METODO NATIONALE STANDARD
IDENTIFICAZIONE DI
SPECIE STREPTOCOCCUS,
SPECIE ENTEROCOCCUS E
MICRORGANISMI
MORFOLOGICAMENTE SIMILI
BSOP ID 4
Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory
Centre for Infections
IDENTIFICAZIONE DI SPECIE STREPTOCOCCUS, SPECIE ENTEROCOCCUS E MICRORGANISMI MORFOLOGICAMENTE
SIMILI
Revisione no: 2.1 Data di revisione: 14.09.07 Emesso da: Standards Unit, Evaluations e Standards Laboratory
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STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD
I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida,
promuovono l’adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle
informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della sorveglianza
sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica e la fiducia del
paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un buon standard
minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi Nazionali
Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno intraprendere ricerche
addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore sviluppo.
I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di
consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti
elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi.
I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina,
sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L’inclusione del logo di una
organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi
standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi
Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle
dell’organizzazione di cui sono membri. L’elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può
essere ottenuto tramite e-mail all’indirizzo [email protected]
Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure
commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state
validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità
interno ed esterno.
Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione, la
Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile
dell’accuratezza o dell’utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall’uso o da modifiche delle
informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa
generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà
ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione, si
deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection
Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza.
La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad
essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori informazioni
riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito www.hpa.org.uk
La HPA è un’organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò
significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui
pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza1.
Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web www.evaluations-standards.org.uk. Contributi allo
sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l’indirizzo [email protected]
Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager. Se
si modifica o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager; la bibliografia non
sarà aggiornata automaticamente.
Riferimento suggerito per questo documento:
Health Protection Agency (2007). Identification of Streptococcus species, Enterococcus species and
morphologically similar organisms. National Standard Method BSOP ID 4 Emissione 2.1
http://www.hpastandardmethods.org.uk/pdf_sops.asp.
IDENTIFICAZIONE DI SPECIE STREPTOCOCCUS, SPECIE ENTEROCOCCUS E MICRORGANISMI MORFOLOGICAMENTE
SIMILI
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INDICE
STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD ...........................................................................................
2
INDICE ...........................................................................................................................................................
3
PROCEDURA DI MODIFICA ......................................................................................................................
4
SCOPO DEL DOCUMENTO .........................................................................................................................
5
INTRODUZIONE ..........................................................................................................................................
5
INFORMAZIONE TECNICA ...........................................................................................................................
9
1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ..........................................................................................
10
2
MICRORGANISMI BERSAGLIO ........................................................................................................
10
3
IDENTIFICAZIONE .............................................................................................................................
11
ASPETTO MICROSCOPICO ……………………………………………………………………….……….
TERRENI DI ISOLAMENTO PRIMARIO ….…………………………………………………………….…….
ASPETTO DELLA COLONIA ..…………………………………………………………………….…………
PROCEDURE DI PROVA ....………………………………...……………………...……...………...……
IDENTIFICAZIONE SUCCESSIVA ………………………….…………...……………………………...……
CONSERVAZIONE E RIFERIMENTO ...………..………………......…………………………...……...……
11
12
12
13
14
14
4
IDENTIFICAZIONE DI STREPTOCOCCHI ED ENTEROCOCCHI – DIAGRAMMA DI FLUSSO .....
15
5
REFERTAZIONE ......................................................................................................................,..........
16
IDENTIFICAZIONE PRELIMINARE ………..……………………………………………………………,,…..
CONFERMA IDENTIFICAZIONE ……….. …………………………………….………….………………,…..
MEDICO MICROBIOLOGO ……………………………………………………………………………,…….
CCDC …………………………………………………………………………………………………,….
CENTRO PER FOR INFEZIONI ………………………………………………………………………,…..
GRUPPO CONTROLLO INFEZIONI ……………………………………………………………………,…….
16
16
16
16
16
17
RIFERIMENTI ........................................................................................................................................
17
6.1 LABORATORIO DI RIFERIMENTO ……………………………………………………………………………
17
RINGRAZIAMENTI E CONTATTI ....................................................................................................
17
BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................................
19
3.1
3.2
3.2
3.4
3.5
3.6
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
6
7
.
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PROCEDURA DI MODIFICA
Documento di riferimento BSOP ID 4
controllato
Titolo del documento
Identificazione di specie Streptococcus, specie Enterococcus e
controllato
microrganismi morfologicamente simili
Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata delle correzioni. Le modifiche
attuali sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la
[email protected]
Sull’emissione di pagine nuove o rivedute ciascun documento controllato deve essere aggiornato dal
proprietario del Laboratorio.
