituito prevalentemente da lipopolisaccaridi
collegati tra loro da proteine che attravesano lo
spazio periplasmatico. Alla frazione glicidica si deve
il potere immunogeno dei Gram negativi.
Il lipide A forma una struttura rigida che rende la
cellula batterica impermeabile a molte sostanze,
antibiotici o disinfettanti. Nello strato esterno si
trovano le porine che delimitano dei canali di
selezione di sostanze in entrata nella cellula. Per
questo motivo i Gram negativi risultano meno
sensibili dei Gram positivi nei confronti di alcuni
antibiotici, in quanto le porine ne impediscono
l’ingresso. All’interno della parete vi sono complessi
molecolari di trasporto, responsabili del pompaggio
verso l’esterno di sostanze nocive eventualmente
penetrate nella cellula. Lo strato interno della parete
possiede pompe proteiche di efflusso collegate a
proteine periplasmatiche di fusione che continuano
in canali nello strato esterno. La loro funzione è di
pompare le sostanze direttamente nell’ambiente
esterno, per evitare che si accumulino nel periplasma e tornino
nuovamente nel citoplasma batterico. Molti componenti della
g
a
parete sono immunogeni e come tali inducono nell’ospite una
f
b
reazione immunitaria ai batteri.
d
La conoscenza della struttura della parete, oltre che per
c
caratterizzare il tipo antigenico dei batteri, è importante per la
terapia, in quanto diversi antibiotici agiscono proprio sui
costituenti o sui processi di sintesi della parete.
e
I bacilli Gram negativi sono i più comuni costituenti della flora
endogena umana del cavo orale, tratto gastrointestinale e
vaginale e risultano i più frequenti agenti eziologici di una vasta
gamma di infezioni, come per esempio
Figura 6 Struttura esterna dei batteri Gram negativi [7]
infezioni urinarie, ginecologiche, polmonari
a = strato esterno / b = strato interno / c = membrana plasmatica
[6, 7].
d = parete lipoproteica / e = complesso polare di trasporto
f = lipide A: lipopolisaccaride / g = glicide
7
I bacilli Gram negativi utilizzati per questo studio sono stati della famiglia Enterobatteriaceae,
batterio Pseudomonas aeruginosa, batterio del genere Acinetobacter e batterio Stenotrophomonas
maltophilia.
3.2.2 Le Enterobatteriaceae
Le Enterobatteriaceae sono bacilli Gram negativi anaerobi facoltativi. Sono ossidasi negativi,
utilizzano il glucosio con un metabolismo di tipo fermentativo con o senza produzione di gas.
Le Enterobatteriaceae si trovano nell’intestino, come commensali, dell’uomo e degli animali. Sono
la famiglia batterica più importante in medicina. Diversi generi sono patogeni per l’uomo perché
provocano infezioni soprattutto di tipo gastroenterico e urinario. I principali batteri della famiglia
Enterobatteriaceae di interesse ospedaliero appartengono ai generi Escherichia, Citrobacter,
Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Hafnia, Proteus, Morganella e Providencia [8].
3.2.3 Pseudomonas aeruginosa
I batteri del genere Pseudomonas sono molto diffusi nel suolo, nelle acque, sulle piante e in
piccolo numero anche nell’intestino dell’uomo e degli animali. Pseudomonas aeruginosa è
strettamente aerobica e ossidasi positiva. Questa specie batterica è stata isolata in ambiente
ospedaliero da infezioni delle vie aeree. Questo batterio rimane problematico in ambito
nosocomiale per la resistenza intrinseca a differenti classi di antibiotici e per la capacità di acquisire
rapidamente resistenze per effetto di mutazioni in caso di trattamento [8].
3.2.4 Acinetobacter baumannii
I batteri del genere Acinetobacter sono immobili, aerobi stretti, ossidasi positivi. La specie più
importante per le infezioni ospedaliere è Acinetobacter baumannii. Questa specie causa infezioni
delle vie respiratorie ed urinarie, setticemie, ascessi cerebrali ed altre manifestazioni cliniche più
deboli. Gli isolati clinici di Acinetobacter presentano spesso un elevato livello di resistenza ai βlattamici dovuto alla produzione dell’enzima β-lattamasi o ad una ridotta permeabilità della
membrana esterna [9].
3.2.5 Stenotrophomonas maltophilia
specie più importante del genere Stenotrophomonas in ambiente ospedaliero è
Stenotrophomonas maltophilia. È aerobico ed ubiquitario (acqua, suolo, animali e piante).
La
Frequentemente ritrovato a livello della flora commensale dell’uomo. Può essere isolato, come
contaminante, nel cibo, nelle macchine per la fabbricazione del ghiaccio, negli umidificatori e in
diversi apparecchi ospedalieri. Può causare polmonite, meningite, sovrainfezione di ferite
chirurgiche, come pure infezioni urinarie, gastrointestinali e ossee. Anche Stenotrophomonas
maltophilia può diventare resistente a numerosi antibiotici. Il batterio riesce a produrre una βlattamasi e la sua membrana esterna è poco permeabile, conferendo la resistenza agli antibiotici
[10].
3.3 Gli antibiotici β-lattamici in medicina
Tutti gli antibiotici β-lattamici hanno in comune lo stesso anello β-lattamico
[Figura 7], [11]; la penicillina è stato il primo antibiotico β-lattamico
scoperto nel 1928 [12].
La funzione dei β-lattamici è quella di inibire la sintesi della parete della
cellula batterica, interferendo nella formazione dei legami peptidici tra le
molecole del peptidoglicano (proteina che costituisce la parete dei batteri
Gram negativi) che conferisce alla parete rigidità e resistenza alla
Figura 7 Anello β-lattamico [11]
lisi osmotica. La struttura sulla quale agisce l’anello β-lattamico è
8
chiamato proteina legante la penicillina (Penicillin Binding Protein, PBP) e contiene il sito attivo in
grado di legare l’antibiotico β-lattamico [13]. Nei batteri Gram negativi, tra la membrana esterna e
quella citoplasmatica, si trova lo spazio periplasmatico che è sede sia della parete del
peptidoglicano sia degli enzimi β-lattamasici, come penicillasi e cefalosporinasi, capaci di idrolizzare
l’anello β-lattamico degli antibiotici. L’organizzazione strutturale dei Gram negativi rende difficile
l’attacco da parte degli antibiotici β-lattamici, perché questi devono diffondere attraverso porine
presenti sulla membrana esterna per poter raggiungere le maglie di peptidoglicano e la membrana
citoplasmatica dove si trovano i siti bersaglio.
Gli antibiotici β-lattamici sono suddivisi in sei gruppi con le rispettive sottoclassi [Tabella 1] [14].
Tabella 1 Classificazione degli antibiotici β-lattamici [14]
CLASSE
SOTTOCLASSE
Penicilline
Aminopenicilline
Ureidopenicilline
Penicilline
Carbossipenicilline
Peniccillasi
Amidinopenicilline
Cefalosporine di prima generazione
Cefalosporine di seconda generazione
Cefalosporine di terza generazione
Cefemici
Cefalosporine di quarta generazione
Cefamicine
Oxacefemici
Cefalosporine
Cefemici (orali)
Carbapenemici
Monobattamici
Carbapenemici
Penemici
Penemici
β-lattamasi inibitori
-
9
3.4 Microrganismi multirestenti: MRSA e VRE
La diffusione di microrganismi patogeni multiresistenti costituisce un fenomeno in continua
evoluzione e rappresenta una crescente minaccia per l’ambiente ospedaliero.
Tra i batteri multiresistenti agli antibiotici, hanno assunto particolare rilevanza nell’ultimo decennio
gli MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus), i VRE (Vancomycin-Resistant Enterococcus)
e gli enterobatteri ESBL (Extended Spectrum β-Lactamases) [8].
Questi microrganismi sono oggetto di una sorveglianza epidemiologica per limitarne la
disseminazione. In tutti i casi l’applicazione delle misure standard di prevenzione, eseguita secondo
il servizio Igiene Ospedaliera EOC [13] come l’igiene delle mani, è essenziale. In situazioni
epidemiche sono messe in atto misure supplementari quali l’isolamento del paziente e la
decontaminazione selettiva dei pazienti [14, 15, 16].
Gli MRSA sono ceppi di Staphylococcus aureus che hanno sviluppato una resistenza alle penicilline
(meticillina, oxacillina, flucloxacillina). Sono responsabili di infezioni invasive (endocarditi,
meningiti, polmoniti, altro), cutaneo-mucose, urinarie e colonizzazione di corpi estranei (cateteri,
pace-makers, altro) [15, 16].
I batteri del genere Enterococcus sono riconosciuti sempre più come agenti patogeni causanti
infezioni urinarie, setticemie, infezioni di ferita ed endocarditi. Il problema delle infezioni
nosocomiali causate da Enterococchi è aggravato dal fatto che sempre più ceppi diventano
resistenti agli antibiotici glicopeptidici, come la vancomicina, e sono quindi difficili da curare. La
vancomicina, antibiotico appartenente a questa classe ed ottenuta da Streptomyces orientalis, è
utilizzata in caso di resistenza o allergia ad altri antibiotici, ma è inattiva contro batteri Gram
negativi e micobatteri [17].
3.5 Meccanismi di azione delle β-lattamasi
In presenza di β-lattamasi, i β-lattamici sono
idrolizzati nel sito attivo dell’enzima per la
presenza di un gruppo ossidrile presente nella
serina terminale della catena laterale della βlattamasi.
Si forma così un legame covalente e l’anello βFigura 8 Idrolisi da parte delle β-lattamsi [18]
lattamico è idrolizzato in presenza di una
molecola d’acqua, provocando l’apertura dell’anello β-lattamico e quindi inattivando l’antibiotico
[Figura 8], [19].
Sulla base delle sequenze aminoacidiche il sistema di classificazione di Ambler divide le β-lattamasi
in quattro gruppi. Il processo mediante serina terminale avviene con le β-lattamasi del gruppo A, C
e D. Per quanto riguarda il gruppo B l’enzima presenta nel sito attivo uno ione di zinco, ma il
principio è simile [20].
3.6 Meccanismi di resistenza ai β-lattamici
I più importanti e comuni meccanismi della resistenza agli antibiotici β-lattamici nei microrganismi
Gram negativi sono [19, 21, 22]:
1. diminuzione dell’assorbimento dell’antibiotico a livello citoplasmatico dovuta alla mutazione
delle proteine di membrana, questa modifica riduce il grado di penetrazione del β-lattamico,
2. alterazione del bersaglio dell’antibiotico, causato dalle alterazioni delle PBPs che portano ad
una minore affinità tra la proteina e l’antibiotico,
10
3. produzione di enzimi capaci di degradare o alterare il β-lattamico, le β-lattamasi, che
rappresentano il meccanismo principale della resistenza batterica agli antibiotici β-lattamici [19,
21].
3.7 Gli ESBL
Come le VRE e MRSA anche gli ESBL, che tradotto in italiano significa beta lattamasi a spettro
esteso (o allargato), hanno un’importanza particolare a causa dell’elevata probabilità d’insuccesso
del trattamento antibiotico. Questo conduce ad una mortalità elevata, il prolungamento
dell’ospedalizzazione ed un aumento dei costi [8].
Data l’importanza a livello terapeutico ospedaliero di ceppi produttori di ESBL, il CLSI (Clinical and
Laboratory Standards Institute, da www.clsi.org), raccomanda che i pazienti che hanno sviluppato
un’infezione da E-ESBL, siano documentati in modo tale da trasmettere questa informazione alle
strutture presso le quali il paziente dovrà essere trasferito o ricoverato in futuro [8].
Gli enzimi che idrolizzano l’anello β-lattamico degli antibiotici β-lattamici sono oggigiorno molto
importanti perché sono frequenti nei batteri Gram negativi, ed in particolare nelle
Enterobatteriaceae [21].
Questi enzimi idrolizzano e conferiscono resistenza agli antibiotici oximino-cefalosporine di seconda
e terza generazione. I geni che codificano per gli ESBL includono geni presenti in molti batteri
anche ambientali che hanno subito mutazioni, conferendo all’enzima la capacità di idrolizzare le
oximino-cefalosporine. Questi geni si trovano su plasmidi e sono designati dalle sigle blaTEM, blaSHV,
blaOXA, blaCTX-M [21].
Esistono altre importanti forme di resistenza ai β-lattamici che devono essere distinte da ESBL:
•
iperproduzione di AmpC (ampicillinasi C) cromosomica (Enterobacter spp.),
•
iperproduzione di AmpC plasmidico (Escherichia coli),
•
iperproduzione di K1 cromosomica (Klebsiella oxytoca),
•
resistenza efflusso-mediata (Pseudomonas aeruginosa),
•
resistenza con vari meccanismi (Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophilia) [21].
3.7.1 Epidemiologia
Gli ESBL sono osservati negli ospedali, in particolare nei servizi di cure intense, ma anche in
strutture di cura a lunga degenza.
Secondo gli studi, la durata media del soggiorno di un paziente dal momento di un’infezione da EESBL si allunga di 10-17 giorni.
Uno studio del 2004 [8] dimostra che gli ESBL possono anche essere responsabili di colonizzazioni
ed infezioni comunitarie. Nel corso di un periodo di 16 mesi sono stati isolati dei ceppi di
Escherichia coli produttori di ESBL da 49 pazienti ambulatoriali che mostravano sintomi di
un’infezione comune. Si trattava prevalentemente di persone anziane con infezioni urinarie. Il 22%
era portatore di una sonda e il 57% presentava ripetute infezioni urinarie. Il 67% dei pazienti
aveva ricevuto un antibiotico nei due mesi precedenti la diagnosi. I fattori di rischio per Escherichia
coli produttrici di ESBL erano l’età avanzata, il diabete, infezioni urinarie ripetute ed
un’ospedalizzazione nel corso dell’anno precedente.
Non sono disponibili dati europei o svizzeri per questo gruppo di pazienti, anche se il tasso di
colonizzazione in Svizzera e in Europa sembrerebbe più basso che altrove [8].
11
3.8 Caratterizzazione degli ESBL: TEM, SHV, OXA, CTX-M
BlaTEM, blaSHV, blaOXA e blaCTX-M sono geni che conferiscono al batterio il fenotipo ESBL. Si riscontrano
soprattutto in microrganismi della famiglia Enterobatteriaceae e sono responsabili della resistenza
ai β-lattamici.
•
TEM β-lattamasi: conferiscono resistenza all’ampicilina, alle penicilline ed alle cefalosporine e
sono spesso riscontrate in ceppi di Klebsiella pneumoniae.
•
Il tipo SHV dà resistenza agli antibiotici ceftazidima e cefotaxima, entrambe cefalosporine di
terza generazione, ed è predominante in ceppi di Klebsiella pneumoniae.
•
Le β-lattamasi tipo OXA conferiscono al batterio una resistenza all’ampicillina e alle cefalotine,
come pure all’oxacillina e alla cloxacillina. Sono riscontrate in ceppi di Escherichia coli e
Klebsiella pneumoniae.
•
Le CTX-M β-lattamasi danno resistenza a cefotaxima e ceftazidima, e sono riscontrate
soprattutto in ceppi di Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae [12].
3.8.1 AmpC
Le AmpC β-lattamasi sono delle cefalosporinasi clinicamente importanti. Sono codificate nei
cromosomi di molte Enterobatteriaceae e pochi altri microrganismi (Actinobacteria, Proteobacteria,
Oceanospirillales, Pseudomonadaceae e Xanthomonadaceae) [23]. In molti batteri gli enzimi AmpC
sono inducibili e possono essere espressi a livelli elevati in seguito a mutazioni nel promotore del
sistema di regolazione. La sovraespressione conferisce resistenza oltre che alle cefalosporine di
terza generazine, fra cui cefotaxima, ceftazidima e cefotriaxone anche alle cefalosporine di quarta
generazione (cefamicine). Questo rappresenta un problema soprattutto nel caso di infezioni
causate da Enterobacter aerogenes e Enterobacter cloacae. In queste specie, infatti, un ceppo
inizialmente sensibile può divenire resistente in seguito a terapia con gli antibiotici sopracitati.
Esistono plasmidi trasmissibili che hanno acquisito i geni per gli enzimi AmpC e che possono essere
espressi in batteri come Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Proteus mirabilis nei quali il gene
blaAmpC non è presente sul cromosoma o è solo scarsamente espresso. Per definizione i batteri
resistenti ai β-lattamici tramite l’enzima AmpC non sono considerati ESBL in quanto il gene blaAmpC
stesso non è mutato [24].
3.8.2 K1
Anche il gene K1 viene sovraespresso per deregolazione del gene cromosomico K1 o per
acquisizione di un gene trasferibile K1 su un plasmide o su altri elementi mobili. Quindi, quando la
β-lattamasi K1 iperprodotto (come l’AmpC), il batterio è resistente ai β-lattamici, ma,
normalmente, sensibile alla ceftazidima. L’iperproduzione di K1 viene espressa per la maggior
parte in ceppi di Klebsiella oxytoca. Come per l’AmpC, i batteri resistenti ai β-lattamici tramite il
gene K1 non sono definiti ESBL [12].
12
3.9 Rilevamento di ESBL all’ICM
3.9.1 Caratterizzazione fenotipica
Figura 9 Zona fantasma solo con PM/PML [25]
Il metodo che applica l’ICM per la conferma della diagnosi
fenotipica dei batteri produttori di ESBL è l’E-Test. È un
metodo commerciale quantitativo per la determinazione
della CMI (concentrazione minima inibente) di un singolo
agente antimicrobico nei confronti dei microrganismi e per
la determinazione della presenza di ESBL [Allegato 9].
Lo stipite sospetto per ESBL è generalmente segnalato in
automatico dall’apparecchio Phoenix [Allegato 7]. Nel
caso di un antibiogramma manuale, vi sono alcuni
antibiotici che servono da indicatori per ESBL, come
ceftazima (≤ 22 mm), cefotaxima (≤ 27 mm),
cefpodoxima (≤ 17 mm), ceftriaxone (≤25 mm) e
aztreonam (≤ 27 mm).
La conferma viene eseguita con E-Test per ESBL, una
combinazione di strisce contenenti un antibiotico
cefotaxima (CT), cefepime (PM), ceftazidima (TZ) ed una
combinazine degli stessi antibiotici con un inibitore, l’acido
clavulanico: CTL, PML, TZL.
L’interpretazione dei valori delle CMI si basa, in linea di principio, sui criteri emessi dal CLSI. La
CMI va letta nel punto di completa inibizione della crescita, considerando anche piccole colonie e
colonie isolate. Il risultato emesso è dato in µg/ml con l’interpretazione sensibile, intermedio o
resistente. Il rapporto tra l’antibiotico e antibiotico con acido clavulanico deve essere ≥ 8 µg/ml. La
produzione di enzimi ESBL è confermata quando nel test appare una zona “fantasma”, così
chiamata in quanto assume la forma di un fantasma [Allegato 6].
Nella figura 9 si nota che ceftazidima (TZ) e cefotaxima (CT) non sono attivi sul ceppo batterico
testato, come pure la combinazione degli stessi antibiotici con l’inibitore di β-lattamasi acido
clavulanico (TZL e CTL rispettivamente).
Nel caso della cefepime (PM) il rapporto tra i valori di CMI letti con e senza acido clavulanico
(striscio centrale nella figura) dà un valore superiore a 8 µg/ml. Il ceppo batterico viene quindi
considerato essere produttore di ESBL.
3.9.2 Caratterizzazione genotipica
Il metodo che è stato applicato all’ICM per la diagnosi genotipica dei batteri produttori di ESBL è
una PCR Multiplex che permette di determinare la presenza ed il tipo di gene di resistenza tramite
primer specifici [26].
13
4. MATERIALI E METODI
4.1 Piastre
Qui di seguito vengono elencate le piastre utilizzate in questo lavoro:
•
ChromIDTM ESBL Agar [2]
Piastra pronta per l’uso della ditta Biomérieux, Avenue Banc 51, 1211 Genève,
ref. 43481, lotto 827027801/828522501.
Composizione terreno (g/l acqua demineralizzata):
peptoni (suini o bovini) (17.2 g), l. triptofano (0.9 g), tampone Hepes (0.4 g), miscela
cromogena (6.87 g), miscela selettiva (0.38 g), agar (18.0 g), miscela di antibiotici tra cui
cefpodoxima (0.004 g).
•
BLSE Agar [3]
Doppia piastra pronta per l’uso della ditta Axon Lab AG, Täfernstrasse 15, 5405 Baden,
ref. AEB525770, lotto 830437/900718.
Composizione terreno (g/l acqua demineralizzata):
Mac Conkey agar [Allegato 3] (50.0 g), ceftazidima (0.002 g) / Drigalski agar [Allegato 4] (51.0
g), cefotaxima (0.0015 g).
•
EbSA Agar [4]
Doppia piastra pronta per l’uso della ditta Alpha Omega Development-Production B.V,
Gentsestraat 225-2587 HR’Gravenhage, Netherlands, ref. 120990, lotto 69924/6010.
Composizione terreno (g/l acqua demineralizzata):
Mac Conkey agar (14.0 g), cefotaxima (0.001 g), cloxacillina (0.4 g), vancomincina (0.064 g) /
Mac Conkey agar (14.0 g), ceftazidima (0.001 g), cloxacillina (0.4 g), vancomicina (0.064 g).
•
CIVA Agar [5]
Piastra preparata all’istituto cantonale di microbiologia, Bellinzona.
Composizione terreno (g/l acqua demineralizzata con Milli-Q Academic System):
peptone di caseina digerita con pancreas (ditta Fluka Analytical, 500 g, ref. 70169, lotto
1398993) (11.0 g), estratto di carne bovina (ditta BD, 500 g, ref. 212610, lotto 7088076) (3.0
g), Myo – inositolo (ditta Fluka Analytical, 500 g, ref. 57570, lotto 1250799) (12.0 g), cloruro di
sodio (ditta Fluka Biochemika, 1 kg, ref. 71376, lotto 1344323) (8.5 g), blu di bromotimolo
(ditta Riedel-de Haen, 5 g, ref. 32714, lotto 61080) (0.03 g), agar batteriologico (Agar no. 1)
(ditta Oxoid, 500 g, ref. LP0011, lotto 994025-02) (17.0 g), Fortam (ceftazidima) (ditta
GlaxoWellcome, 1 g, ref. E0759301, lotto 6N941) (0.002 g), vancomycin hydrocloride from
Streptomyces orientalis (ditta Fluka Analytical, 250 mg, ref. 94747, lotto 1406533) (0.01 g),
amphotericin B from Streptomyces ssp (ditta Fluka Analytical, 50 mg, ref. 10042, lotto
1348127) (0.0045 g).
I costi di materiale per le piastre sono:
• ChromIDTM ESBL Agar CHF 2.40
• BLSE Agar
CHF 4.03
• EbSA Agar
CHF 3.00
• CIVA Agar
CHF 1.00
14
4.2 Microrganismi
I ceppi batterici ed i materiali biologici sono elencati nella tabella 2 e 3.
•
della famiglia Enterobatteriaceae, Xanthomonadaceae specie
Stenotrophomonas maltophilia, Moraxellaceae specie del genere Acinetobacter e
Pseudomonadaceae specie Pseudomonas aeruginosa.
Collezione
di
49
ceppi
Tabella 2 Ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae, Xanthomonadaceae, Moraxellaceae e Pseudomonadaceae provenienti
dall’ICM. I ceppi numero ATCC 25922 e ATCC 700603 sono considerati controlli di qualità e la NCCLS (National Committee for Clinical
Laboratory Standards) li raccomanda nei test di conferma per ESBL. Sono del marchio ATCC (American Type Culture Collection) [2].
CEPPO
SPECIE
CEPPO
SPECIE
CEPPO
SPECIE
10/07
Escherichia coli
0S62
Escherichia coli
51/08
Proteus mirabilis
05/07
Escherichia coli
0S184
Escherichia coli
Amp73
Proteus mirabilis
27/07
Escherichia coli
78/08
Klebsiella oxytoca
0S14
Citrobacter freundii
90/07
Escherichia coli
123/08
Klebsiella oxytoca
0S255
Citrobacter freundii
89/07
Escherichia coli
34/08
Klebsiella oxytoca
0S565
Citrobacter freundii
94/07
Escherichia coli
55/07
Klebsiella oxytoca
65/06
Stenotrophomonas maltophilia
100/07
Escherichia coli
56/07
Klebsiella oxytoca
E8137
Stenotrophomonas maltophilia
84/07
Escherichia coli
87/07
Klebsiella pneumoniae
10/09
Stenotrophomonas maltophilia
47/07
Escherichia coli
04/07
Klebsiella pneumoniae
11/09
Stenotrophomonas maltophilia
12/07
Escherichia coli
73/07
Klebsiella pneumoniae
12/09
Stenotrophomonas maltophilia
13/07
Escherichia coli
ATCC 700603
Klebsiella pneumoniae
13/09
Stenotrophomonas maltophilia
14/07
Escherichia coli
72/06
Enterobacter sakazakii
132/06
Acinetobacter baumannii
16/07
Escherichia coli
0S688
Enterobacter aerogenes
AC49
Acinetobacter spp.
22/07
Escherichia coli
93/05
Enterobacter cloacae
AC48
Acinetobacter johnsonii
32/07
Escherichia coli
0S46
Enterobacter cloacae
AC43
Acinetobacter iwoffi
40/07
Escherichia coli
0S128
Enterobacter cloacae
AC39
Acinetobacter baumannii
51/07
Escherichia coli
50/07
Bacillo gram negativo NE
AC37
Acinetobacter baumannii
88/07
Escherichia coli
74/07
Salmonella spp.
U7904
Pseudomonas aeruginosa
58/07
Escherichia coli
0S91
Hafnia alvei
7881
Pseudomonas aeruginosa
U34313
Escherichia coli
0S29
Serratia liquefaciens
7885
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 25922 Escherichia coli
0S453
Serratia marcescens
7543
Pseudomonas aeruginosa
U31142
Proteus mirabilis
8395
Pseudomonas aeruginosa
0S438
Escherichia coli
15
•
32 materiali biologici inseminati all’ICM, provenienti da strutture sanitarie del canton Ticino.
Tabella 3 Materiali biologici inseminati all’ICM.
NUMERO
MATERIALE
NUMERO
MATERIALE
R7819
Espettorato
VA9018
Ferita profonda
R5119
Espettorato
VA3868
Striscio ulcera
R40108
Espettorato indotto
G3431
Striscio uretrale
R40103
Espettorato indotto
G7278
Striscio vaginale
R37476
Aspirato bronchiale
U4979
Uricult
R5961
Aspirato bronchiale
U4403
Uricult
R3329
Aspirato bronchiale
U4370
Uricult
VA34331
Puntato easy flow drenaggio
U4944
Uricult
VA38021
Puntato ginocchio
U4397
Uricult
VA38020
Puntato drenaggio
U4931
Uricult
VA8758
Puntato
F5177
Feci
VA3068
Ferita superficiale
F5088
Feci
VA7727
Ferita superficiale
F5086
Feci
VA8741
Ferita superficiale
F5169
Feci
VA7259
Striscio ferita profonda
F5199
Feci
VA5620
Striscio ferita profonda
F5016
Feci
4.3 Produzione della piastra CIVA Agar [5]
Sono state pesate le sostanze indicate nel capitolo 4.1 con la bilancia analitica (Mettler Toledo
PG6002-S) per versarli in una bottiglia da un litro contenente il miscelatore magnetico senza
l’aggiunta di antibiotici.
È stato preriscaldato una certa quantità d’acqua demineralizzata inferiore ad un litro per 4 minuti
nel microonde. L’acqua è stata versata nella bottiglia. Il contenuto è stato mescolato con
l’agitatore magnetico per 15 minuti, allo scopo di sciogliere i reagenti. La soluzione è stata poi
portata alla quantità di un litro e con la sua striscia TST Control [Figura 10] collocata
nell’autoclave. L’autoclave (Fedegari Autoclavi SPA, serie FOB) ha mantenuto la temperatura di
121 °C per 15 minuti poi la temperatura è diminuita fino a 80°C. Dopo circa un’ora, alla fine del
ciclo di sterilizzazione, è stato controllato che l’indicatore TST Control sia virato da giallo a blu,
indicando che il processo di sterilizzazione è avvenuto correttamente [Figura 11].
Figura 10 TST Control prima della sterilizzazione
Figura 11 TST Control dopo la sterilizzazione
La soluzione è stata mescolata con l’agitatore magnetico fino a raggiungere una temperatura
inferiore a 50°C. I tre a antibiotici sono stati pesati e disciolti in 3 mL di acqua sterile
demineralizzata, per essere poi versati nella bottiglia da un litro, sterilizzando ogni volta il bordo
della bottiglia e coprendo con carta alu.
16
La bottiglia è stata lasciata raffreddare con l’agitatore magnetico per un’ora circa. Le piastre sono
state riempite con l’aiuto dell’apparecchio e tubo sterile e lasciate solidificare fino al giorno
seguente.
4.4 Ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae produttori e
non di ESBL e ceppi non Enterobatteriaceae
Nella prima parte del lavoro è stata testata una collezione di 49 ceppi batterici della famiglia
Enterobatteriaceae [Tabella 2], provenienti da pazienti ospedalizzati in Ticino, con fenotipo ESBL
positivo o negativo precedentemente testati tramite E-Test [Allegato 6] e conservati nella
ceppoteca all’ICM. È stata pure testata una collezione di 17 ceppi non Enterobatteriaceae
(Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa e specie del genere Acinetobacter)
provenienti dalla ceppoteca dell’ICM non testati con E-Test.
Per avere colture fresche i 66 ceppi batterici, congelati a -80 °C nel terreno di conservazione Skim
Milk [Allegato 1], sono stati scongelati e trapiantati su piastre non selettive Agar sangue [Allegato
2] ed incubate a 37°C per 24 ore, prima di iniziare il confronto delle quattro piastre.
Di ogni ceppo batterico è stata presa una colonia dall’Agar sangue ed inseminata direttamente
sulle quattro differenti piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, CIVA Agar ed EbSA Agar.
4.4.1 Organizzazione del lavoro per i ceppi batterici
•
•
•
•
•
•
•
Produzione della piastra CIVA Agar.
Coltivazione dei 66 ceppi batterici su Agar sangue.
Inseminazione di una colonia batterica, prelevata da Agar sangue, sulle quattro differenti
piastre: ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e CIVA Agar.
Prima incubazione in aereobiosi a 37°C.
Prima lettura delle piastre dopo 24 ore.
Seconda incubazione in aereobiosi a 37°C.
Seconda lettura delle piastre dopo 48 ore.
4.5 Messa in evidenza di batteri produttori di ESBL a partire da
materiali biologici
In un secondo tempo, le piastre di coltura selezionate sono state testate utilizzando un totale di 32
materiali biologici [Tabella 3] di diversa natura provenienti da strutture sanitarie del canton Ticino,
cioè 9 strisci, 4 puntati, 7 campioni di secrezioni respiratorie, 6 campioni uricult e 6 campioni di
feci, nei quali le analisi precedentemente eseguite dal reparto di batteriologia dell’ICM hanno
messo in evidenza la presenza di ceppi batterici produttori di ESBL.
4.5.1 Uricult
Dall’uricult, dal terreno Agar Cled [27] è stata presa un’ansata di colonie batteriche, sospese e
vortexate in 5 ml di NaCl 0.9%. La sospensione di colonie è stata inseminata sulle quattro piastre
in esame: ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, CIVA Agar e EbSA Agar.
17
4.5.2 Feci
Si sono presi in considerazione 6 campioni di feci [Tabella 3], dal reparto di batteriologia, per
verificare l’influsso di eventuali batteri della flora commensale sul rilevamento di E-ESBL nelle varie
piastre.
Dapprima i campioni sono stati inseminati direttamente sulle piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE
Agar, CIVA Agar ed EbSA Agar. Dopo incubazione di 24 e 48 ore i quattro terreni presentavano
diverse colonie. Le colonie morfologicamente diverse sono state isolate su Agar sangue [Allegato
2] e Mac Conkey [Allegato 3] e messe ad incubare a 37°C per 24 ore per ottenere colonie pure.
Dopodiché è stato eseguito il test dell’ossidasi [Allegato 5] dall’Agar sangue, allo scopo di
distinguere le Enterobatteriaceae da non Enterobatteriaceae. In seguito i singoli ceppi batterici
sono stati analizzati mediante Phoenix Epicenter (BD) [Allegato 7] per l’identificazione rapida e la
determinazione della sensibilità antimicrobica dei batteri. Per l’identificazione della specie batterica
i batteri sono stati pure analizzati con MALDI-TOF MS (AXIMA) (Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry) [Allegato 8] mediante la spettrometria di massa.
L’E-Test [Allegato 6] è stato eseguito come da direttive ICM.
4.5.3 Secrezioni respiratorie, puntati e strisci
L’inseminazione è stata eseguita applicando il materiale biologico direttamente sulle piastre
ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, CIVA Agar e EbSA Agar.
4.5.4 Organizzazione del lavoro per i materiali biologici
•
•
•
•
•
•
•
Produzione della piastra CIVA Agar.
Sospensione del materiale dal terreno Cled dei 6 campioni di Uricult in NaCl.
Inseminazione dei rispettivi materiali biologici direttamente sulle quattro differenti piastre:
ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e CIVA Agar.
Prima incubazione in aereobiosi a 37°C.
Prima lettura delle piastre dopo 24 ore.
Seconda incubazione in aereobiosi a 37°C.
Seconda lettura delle piastre dopo 48 ore.
18
5. RISULTATI
5.1 Caratteristiche delle colonie sulle piastre
Nella tabella 4 sono elencate le caratteristiche delle colonie che crescono sulle piastre ChromIDTM
ESBL Agar [2], BLSE Agar [3] e CIVA Agar [5], secondo i prospetti forniti dalle rispettive ditte.
La piastra EbSA Agar [4] non possiede alcuna particolarità che può differenziare un particolare
ceppo batterico. Le colonie, se presenti, sono di colore rosa.
Tabella 4 Caratteristiche delle colonie per le piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar e CIVA Agar
ChromIDTM ESBL Agar
COLORE E CARATTERISTICA COLONIE GENERE-SPECIE BATTERIO
Rosa-bordeaux
Verde, verde tendente al marrone o blu
Marrone chiaro a marrone scuro
Giallo
Blu
Mac Conkey
Agar
Rosa
Bianco a incolore
CIVA Agar
BLSE Agar
Drigalski Agar
Giallo - Estremamente mucose
Incolore - Larghe, piatte
Giallo
Giallo pallido
Incolore - Opache
Incolore - Larghe
Escherichia coli
GRUPPO KESC:
Klebsiella
Enterobacter
Serratia
Citrobacter
Proteus
Providencia
Morganella
Escherichia coli
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Altre Enterobatteriaceae
Pseudomonas
Escherichia coli
Klebsiella spp.
Enterobacter spp.
Altre Enterobatteriaceae
Pseudomonas
Klebsiella spp.
Escherichia coli
Enterobacter spp.
Serratia spp.
Citrobacter koseri
Proteus vulgaris
19
5.2 Campioni
Nelle tabelle 5 e 6 sono riportati i risultati ottenuti dalle piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar,
CIVA Agar ed EbSA Agar che sono state inoculate con la collezione di 49 ceppi batterici della
famiglia Enterobatteriaceae e con i 32 materiali biologici.
Tabella 5
Risultati delle piastre utilizzando una collezione di ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae dell’ICM
ROSSO
NERO
CEPPO
positivo per ESBL
negativo per ESBL
SPECIE BATTERICA
Escherichia coli
10/07
Escherichia coli
05/07
27/07
Escherichia coli
90/07
Escherichia coli
Escherichia coli
89/07
Escherichia coli
94/07
100/07
Escherichia coli
Escherichia coli
84/07
Escherichia coli
47/07
12/07
Escherichia coli
Escherichia coli
13/07
14/07
Escherichia coli
Escherichia coli
16/07
Escherichia coli
22/07
Escherichia coli
32/07
Escherichia coli
40/07
Escherichia coli
51/07
Escherichia coli
88/07
Escherichia coli
58/07
Escherichia coli
U34313
Escherichia coli
ATCC 25922
Escherichia coli
0S438
0S62
Escherichia coli
Escherichia coli
0S184
Klebsiella oxytoca
78/08
123/08
Klebsiella oxytoca
Klebsiella oxytoca
34/08
Klebsiella oxytoca
55/07
Klebsiella oxytoca
56/07
87/07
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
04/07
Klebsiella pneumoniae
73/07
ATCC 700603 Klebsiella pneumoniae
72/06
Enterobacter sakazakii
Enterobacter aerogenes
0S688
Enterobacter cloacae
93/05
Enterobacter cloacae
0S46
Enterobacter cloacae
0S128
50/07
Bacillo Gram negativo NE
Salmonella spp.
74/07
Hafnia alvei
0S91
0S29
Serratia liquefaciens
Serratia marcescens
0S453
Proteus mirabilis
U31142
Proteus mirabilis
51/08
Amp73
Proteus mirabilis
Citrobacter freundii
0S14
0S255
Citrobacter freundii
Citrobacter freundii
0S565
E-TEST
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CIVA Agar
ChromIDTM ESBL Agar
BLSE Agar
EbSA Agar
24 ORE
48 ORE 24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE
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NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
POS
POS
POS
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POS
POS
POS
POS
POS
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POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
20
Tabella 6
Risultati delle piastre utilizzando 32 materiali biologici testati all’ICM
ROSSO
NERO
NUMERO
positivo per ESBL
negativo per ESBL
MATERIALE
SPECIE ISOLATA
E-TEST
Escherichia coli
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Escherichia coli
Providencia stuartii
Providencia stuartii
R7819
Espettorato
R5119
Espettorato
R40108
Espettorato indotto
R40103
Espettorato indotto
R37476
Aspirato bronchiale
R5961
R3329
Aspirato bronchiale
Aspirato bronchiale
VA34331
Puntato easy flow
drenaggio
VA38021
VA38020
VA8758
VA3068
VA7727
VA8741
Puntato ginocchio
Puntato drenaggio
Puntato
Ferita superficiale
Ferita superficiale
Ferita superficiale
VA7259
Striscio ferita profonda
Escherichia coli (POS)
Citrobacter freundii (NEG)
Proteus mirabilis
Enterobacter cloacae
Stenotrophomonas
maltophilia
Enterobacter cloacae
Klebsiella oxytoca
Klebsiella oxytoca
Enterobacter cloacae
Citrobacter freundii
Citrobacter freundii
Enterobacter cloacae
Escherichia coli (POS)
Morganella morganii
ChromIDTM ESBL Agar
BLSE Agar
CIVA Agar
EbSA Agar
NEG
24 ORE
NEG
48 ORE
NEG
24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
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POS
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POS
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POS
POS
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NEG
POS
NEG
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POS
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POS
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NEG
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POS
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POS
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POS
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POS
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NEG
NEG
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NEG
NEG
POS
POS
NEG
NEG
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NEG
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NEG
NEG
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POS
POS
POS
NEG
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NEG
POS
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NEG
NEG
NEG
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NEG
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NEG
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NEG
POS
POS
NEG
NEG
POS
NEG
POS
POS
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
POS
POS
(NEG)
Striscio ferita profonda
Enterobacter aerogenes
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
VA9018
Ferita profonda
Achromobacter xyloxians
Staphylococcus aureus
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
VA3868
G3431
G7278
U4979
U4403
U4370
U4944
U4397
Striscio ulcera
Striscio uretrale
Striscio vaginale
Uricult
Uricult
Uricult
Uricult
Uricult
POS
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
POS
POS
U4931
Uricult
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
F5177
Feci
NEG
NEG
POS
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
NEG
POS
NEG
NEG
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
VA5620
F5088
Feci
F5086
Feci
F5169
Feci
F5199
F5016
Feci
Feci
Escherichia coli
Enterobacter aerogenes
Escherichia coli
Escherichia coli
Escherichia coli
Citrobacter freundii
Enterobacter cloacae
Enterobacter cloacae
Hafnia alvei
Klebsiella pneumoniae
Enterococcus faecium
Hafnia alvei
Citrobacter freundii
Stenotrophomonas
maltophilia
Pseudomonas aeruginosa
Hafnia alvei
Morganella morganii
Morganella morganii
Citrobacter freundii
Pseudomonas aeruginosa
Enterobacter cloacae
21
Nella tabella 7 sono riportati i risultati ottenuti dalle piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar,
CIVA Agar ed EbSA Agar che sono state inseminate con la collezione di 17 ceppi batterici della
famiglia non Enterobatteriaceae [Tabella 2] dell’ICM senza confrontarli con il metodo di referenza
E-Test in quanto non si esegue di routine per questi microrganismi.
Tabella 7
Risultati delle piastre utilizzando una collezione di ceppi batterici della famiglia non Enterobatteriaceae dell’ICM.
ROSSO
NERO
positivo per ESBL
negativo per ESBL
CEPPO
SPECIE BATTERICA
65/06
Stenotrophomonas maltophilia
Stenotrophomonas maltophilia
Stenotrophomonas maltophilia
Stenotrophomonas maltophilia
Stenotrophomonas maltophilia
Stenotrophomonas maltophilia
Acinetobacter baumannii
Acinetobacter spp
Acinetobacter johnsonii
Acinetobacter iwoffi
Acinetobacter baumannii
Acinetobacter baumannii
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
E8137
10/09
11/09
12/09
13/09
132/06
AC49
AC48
AC43
AC39
AC37
U7904
R7881
R7885
R7543
R8395
BLSE Agar
CIVA Agar
EbSA Agar
ChromIDTM ESBL Agar
24 ORE
48 ORE
24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE 24 ORE 48 ORE
POS
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
POS
POS
NEG
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
5.3 Tempo di incubazione 24 o 48 ore
Su 49 ceppi batterici Enterobatteriaceae, la piastra ChromIDTM ESBL Agar ha mostrato 6 ulteriori
batteri positivi dopo 48 ore; la BLSE Agar e CIVA Agar ne ha mostrato 2 e la EbSA Agar non ha
mostrato nessun cambiamento.
Su 32 materiali biologici, la piastra ChromIDTM ESBL Agar e BLSE Agar hanno dato entrambe un
ulteriore positività dopo 48 ore; la CIVA Agar ne ha date 4 e la EbSA Agar, ancora una volta,
nessun cambiamento.
La piastra EbSA Agar è l’unica che non è influenzata dopo un maggiore tempo di incubazione.
5.4 Risultati ottenuti con le piastre
Per analizzare i terreni di coltura, è stata valutata la specificità e sensitività e sono state calcolate
le rispettive PPV (positive predictive value) e NPV (negative predictive value), ossia le valutazioni
predittive positive e negative concernenti i 49 ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae
[Tabella 8, 10, 12, 14] e i 32 materiali biologici [Tabella 9, 11, 13, 15], il tutto confrontato con il
metodo di referenza E-Test. La specificità è calcolata dividendo i veri negativi per la somma di veri
negativi e falsi positivi. La sensitività è calcolata dividendo i veri positivi per la somma di veri
positivi e falsi negativi. Il PPV è calcolato dividendo i veri positivi per la somma di veri positivi e
falsi positivi. L’NPV è calcolato dividendo i veri negativi per la somma di veri negativi e falsi
negativi.
22
5.4.1 Risultati ottenuti con ChromIDTM ESBL Agar
Tabella 8 Tabella di specificità e sensitività per la piastra
ChromIDTM ESBL Agar riguardanti i ceppi batterici
Tabella 9 Tabella di specificità e sensitività per la piastra
ChromIDTM ESBL Agar riguardanti i materiali biologici
E-Test
Positivi
Negativi
24h / 48h
24h / 48 h
31 / 33
5/9
Falsi negativi Veri negativi
24h / 48h
24h / 48h
2/0
11 / 7
Positivi
Falsi positivi
Negativi
Veri positivi
ChromIDTM ESBL Agar
Positivi
Negativi
ChromIDTM ESBL Agar
E-Test
Positivi
Negativi
Veri positivi
Falsi positivi
24h / 48h
24h / 48h
12 / 12
10 / 11
Falsi negativi Veri negativi
24h / 48h
24h / 48h
1/1
9/8
Specificità: 24 ore: 69% 48 ore: 44%
Sensitività: 24 ore: 94% 48 ore: 100%
Specificità: 24 ore: 47% 48 ore: 42%
Sensitività: 24 ore: 92% 48 ore: 92%
PPV:
NPV:
PPV:
NPV:
24 ore: 86% 48 ore: 79%
24 ore: 85% 48 ore: 100%
24 ore: 55% 48 ore: 52%
24 ore: 90% 48 ore: 89%
5.4.2 Risultati ottenuti con BLSE Agar
Tabella 11 Tabella di specificità e sensitività per la piastra
BLSE Agar riguardanti i materiali biologici
E-Test
Positivi
Negativi
Veri positivi Falsi positivi
Veri positivi Falsi positivi
24h / 48h
32 / 33
8/9
Falsi negativi Veri negativi
24h / 48h
24h / 48h
1/0
8/7
Negativi
24h / 48h
Positivi
E-Test
Positivi
Negativi
BLSE Agar
Positivi
Negativi
BLSE Agar
Tabella 10 Tabella di specificità e sensitività per la piastra
BLSE Agar riguardanti i ceppi batterici
24h / 48h
24h / 48h
13 / 13
12 / 13
Falsi negativi Veri negativi
24h / 48h
24h / 48h
0/0
7 /6
Specificità: 24 ore: 50% 48 ore: 44%
Sensitività: 24 ore: 97% 48 ore: 100%
Specificità:
Sensitività:
24 ore: 37% 48 ore: 32%
24 ore: 100% 48 ore: 100%
PPV:
NPV:
PPV:
NPV:
24 ore: 52% 48 ore: 50%
24 ore: 100% 48 ore: 100%
24 ore: 80% 48 ore: 79%
24 ore: 89% 48 ore: 100%
23
5.4.3 Risultati ottenuti con EbSA Agar
Tabella 13 Tabella di specificità e sensitività per la piastra
EbSA Agar riguardanti i materiali biologici
E-Test
Positivi
Negativi
Veri positivi Falsi positivi
Veri positivi Falsi positivi
24h / 48h
30 / 30
2/2
Falsi negativi Veri negativi
24h / 48h
24h / 48h
3/3
14 / 14
Negativi
24h / 48h
Positivi
E-Test
Positivi
Negativi
EbSA Agar
Positivi
Negativi
EbSA Agar
Tabella 12 Tabella di specificità e sensitività per la piastra
EbSA Agar riguardanti i ceppi batterici
24h / 48h
24h / 48h
11 / 11
9/9
Falsi negativi Veri negativi
24h / 48h
24h / 48h
2/2
10 / 10
Specificità: 24 ore: 88% 48 ore: 88%
Sensitività: 24 ore: 91% 48 ore: 91%
Specificità: 24 ore: 53% 48 ore: 53%
Sensitività: 24 ore: 85% 48 ore: 85%
PPV:
NPV:
PPV:
NPV:
24 ore: 93% 48 ore: 93%
24 ore: 82% 48 ore: 82%
24 ore: 55% 48 ore: 55%
24 ore: 83% 48 ore: 83%
5.4.4 Risultati ottenuti con CIVA Agar
Tabella 15 Tabella di specificità e sensitività per la piastra
CIVA Agar riguardanti i materiali biologici
E-Test
Positivi
Negativi
Veri positivi Falsi positivi
Veri positivi Falsi positivi
24h / 48h
24 / 26
6/6
Falsi negativi Veri negativi
24h / 48h
24h / 48h
9/7
10 / 10
Negativi
24h / 48h
Positivi
E-Test
Positivi
Negativi
CIVA Agar
Positivi
Negativi
CIVA Agar
Tabella 14 Tabella di specificità e sensitività per la piastra
CIVA Agar riguardanti i ceppi batterici
24h / 48h
24h / 48h
9 / 11
10 / 12
Falsi negativi Veri negativi
24h / 48h
24h / 48h
4/2
9/7
Specificità: 24 ore: 63% 48 ore: 63%
Sensitività: 24 ore: 73% 48 ore: 79%
Specificità: 24 ore: 47% 48 ore: 37%
Sensitività: 24 ore: 69% 48 ore: 85%
PPV:
NPV:
PPV:
NPV:
24 ore: 80% 48 ore: 82%
24 ore: 53% 48 ore: 59%
24 ore: 47% 48 ore: 48%
24 ore: 69% 48 ore: 78%
24
6. DISCUSSIONE
6.1 Sensitività e specificità
Dal punto di vista diagnostico di laboratorio, per questo studio la sensitività e la specificità sono
parametri impiegati per valutare la capacità di individuare l’esistenza di un terreno di crescita
migliore tra le piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, CIVA Agar ed EbSA Agar, come pure
valutare la reale presenza di batteri produttori di ESBL nei materiali biologici di pazienti.
La sensitività rappresenta la probabilità che il test sia positivo in caso di effettiva presenza di ceppo
batterico di ESBL: più alta è la sensitività, meno falsi negativi esistono.
La specificità rappresenta la probabilità che il test sia negativo in caso di effettiva non presenza di
ceppo batterico di ESBL e più alta è la specificità, meno falsi positivi ci sono.
6.2 PPV (positive predictive value) e NPV (negative predictive
value)
I parametri PPV e l’NPV sono stati calcolati per avere i risultati completi dello studio anche dal
punto di vista della diagnosi di laboratorio. Infatti il PPV e l’NPV aiutano a valutare da un punto di
vista statistico i terreni selettivi di studio.
6.3 Ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae
6.3.1 Interpretazione dei risultati ottenuti
La collezione dei 49 ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae dell’ICM sono state testate con
le quattro piastre di studio e confrontate con metodo di referenza E-Test dell’ICM.
La seguente tabella rappresenta un riassunto dei risultati ottenuti con le quattro piastre:
Tabella 16 Tabella riassuntiva dei risultati ottenuti con le piastre per i ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae
ChromIDT M ESBL Agar
2.40
BLSE Agar
4.03
EbSA Agar
3.00
CIVA Agar
1.00
18 / 24 ore
24 ore
18 / 24 ore
24 ore
Tempo di incubazione
eseguito per questo studio
24 / 48 ore
24 / 48 ore
24 / 48 ore
24 / 48 ore
Specificità
Sensitività
PPV
NPV
69% / 44%
94% / 100%
86% / 79%
85% / 100%
50% / 44%
97% / 100%
80% / 79%
89% / 100%
88 % / 88%
91% / 91%
93% / 93%
82% / 82%
63% /
73% /
80% /
53% /
Costo (CHF) per piastra
Tempo di incubazione
consigliato da
ditte/pubblicazioni
63%
79%
82%
59%
La sensitività della piastra ChromIDTM ESBL Agar e BLSE Agar sono ottime, in quanto riescono ad
evitare tutti i falsi negativi dopo 48 ore di incubazione. Queste due piastre riescono a rilevare tutti i
veri positivi di Enterobatteriaceae produttrici di ESBL. La piastra EbSA Agar risulta avere una buona
sensitività e la piastra CIVA Agar è quella che mostra maggior numero falsi negativi rispetto alle
altre tre piastre.
La piastra EbSA Agar è l’unica che presenta una buona specificità. Le altre tre piastre hanno dato
più falsi positivi rispetto alla EbSA Agar, abbassando in modo elevato la specificità.
25
Gli ulteriori meccanismi di resistenza agli antibiotici presenti nelle piastre hanno permesso la
crescita delle colonie sulle piastre, facendo diminuire la specificità.
6.3.2 Identificazione a livello di specie batterica
Oltre al rilevamento di Enterobatteriaceae produttrici di ESBL, le ditte fornitrici di piastre
ChromIDTM ESBL Agar [2], BLSE Agar [3] e uno studio che concerne la piastra CIVA Agar [5]
confermano la possibilità di identificare la specie o genere batterica macroscopicamente.
Dei 49 ceppi della famiglia Enterobatteriaceae le colonie cresciute sulle piastre hanno dato il
seguente risultato:
•
92% per la ChromIDTM ESBL Agar; 37 ceppi sono cresciuti, di cui 34 hanno presentato le
caratteristiche di crescita da poterle identificare a livello di genere o gruppi di generi batterici.
Sono stati individuati 18 ceppi batterici Escherichia coli, 13 ceppi batterici gruppo KESC, 3 ceppi
batterici genere Proteus.
•
85% per la BLSE Agar; 40 ceppi sono cresciuti, di cui 34 hanno presentato le caratteristiche di
crescita da poterle identificare a livello di genere o gruppi di generi batterici.
Sono stati individuati 29 ceppi batterici del gruppo Escherichia coli, Klebsiella e Enterobacter, 5
ceppi batterici di altri germi appartenenti alla famiglia Enterobatteriaceae e della famiglia
Pseudomonadaceae.
•
43% per la CIVA Agar; 30 sono cresciuti, di cui 13 hanno presentato le caratteristiche di
crescita da poterle identificare a livello di specie o genere batterica.
Sono stati individuati 9 ceppi batterici della specie Escherichia coli e 4 ceppi batterici del genere
Klebsiella.
La piastra che ha dato maggiore possibilità di identificare il tipo di batterio è stata la ChromIDTM
ESBL Agar.
6.3.3 Possibilità di discriminare bacilli Gram negativi non Enterobatteriaceae
Abbiamo pure analizzato alcuni ceppi batterici della famiglia Xanthomonadaceae, Moraxellaceae e
Pseudomonadaceae [Tabella 2], per verificare la possibilità di discriminare bacilli Gram negativi
non Enterobatteriaceae. Sono stati presi in esame 6 ceppi di Stenotrophomonas maltophilia, 5
ceppi di Pseudomonas aeruginosa e 6 ceppi del genere Acinetobacter della collezione dell’ICM.
Una volta inclusi i risultati di questi tre gruppi di batteri, la specificità delle piastre è diminuita,
passando:
•
per la ChromIDTM ESBL Agar
da 69% a 38% dopo incubazione di 24 ore,
da 44% a 25% dopo incubazione di 48 ore,
•
per la BLSE Agar
da 50% a 25% dopo incubazione di 24 ore,
da 44% a 22% dopo incubazione di 48 ore,
•
per la EbSA Agar
da 88% a 63% dopo incubazione di 24 e 48 ore,
•
per la CIVA Agar
da 63% a 41% dopo incubazione di 24 e 48 ore.
Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa e specie del genere Acinetobacter sono
cresciuti su tutti e quattro i terreni selettivi.
La piastra ChromIDTM ESBL Agar è riuscita a differenziare i tre generi non Enterobatteriaceae.
Secondo le direttive fornite dalla Biomérieux, il colore delle loro colonie risulta bianco, mentre le
colonie che fanno parte della famiglia Enterobatteriaceae normalmente si colorano rosa, verde o
marroncino [2].
Tuttavia sono stati descritti alcuni ceppi di Enterobatteriaceae produttrici di ESBL che formano
colonie bianche, in particolare alcuni ceppi di Escherichia coli che non possiedono la
26
β-glucuronidasi ed alcuni ceppi di Proteus mirabilis che presentano una debole crescita, associata
ad una debole espressione di ESBL. La differenziazione di questi ceppi dalle non
Enterobatteriaceae, anch’esse di colore bianco sulla piastra, può avvenire tramite il test
dell’ossidasi [2].
6.3.4 L’influenza di AmpC e K1
Dalla letteratura [18] si conosce che oltre alle ESBL esistono altri meccanismi di resistenza come
l’iperproduzione della β-lattamasi K1 in Klebsiella oxytoca e l’iperproduzione del gene AmpC per
Enterobacter e Citrobacter che danno uno spettro di resistenza simile all’ESBL.
Per tutte le quattro piastre la diminuita specificità è soprattutto dovuta quindi alla iperproduzione
di AmpC e K1. Per i ceppi riconosciuti iperproduttori di AmpC o K1 non sono stati messi in evidenza
tramite la PCR i geni (blaTEM, blaSHV, blaOXA, blaCTX-M) che normalmente conferiscono il fenotipo
ESBL. Se nell’analisi prendiamo in considerazione anche i ceppi iperproduttori di AmpC e K1, ceppi
non considerati ESBL, la specificità e sensitività diminuisce sostanzialmente [Allegato 10].
La
•
•
•
•
specificità delle piastre passa dopo incubazione di 24 ore:
per la ChromIDTM ESBL Agar da 69% a 57%,
per la BLSE Agar
da 50% a 52%,
per la EbSA Agar
da 88% a 75%,
per la CIVA Agar
da 63% a 67%.
La
•
•
•
•
sensitività delle piastre passa
per la ChromIDTM ESBL Agar
per la BLSE Agar
per la EbSA Agar
per la CIVA Agar
dopo incubazione di 24 ore:
da 94% a 93%,
da 97% a 93%,
da 91% a 67%,
da 73% a 88%.
6.4 Materiale biologico
6.4.1 Interpretazione dei risultati ottenuti
I 32 materiali biologici sono stati studiati con le quattro piastre e confrontate con E-Test.
La seguente tabella rappresenta un riassunto dei risultati ottenuti con le quattro piastre:
Tabella 17 Tabella riassuntiva dei risultati ottenuti con le piastre per i materiali biologici
Costo (CHF) per piastra
Tempo di incubazione
consigliato da
ditte/pubblicazioni
Tempo di incubazione
eseguito per questo studio
Specificità
Sensitività
PPV
NPV
ChromIDT M ESBL Agar
2.40
BLSE Agar
4.03
EbSA Agar
3.00
CIVA Agar
1.00
18 / 24 ore
24 ore
18 / 24 ore
24 ore
24 / 48 ore
24 / 48 ore
24 / 48 ore
24 / 48 ore
53% /
85% /
55% /
83% /
47% /
69% /
47% /
69% /
47% /
92% /
55% /
90% /
42%
92%
52%
89%
37% /
100% /
52% /
100% /
32%
100%
50%
100%
53%
85%
55%
83%
37%
85%
48%
78%
27
La sensitività di BLSE Agar è ottima, con nessun falso negativo dopo 48 ore di incubazione. Molto
buona la sensitività della piastra ChromIDTM ESBL Agar. EbSA Agar e CIVA Agar risultano avere
comunque una buona sensitività.
EbSA Agar è l’unica che presenta una buona specificità. Le altre tre piastre hanno dato più falsi
positivi rispetto alla EbSA Agar, abbassando in modo elevato la specificità. Questo lo si è visto
analizzando i ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae, inseminando direttamente i materiali
biologici sulle piastre di studio, ci sono stati diversi fattori che hanno favorito la crescita delle
colonie, facendo diminuire la specificità.
Dalla pratica eseguita per questo studio si può affermare che i microrganismi diversi dalle
Enterobatteriaceae,
come
per
esempio
le
Xanthomonadaceae,
Moraxellaceae
e
Pseudomonadaceae possono crescere sui terreni ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e
CIVA Agar. Questo causa molti falsi positivi ed influenza sensibilmente il risultato, abbassando
automaticamente la specificità dei quattro terreni selettivi.
6.4.2 Feci
Per quanto riguarda la possibilità di effettuare degli screening di pazienti tramite striscio anale
bisogna tenere in considerazione che tra la flora commensale normalmente presente vi siano dei
ceppi batterici iperproduttori di AmpC o K1 che saranno in grando di svilupparsi sulle piastre
ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e CIVA Agar.
Sono stati esaminati 6 campioni di feci, di cui 5 sono risultati negativi e 1 positivo per ESBL con l’ETest. Le piastre invece hanno dato il seguente risultato dopo 48 ore di incubazione:
•
ChromIDTM ESBL Agar
1 vero positivo, 1 vero negativo e 4 falsi positivi
•
BLSE Agar
1 vero positivo, 1 vero negativo e 4 falsi positivi
•
EbSA Agar
1 vero positivo, 3 veri negativi e 2 falsi positivi
•
CIVA Agar
1 vero positivo, 2 veri negativi e 3 falsi positivi
Gli isolati batterici sono identificati come Hafnia alvei, Citrobacter freundii, Stenotrophomonas
maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Morganella morganii e Enterobacter cloacae.
La piastra che ha mostrato meno falsi positivi è la EbSA Agar.
6.4.3
Possibilità
Enterobatteriaceae
di
discriminare
le
Enterobatteriace
dalle
non
L’unica piastra che è riuscita a distinguere colonie batteriche che non appartenessero alla famiglia
Enterobatteriaceae è stata la ChromIDTM ESBL Agar, tramite la presenza di colonie bianche ed
eseguendo il test dell’ossidasi [2].
6.5 Confronto con altri studi
Altri studi con le piastre ChromIDTM ESBL Agar, BLSE Agar, EbSA Agar e CIVA Agar sono stati
eseguiti nel corso degli anni.
Secondo i risultati ottenuti in questo studio, la EbSA Agar ha mostrato una sensitività di 91% e una
specificità di 88%, mentre la BLSE Agar una sensitività di 100% e una specificità di 44%. In uno
studio simile presentato al “18th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious
Diseases” svoltosi a Barcellona, Spagna nel 2008, dove sono stati utilizzati 208 ceppi batterici della
famiglia Enterobatteriaceae, si sono ottenuti una sensitività di 100% sia per EbSA Agar che per
BLSE Agar e una specificità di 85% per la EbSA Agar, mentre 57% per la BLSE Agar [28].
28
In uno studio effettuato all’Ospedale di Santa Monica (Vila Velha, ES, Brasile) nel 2008 sono state
confrontate la CIVA Agar e la piastra Mac Conkey Agar con l’aggiunta di ceftazidima. Analizzando
126 campioni di feci non si sono viste sostanziali differenze tra le due piastre [5].
Per quanto riguarda la ChromIDTM ESBL Agar e BLSE Agar sono stati effettuati più studi. Ad
esempio uno studio effettuato in Francia ha confrontato le due piastre utilizzando 765 campioni di
diversa natura. La ChromIDTM ESBL Agar è risultata essere migliore in sensitività (94%) ed in
specificità (90%), rispetto la BLSE Agar (sensitività di 85%, specificità di 74%) [29].
In un altro studio eseguito in Belgio, la ChromIDTM ESBL Agar è stata comparata all’uso di Mac
Conkey agar impregnato di antibiotico ceftazidima. Il test è stato eseguito con 173 prelievi di
diversa natura, testando solo la sensitività. Ancora una volta la ChromIDTM ESBL Agar è stata la
migliore (sensitività del 100%) rispetto alla Mac Conkey più ceftazidima (68%) [2].
Al laboratorio di microbiologia dell’Ospedale Universitario di Basilea hanno testato la ChromIDTM
ESBL Agar e la BLSE Agar, utilizzando 88 ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae, testando
unicamente la sensitività. La ChromIDTM ESBL Agar è stata la migliore (100%) rispetto alla BLSE
Agar (93%) [30].
29
7. CONCLUSIONI
Le Enterobatteriaceae produttrici di ESBL sono attualmente riconosciute in tutto il mondo come
patogeni ospedalieri di primaria importanza. La individuazione di portatori di E-ESBL è
particolarmente importante per la prevenzione ed il monitoraggio epidemiologico di queste
infezioni.
Per questo studio sono stati testati quattro differenti terreni selettivi, ChromIDTM ESBL Agar, BLSE
Agar, EbSA Agar e CIVA Agar, utilizzabili per l’identificazione rapida presuntiva di stipiti E-ESBL.
In conclusione i risultati di questo studio mostrano che la ChromIDTM ESBL Agar è il terreno
selettivo migliore per lo screening di E-ESBL eseguendo l’individuazione direttamente dal materiale
biologico. Oltre alla soddisfacente sensitività e specificità, dal punto di vista di laboratorio, questa
piastra ha il vantaggio di discriminare differenti colonie e quindi ceppi batterici, guardando
semplicemente il loro colore. Inoltre il prezzo sembra essere buono rispetto alle BLSE Agar, EbSA
Agar e CIVA Agar.
Quindi consiglio all’Ente Ospedaliero Cantonale di introdurre la piastra ChromIDTM ESBL Agar per lo
screening di batteri produttori di ESBL. Questa scelta è stata presa nel 2007 dal laboratorio
centrale dell’Ospedale Cantonale di Basilea [31].
Sarebbe interessante, magari in un futuro lavoro di diploma, testare i terreni selettivi per quanto
riguarda i pazienti ospedalizzati conosciuti come portatori di ESBL (striscio inguinale e anale), allo
scopo di continuare ed ampliare il lavoro fin qui svolto e studiare ancora più a fondo le potenzialità
e i difetti di queste piastre.
30
8. BIBLIOGRAFIA
1
http://www.tesionline.it/default/tesi.asp?idt=19168, consultato il 14 aprile 2009
2
http://www.marigoitalia.it/file/CHROMID_ESBL.pdf, consultato il 24 novembre 2008
3
http://microgenbioproducts.com/pdf/Product%20Brochures_Individual/BLSE%20Agar.pdf,
consultato il 24 novembre 2008
4
http://www.alpha-omega-diagnostics.com/reagents/bacteriology/index.php, consultato il 24
novembre 2008
5
Pessôa de Menezes Silva C. H., 2000, Elaboration and evaluation of a new screening medium
for detection and presumptive identification of extended-spectrum β-lactamase-producing
organisms (ESBL), Brazilian Journal of Microbiology, 31:271-274
6
Kaiser F. H., Bienz K. A., Eckert J., Lindenmann J., 1993, Handbook di Microbiologia Medica 8a
edizione Mediserve, 197-218
7
Praglia C., 1999, Microbiologia prima edizione, Atlanti Scientifici Giunti
8
http://www.chuv.ch/swiss-noso/i114a2.htm, consultato il 27 febbraio 2009
9
http.//www.chuv.ch/swiss-noso/vol7nu1i.pdf, consultato il 27 febbraio 2009
10 http.//www.chuv.ch/swiss-noso/vol6nu3i.pdf, consultato il 27 febbraio 2009
11 http://www.life.umd.edu/classroom/bsci424/Images/PathogenImages/BetaLactam.gif,
consultato il 14 aprile 2009
12 Milnar D., 2008, ESBLs: Molecular Mechanisms of Penicillin Resistance. Microbial Pathogenicity,
Summary Report 12.3
13 Servizio Igiene Ospedaliera EOC, 2001, Misure precauzionali per i germi multiresistenti agli
antibiotici (escluso bacillo di Koch), scheda A.6
14 Gaia V., De Benedetti A., Valsangiacomo C., Poloni C., 2009, Prevalenza di Staphylococcus
aureus meticilino-resistente (MRSA) negli istituti a lunga degenza in Canton Ticino: studio
multicentrico 2008, Tribuna medica ticinese
15 http://www.unilabs.ch/Global/Italian/Area%20Medici/Informazioni%20scientifiche/31MRSA_I.pdf, consultato il 14 aprile 2009
16 http://www.iss.it/binary/publ/cont/07-54.1204714542.pdf, consultato il 14 aprile 2009
17 Rossetti A., 2007-2008, Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il
sistema Phoenix e PCR
18 http://194.119.197.4/~alcaro/f1/aa_04_05/tesine/carbapenemi#11, consultato il 14 aprile
2009
19 Siu L.K., 2002, Antibiotics: Action and resistance in gram-negative bacteria, J. Microbiol.
Immunol., Infect. 35:1-11
20 Ferron A., 1989, Bactériologie Médicale à l’usage des étudiants en médecine 13e édition,
Editions C. et R., Quatrième Partie, 397-403
21 Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory, 2002, Ricerca e refertazione di
laboratorio dei batteri produttori di beta-lattamasi a spettro esteso, HPA (www.hpastandardmethods.org.uk), QSOP 51:1-15
22 Fernandez Parra F. M., 2007-2008, Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in
Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
31
23 http://fad.italbioforma.it/P3.asp?varIdNws=3461, consultato il 14 aprile 2009
24 Jacoby G. A., 2009, AmpC β-Lactamases, American Society for Microbiology, p. 161-182
25 http://www.biolifeit.com/biolife/upload/file/Documenti/NPLWKS-AMATO.PDF, consultato il 14
aprile 2009
26 Colom K., Pérez J., Alonso R., Fernàndez-Aranguiz A., Lariño E., Cisterna R., 2003, Simple and
reliable multiplex PCR assay for detection of blaTEM, blaSHV and blaOXA-1 genes in
Enterobacteriaceae, FEMS Microbiol,. Lett. 223:147-151
27 http://www.cscq.ch/com/publi/uricult-i.pdf, consultato il 14 aprile 2009
28 http://www.blackwellpublishing.com/eccmid18/abstract.asp?id=68771, consultato il 18 maggio
2009
29 Réglier-Poupet H., Naas T., Carrer A., Cady A., Adam J.M., Fortineau N., Poyart C., Nordmann
P., 2008, Perforemance of chromID ESBL, a chromogenic medium for detection of
Enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases, Journal of Medical
Micorbiology, 310-315
30 Bruderer T., Vesco R., Schneider R., Oezcan S., Frei R., 2008, Comparison of two different
selective plates for screening of Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) producing
Enterobacteriaceae, 67th Annual Assembly of the Swiss Society for Microbiology, P09
31 Graf S., 2008, ESBL Screening in urine, 67th Annual Assembly of the Swiss Society for
Microbiology, P25
32
9. RINGRAZIAMENTI
Vorrei ringraziare coloro che mi hanno aiutato in questo lavoro.
I miei ringraziamenti vanno al dottor Tiziano Balmelli ed Antonella Demarta per la scelta
dell’argomento del lavoro di diploma, per avermi seguito durante lo svolgimento dandomi consigli
e per la lettura delle bozze.
Ringrazio il direttore dell’Istituo Cantonale di Microbiologia, dottor Orlando Petrini per avermi
permesso di svolgere il lavoro di diploma presso un istituto all’avanguardia nella ricerca e per la
lettura delle bozze.
Un ringraziamento particolare per la tecnica in analisi biomediche Nadia Ruggeri, del reparto
Metodologie e Formazione, per avermi aiutata dall’inizio alla fine nello svolgimento soprattutto
pratico del mio lavoro, per aver avuto tanta pazienza, dedicandosi al mio lavoro, per la raccolta dei
campioni, aiutandomi nella stesura del lavoro e per la lettura delle bozze.
Ringrazio Fabio e Daniele per l’aiuto nella preparazione del terreno di coltura e tutto il laboratorio
di routine dell’ICM per la raccolta dei campioni.
Ringrazio i miei responsabili Giorgio Dal Bo ed Elia Cattani del laboratorio dell’Ospedale Civico di
Lugano per la loro collaborazione.
Inoltre ringrazio il direttore Andrea Boffini della Scuola Medico Tecnica, il docente di chimica clinica
Giovanni Togni ed il docente di metodologia Claudio Naiaretti per gli insegnamenti metodologici
ricevuti durante tutto il periodo scolastico.
Ringrazio le docenti Sonja Marci, Daniela Marcacci, come pure Nicole, Pamela e Miguel per il loro
sostegno e Susan Gilbert per la parte in inglese.
Ringrazio la mia famiglia e la mia amica Samuela per il supporto morale ed gli aiuti ricevuti durante
tutto il periodo scolastico.
33
10. ALLEGATI
Allegato 1:
Skim Milk (BBL)
Tratto: procedure operative di laboratorio. Istituto cantonale di microbiologia.
Versione 0.1. 2005. Approvato: Dolina Marisa.
Materiale
Skim Milk (BBL)
10.0 g
Sterilizzare a 121°C per 15 minuti
Calf serum (Sigma)
10.0 ml
Glicerolo (Fluka)
20.0 ml
Acqua demineralizzata 70.0 ml
Allegato 2:
Agar Sangue (Oxoid)
Tratto: procedure operative di laboratorio. Istituto cantonale di microbiologia.
Versione 0.3. 2007. Approvato: Dolina Marisa.
Materiale
Columbia Agar Base (Oxoid) 312.0 g
Acqua demineralizzata
7600.0 ml
Sterilizzare a 121°C per 15 minuti
Sangue di montone (Mischler) 400.0 ml
Allegato 3:
Mac Conkey (Difco)
Tratto: procedure operative di laboratorio. Istituto cantonale di microbiologia.
Versione 0.1. 2005. Approvato Dolina Marisa.
Materiale
Mac Conkey (Difco)
400.0 g
Acqua demineralizzata
8000.0 ml
Sterilizzare a 121°C per 15 minuti
Allegato 4:
Drigalski Agar (Biokar Diagnostics)
Tratto:http://www.solabia.fr/solabia/produitsDiagnostic.nsf/0/ECC0A6C7FB8376DC1
2574B1004E37BD/$file/BK036%20Drigalski%20lactose%20Agar%20BK036%20%v.
6.pdf.
Materiale
Volume totale
Peptone
Estratto di carne bovina
Estratto di lievito
Desossicolato di sodio
Tiosulfato di sodio
Lattosio
Cristalli violetto
Blu di bromotimolo
Agar
1000.0 ml
15.0 g
3.0 g
3.0 g
1.0 g
1.0 g
15.0 g
0.005 g
0.08 g
15.0 g
34
Allegato 5:
Ossidasi (Sigma)
Tratto: garanzia della qualità dei risultati. Istituto cantonale di microbiologia.
Versione 0.1. 2005. Approvato: Dolina Marisa.
Il test viene utilizzato per distinguere gli Enterobatteri da Pseudomonas.
Materiale
Polvere N,N-Dimethyl-p-Phenylenediamine (Sigma)
Acqua demineralizzata
Carta assorbente
Anse sterili
Procedimento
Diluire un’ansata di polvere N,N-Dimethyl-p-Phenylenediamine (Sigma) in circa 10 ml di acqua
demineralizzata.
Bagnare la carta assorbente con la soluzione diluita.
Prelevare con l’ansa sterile una colonia batterica dal terreno Agar e appoggiarla sulla carta
assorbente, premendo leggermente.
Attendere 30 secondi.
Lettura
Positivo
Negativo
Allegato 6:
Comparsa di una colorazione rosa scuro entro 30 secondi,
(batteri non fanno parte delle Enterobatteriaceae).
La mancata comparsa della colorazione entro 30 secondi,
(batteri fanno parte delle Enterobatteriaceae).
E-Test (AB Biodisk)
Tratto: procedure operative di laboratorio. Istituto cantonale di microbioogia.
Versione 0.1. 2005. Approvato: Dolina Marisa.
È un metodo quantitativo per la determinazione della concentrazione minima inibente (CMI) di un
singolo agente antimicrobico nei confronti dei microrganismi e per la determinazione dei
meccanismi di resistenza.
Materiale
Piastre di agar (4-5 mm spressore mantenute a 2-8°C)
Müller Hinton (MH)
NaCl 0.9% sterile in tubi mantenuti a 2-8°C
Strisce E-Test di differenti antibiotici mantenute a temperatura indicata dal
fabbricante (cefotaxima, cefepime, ceftazidima)
Standard di torbidità McFarland 0.5
Anse sterili (platino o plastica), batuffoli sterili, pinzette, vortex, lampada
Incubatore 37°C aereobiosi
Procedimento
Prendere 4-5 colonie isolate da una piastra fresca (24 ore) e inseminare in NaCl. Vortexare la
sospensione, aggiustare la torbidità per ottenere il McFarland necessario.
Entro 15 minuti dal momento in cui si è ottenuto la torbidità corretta immergere un batuffolo
sterile nella sospensione e in seguito ruotarlo contro la parte del tubo per eliminare l’inoculo in
eccesso. Spatolare la piastra tre volte, ruotando ogni volta di circa 60 gradi. In questa maniera si
ottiene una crescita batterica uniforme e confluente. Per ultimo fare un giro sul bordo dell’agar.
Lasciare riposare la piastra 3-15 minuti prima di mettere le strisce impregnate di antibiotico.
Con l’aiuto di una pinzetta o dell’applicatore apposito appoggiare la striscia facendo attenzione che
la scala CMI (concentrazione minima inibente) sia rivolta verso l’alto e che l’estremità della striscia
senza antibiotico (segnata con E) sia il più possibile vicino al bordo della piastra. Una volta
35
appoggiata non più rimuovere la striscia. Per meglio farla aderire si può passare leggermente la
punta della pinzetta dalla concentrazione più bassa a quella più alta.
Piastre 140 mm massimo 6 strisce, piastre 90 mm massimo 2 strisce. Diminuire il numero se si
tratta di batteri molto sensibili (Figura 12, 13, 14, 15).
Incubare le piastre entro 15 minuti dal momento in cui si sono messe le strisce. Girare le piastre e
impilarle. Nel limite del possibile non mettere più di 5 piastre per pila (il calore e l’aria non passano
in maniera sufficiente) e incubarle nell’atmosera più appropriata.
Controllare che la coltura sia pura. Leggere il valore della CMI dove l’ellisse interseca la scala. Per
gli antibiotici batteriostatici leggere la CMI all’analogo della zona fine, al cosiddetto 80% di
inibizione, cioè il primo punto di inibizione significativa giudicato a occhio nudo. Per gli antibiotici
battericidici leggere la CMI al punto di completa inibizione di cresicta. In caso di dubbio leggere il
punto nella zona di completa inibizione della crescita incluso le zone di crescita fine e le singole
colonie.
- Inibitori della β-lattamasi possono estendere la loro ellisse al di sotto del valore della CMI a causa
di attività intrinseca. Estrapolare la curva superiore verso la striscia.
- Se l’ellisse interseca la striscia a due livelli differenti tenere in considerazione quello più alto.
- Ignorare la leggera linea di crescita lungo il bordo della striscia causata dal microrganismo
cresciuto in un tunnel di acqua.
- Ignorare la zona di emolisi e leggere l’inibizione della crescita.
Il valore della CMI può situarsi fra due diluizioni (two-fold dilution), in questo caso arrotondare alla
diluizione più alta. Esempio: valori per ampicillina sono S≤1, 1=2, R≥4, se il valore letto è 1.5
µg/ml lo si arrotonda a 2 µg/ml e il risultato sarà Intermedio (I).
L’interpretazione dei valori delle CMI si basa, in linea di principio, sui criteri emessi dal CLSI
(Clinical and Laboratory Standards Institute). Il risultato emesso è dato in µg/ml con
l’interpretazione sensibilie, intermedio o resistente. Se questi non fossero accessibili viene dato
solo il valore della CMI.
Figura 12, 13 Schema di posizionamento delle strisce
Figura 12 Piastra 140 mm – 6 strisce
Figura 13 Piastra 140 mm – 5 strisce
Figura 14, 15 Schema di posizionamento delle strisce
Figura 14 Piastra 140 mm – test ESBL
Figura 15 Piastra 90 mm – 2 strisce
36
Allegato 7:
Phoenix Epicenter (BD)
Tratto: apparecchi. Istituto cantonale di microbiologia.
Versione 1.0. 2009. Approvato: Bagutti Claudia.
Il sistema serve per l’identificazione rapida e la determinazione della sensibilità antimicrobica dei
batteri.
Materiali
Pannelli Phoenix (in base al tipo di battere)
Brodo ID Phoenix
Brodo AST Phoenix
Indicatore AST Phoenix
Tappi specifici per chiusura pannelli (forniti unitamente ai pannelli)
Stazione di inoculo Phoenix
Nefelometro
Pipette da 25 µl e punte apposite (fornite dalla ditta)
Tamponi ovattati sterili
Piastra di controllo (in base al tipo di battere)
Anse sterili
Procedimento
Scegliere il pannello da utilizzare e seminare la busta. Se quest’ultima risulta forata o aperta non
utilizzare il pannello.
Estrarre il pannello tenendolo lateralmente e porlo nell’apposita stazione di inoculo.
Attenzione: reggere i pannelli solo di lato. Evitare di lasciare impronte o macchie sui pozzetti in
quanto potrebbero influire sulla lettura.
Con l’aiuto di un tampone sterile inoculare un brodo ID Phoenix con il germe in esame fino a
raggiungere una torbidità di 0.5 (0.5-0.6) McFarland mediante nefelometro. Se si dovesse superare
la torbidità desiderata segnare con il pennarello il livello esatto del liquido, diluire con NaCl sterile o
con brodo ID Phoenix, miscelare e, una volta raggiunto il McFarland desiderato gettare tanto
liquido quanto basta per ritornare al livello segnato.
Con lo stesso tampone strisciare il primo settore della piastra di controllo e con un’ansa sterile
procedere alla semina completa della piastra.
Tenendo il flaconcino dell’indicatore in verticale dispensare una goccia su un batuffolo che verrà
gettato (questo permette che le gocce seguenti siano tutte di uguale quantità), e senza più girare
il flaconcino dispensare una goccia nella provetta contenente AST Broth (senza toccare il vetro).
Chiudere la provetta AST e mescolare capovolgendo due volte (non vortexare).
Il tubo AST con l’indicatore può essere tenuto al massimo due ore a temperatura ambiente alla
luce, oppure otto ore a temperatura ambiente allo scuro prima di essere inoculato.
Trasferire 25 µl di soluzione ID nell’AST Broth.
Chiudere e mescolare capovolgendo alcune volte (non vortexare).
Versare l’inoculo della provetta ID nell’accesso sinistro del pannello.
Versare l’inoculo della provetta AST nell’accesso destro del pannello.
Nota: i pannelli devono essere inoculati entro 30 minuti dalla preparazione dell’AST Broth.
Lasciar scorrere il liquido lungo il percorso a serpentina.
Chiudere con il tappino apposito precedentemente numerato con il numero corrispondente
all’analisi (nell’apparecchio questo numero sarà preceduto dalla sigla del reparto e l’anno).
Verificare che la chiusura a scatto del tappino sia completamente inserita.
Porre il pannello nel vassoio portapannelli, registrare ed introdurre il campione nell’apparecchio
Phoenix.
37
Allegato 8:
MALDI-TOF MS (AXIMA)
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time Of Flight
Mass Spectrometry
Tratto: istruzioni operative di laboratorio. Istituto cantonale di microbiologia.
Versione 1.0. 2009. Approvato: Bagutti Claudia.
Preparazione di ceppi batterici per analisi MALDI-TOF MS
Questa procedura indica le modalità per la preparazione di ceppi batterici per l’identificazione
mediante la spettrometria di massa MALDI-TOF MS (apparecchio: AXIMA-Confidence Linear and
Reflectron, Shimadzu; con banca dati e software SARAMIS, Anagnostec).
I batteri gram negativi non pongono particolari problemi. Colture incubate per 24 ore sono idonee
per un’applicazione della tecnica MALDI-TOF MS e i batteri possono essere analizzati senza
necessitare di trattamenti (estrazioni) particolari.
Bisogna ricordarsi sempre che:
• La prima riga A di ogni lama (A1-A4) deve rimanare sempre vuota.
• Su ogni lama deve essere inseminato un ceppo di Escherichia coli (sempre in posizione G3+G4)
per eseguire una calibrazione automatica dell’apparecchio.
• Ogni ceppo viene analizzato in doppio.
A1
B1
C1
D1
E1
F1
G1
H1
I1
J1
K1
L1
A2
B2
C2
D2
E2
F2
G2
H2
I2
J2
K2
L2
A3
B3
C3
D3
E3
F3
G3
H3
I3
J3
K3
L3
A4
B4
C4
D4 Ceppi da analizzare
E4
F4
G4 Escherichia coli per calibrazione
H4
I4
J4 Ceppi da analizzare
K4
L4
Figura 16 Schema di trasferimento dei ceppi su una lama FlexiMass per MALDI-TOF MS
Una colonia di batteri è trasferita su una lama d’acciaio FlexiMass, mediante un ago in plastica, al
centro di un pozzetto. La quantità di batteri inoculata deve essere tale da essere appena visibile a
occhio nudo. Non appena i batteri sono stati depositati sulla lama, essi vengono ricoperti da 0.5 µl
di matrice DHB o CHCA. La gocciolina deve essere depositata delicatamente sulla lama grazie a
una micropipetta da 2 oppure 10 µl in modo che non fuoriesca dal bordo del pozzetto. Dopo una
breve asciugatura di qualche minuto a temperatura ambiente, si formano dei cristalli. La qualità
dei cristalli (cristalli lunghi e facilmente visibili a occhio nudo per DHB e cristalli puntiformi per alfacyano) è di primaria importanza per ottenere una buona identificazione del ceppo batterico.
I dati relativi ad ogni ceppo analizzato vengono registrati a mano su una scheda (Foglio Analisi
MALDI-TOF MS) e vengono inseriti nel software Target Manager di Anagnostec.
L’analisi viene effettuata dalle persone abilitate dall’Area Biosicurezza.
Il software Saramis Premium restituisce per ogni pozzetto analizzato una percentuale di
identificazione e un’indicazione di colore (verde scuro se maggiore di 99.9%, verde chiaro se
compreso tra 99.9 e 95%, giallo tra 95 e 80%, bianco tra 80 e 70%. Il colore rosso indica che il
ceppo è stato assegnato a due o più taxa diversi.
38
Allegato 9:
Geni ESBL, risultati ottenuti all’ICM
Tabella 18 Risultati dei geni ESBL ottenuti all’ICM che concernono la collezione di ceppi batterici della famiglia Enterobatteriaceae
ROSSO
NERO
positivo per ESBL
negativo per ESBL
presenza del gene di resistenza
blaTEM
da Temoniera, gene di resistenza
blaOXA
da Oxacillasi, gene di resistenza
blaSHV
da Sulphydryl Variable, gene di resistenza
blaCTX-M da Cefotoximasi, gene di resistenza
AmpC plasmidico
da ampicillinasi C, plasmide che ha acquisito il gene per l’enzima AmpC
Iperproduzione di AmpC
da ampicillinasi C, sovraespressione del gene
Iperproduzione di K1
K1, sovraespressione del gene
CEPPO
SPECIE BATTERICA
Escherichia coli
Escherichia coli
27/07
Escherichia coli
90/07
Escherichia coli
89/07
Escherichia coli
94/07
Escherichia coli
100/07
Escherichia coli
84/07
Escherichia coli
47/07
Escherichia coli
Escherichia coli
12/07
13/07
Escherichia coli
14/07
Escherichia coli
16/07
Escherichia coli
22/07
Escherichia coli
32/07
Escherichia coli
40/07
Escherichia coli
51/07
Escherichia coli
88/07
Escherichia coli
58/07
Escherichia coli
Escherichia coli
U34313
ATCC 25922
Escherichia coli
0S438
Escherichia coli
0S62
Escherichia coli
Escherichia coli
0S184
78/08
Klebsiella oxytoca
Klebsiella oxytoca
123/08
34/08
Klebsiella oxytoca
55/07
Klebsiella oxytoca
56/07
Klebsiella oxytoca
87/07
Klebsiella pneumoniae
04/07
Klebsiella pneumoniae
73/07
Klebsiella pneumoniae
ATCC 700603 Klebsiella pneumoniae
72/06
Enterobacter sakazakii
0S688
Enterobacter aerogenes
93/05
Enterobacter cloacae
0S46
Enterobacter cloacae
0S128
Enterobacter cloacae
50/07
Bacillo Gram negativo NE
74/07
Salmonella spp.
0S91
Hafnia alvei
0S29
Serratia liquefaciens
0S453
Serratia marcescens
U31142
Proteus mirabilis
51/08
Proteus mirabilis
Amp73
Proteus mirabilis
0S14
Citrobacter freundii
0S255
Citrobacter freundii
0S565
Citrobacter freundii
GENI ESBL
bla TEM bla OXA bla SHV bla CTX-M
E-TEST
10/07
POS
05/07
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
POS
NEG
NEGATIVO
NEG
NEGATIVO
NEG
NEG
NEGATIVO
NEG
Iperproduzione di K1
POS
Iperproduzione di K1
POS
Iperproduzione di K1
POS
Iperproduzione di K1
POS
Iperproduzione di K1
POS
POS
POS
POS
ESBL POSITIVO
POS
POS
Iperproduzione di AmpC
NEG
POS
Iperproduzione di AmpC
NEG
NEGATIVO
NEG
NEGATIVO
POS
POS
NEGATIVO
NEG
NEGATIVO
NEG
NEGATIVO
NEG
NEGATIVO
NEG
POS
AmpC plasmidico
NEG
Iperproduzione di AmpC
NEG
Iperproduzione di AmpC
NEG
NEGATIVO
NEG
39
Allegato 10: Influenza di AmpC e K1
Tabella 19 Influenza di AmpC e K1 che concernono i ceppi batterici
INCUBAZIONE: 24 ORE
ChromIDTM ESBL Agar
BLSE Agar
CIVA Agar
EbSA Agar
E-Test
DEFINIZIONE
VERI POSITIVI
VERI NEGATIVI
FALSI POSITIVI
FALSI NEGATIVI
AmpC
0
1
4
0
ESBL
25
0
0
2
K1
0
0
5
0
AmpC
0
0
5
0
ESBL
26
0
0
2
K1
0
0
5
0
AmpC
0
1
4
0
ESBL
18
0
0
9
K1
0
5
0
0
AmpC
0
3
2
0
ESBL
22
0
0
3
K1
0
0
5
0
AmpC
0
5
0
0
ESBL
27
0
0
0
K1
0
0
5
0
AmpC
0
5
0
0
ESBL
27
0
0
0
K1
0
5
0
0
Tabella 20 Riassunto della tabella 19
INCUBAZIONE: 24 ORE
ChromIDTM ESBL Agar
BLSE Agar
CIVA Agar
EbSA Agar
E-Test
VERI POSITIVI
25
26
18
22
27
VERI NEGATIVI
12
11
12
14
16
FALSI POSITIVI
9
10
4
7
5
FALSI NEGATIVI
2
2
9
3
0
Tabelle 21 Specificità e sensitività influenzata da AmpC e K1
SPECIFICITÀ SENSITIVITÀ
93%
ChromID ESBL Agar
57%
93%
BLSE Agar
52%
67%
EbSA Agar
75%
88%
CIVA Agar
67%
TM
40
Allegato 11: Classificazione degli antibiotici β-lattamici [14]
Tabella 22 Classificazione degli antibiotici β-lattamici
Antimicrobial Class
Penicillins
Antimicrobial Subclass
Penicillin
Aminopenicillin
Agents Included; Generic Names
Penicillin
Amoxicillin
Ampicillin
Ureidopenicillin
Azlocillin
Mezlocillin
Piperacillin
Carboxypenicillin
Carbenicillin
Ticarcillin
Penicillinase-stable penicillins Cloxacillin
Dicloxacillin
Methicililn
Nafcillin
Oxacillin
Amidino penicillin
Mecillinam
β-lactam/b-lactamase
Amoxicillin-clavulanic acid
inhibitor combinations
Ampicillin-sulbactam
Piperacililn-tazobactam
Ticarcillin-clavulanic acid
Cephems (parenteral) Cephalosporin I
Cefazolin
Cephalothin
Cephapirin
Cephradine
Cephalosporin II
Cefamandole
Cefonicid
Ceftaroline
Cefuroxime (sodium)
Cephalosporin III
Cefoperazone
Cefotaxime
Ceftazidime
Ceftizoxime
Ceftriaxone
Cephalosporin IV
Cefepime
Cephamycin
Cefmetazole
Cefotetan
Cefoxitin
Oxacephem
Moxalactam
Cephems (oral)
Cephalosporin
Cefaclor
Cefadroxil
Cefdinir
Cefditoren
Cefetamet
Cefixime
Cefpodoxime
Cefprozil
Ceftibuten
Cefuroxime (axetil)
Cephalexin
Cephradine
Carbacephem
Loracarbef
Monobactams
Aztreonam
Penems
Carbapenem
Doripenem
Ertapenem
Imipenem
Meropenem
Penem
Faropenem
41
Allegato 12: Fotografie piastre
ChromIDTM ESBL Agar
Figura 17
1
- Ceppo 0S255
- Specie Citrobacter freundii (iperproduzione di
AmpC)
- Colonie bianche
2
- Ceppo 55/07
- Specie Klebsiella oxytoca
- Colonie verdi
1
3
- Ceppo 05/07
- Specie Escherichia coli
- Colonie rosa-bordeaux
2
3
BLSE Agar
1
2
Figura 18
1
- Ceppo 51/08
- Specie Proteus mirabilis
- Mac Conkey Agar: colonie incolore
- Drigalski Agar: colonie blu / terreno blu
2
- Ceppo 05/07
- Specie Escherichia coli
- Mac Conkey Agar: colonie rosa
- Drigalski Agar: colonie gialle
42
EbSA Agar
Figura 19
Ceppo 05/07
Specie Escherichia coli
La piastra non possiede alcuna particolarità che può differenziare un particolare ceppo
batterico. Le colonie, se presenti, sono di colore rosa.
CIVA Agar
Figura 20
1
- Ceppo 0S14
- Specie Citrobacter freundii (iperproduzione di
AmpC)
- Colonie gialle
2
- Ceppo 10/07
- Specie Escherichia coli
- Colonie verdi
1
2
3
- Ceppo 05/07
- Specie Escherichia coli
- Colonie incolore, terreno blu
3
43