Modifica
Numero/
Data
7/
14.09.07
Emissione no.
Scartata
2
Inserita
Emissione
no.
2.1
Pagina
Sessione(i)
interessate
Modifica
1
Prima pagina Aggiunto il logo
dell’Irlanda del Nord
Tutte
Tutte
Aggiornata tassonomia
Tutte
Tutte
Inseriti collegamenti PDF
per i documenti dei MNS.
15
4
Titolo modificato e
diagramma di flusso in
formato visio. Aggiornato
diagramma di flusso.
16
5.3
Sezione modificata per
migliorare l’informazione in
sede di lavoro.
17
6
Inserito collegamento ai
manuali d’uso del
laboratorio di riferimento.
19
Bibliografia
Bibliografia revisionata ed
aggiornata
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IDENTIFICAZIONE DI SPECIE STREPTOCOCCUS,
SPECIE ENTEROCOCCUS E MICRORGANISMI
MORFOLOGICAMENTE SIMILI
SCOPO DEL DOCUMENTO
Questo Metodo Nazionale Standard (MNS) descrive l’identificazione con metodi fenotipici di generi o specie
Streptococcus ed Enterococcus isolati da materiale clinico. Sono inclusi microrganismi delle specie
morfologicamente simili agli streptococchi riscontrati in questi campioni.
A causa della costante evoluzione della classificazione tassonomica di questo gruppo di microrganismi il
ricorso ai soli metodi fenotipici può non essere sufficiente all’identificazione a livello di specie. Per la
classificazione questo MNS adotta un approccio semplificato raggruppando i microrganismi con
caratteristiche fenotipiche simili2. Su indicazione clinica od epidemiologica può essere successivamente
richiesta una identificazione più specifica.
INTRODUZIONE
TASSONOMIA3-5
Negli ultimi anni la tassonomia degli streptococchi e dei microrganismi correlati ha subito una sostanziale
revisione, in gran parte dovuta all’utilizzo dei metodi molecolari di identificazione. Inoltre, i sistemi
d’identificazione americani ed anglosassoni adottano terminologie di tipo diverso per definire alcuni
streptococchi.
Il nome del genere Enterococcus, suggerito nel 1903 per batteri in precedenza definiti Streptococcus
faecalis e Streptococcus faecium, è stato modificato nel 1984, quando in questo genere sono stati inclusi
altri microrganismi. Attualmente i membri del genere Enterococcus sono 18. Enterococcus faecalis ed
Enterococcus faecium sono quelli di più comune riscontro nelle infezioni umane.
CARATTERISTICHE
Gli Streptococchi sono cocchi Gram positivi (sferici od ovoidali) spesso disposti in coppie o in catenelle.
Sull’agar sangue le specie presentano emolisi di vario tipo, utilizzata come prima fase per l’identificazione
clinica degli isolati. Per l’identificazione preliminare sono importanti il tipo di emolisi su agar sangue e la
classificazione sierologica di Lancefield.
Emolisi su agar sangue:
x
Į-emolisi – determina lisi parziale dei globuli rossi che circondano una colonia ed una colorazione
verdastra del terreno
x
ȕ-emolisi – determina lisi completa dei globuli rossi che circondano una colonia ed un alone di
chiarificazione del sangue presente nel terreno
x
non-emolisi o Ȗ-emolisi – nessun cambiamento di colore o chiarificazione del terreno
x
Į‘-prima (Į‘) od “ampia area Į“ di emolisi – ristretta area con globuli rossi integri in prossimità della
colonia circondata da alone di emolisi completa. Questo tipo di emolisi può essere confusa con la ȕemolisi
Gli streptococchi sono anaerobi facoltativi e catalasi negativi2. I carboidrati sono metabolizzati per via
fermentativa; l’’acido lattico è il principale metabolita. Gli streptococchi producono l’enzima leucina
aminopeptidasi (LAP), definito anche leucina arylamidasi.
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Streptococcus pyogenes (gruppo A di Lancefield)
Streptococcus pyogenes è un cocco Gram positivo disposto in catenelle. Dopo 18 - 24 ore di incubazione a
35°C - 37°C su agar sangue le colonie sono circa di 0.5 mm, cupuliformi, con bordo continuo. Alcuni ceppi
possono produrre colonie mucose. L’emolisi è più evidente nella coltura incubata in condizioni anaerobiche
perché le emolisine sono più stabili in assenza di ossigeno6.
Gli streptococchi del gruppo A di Lancefield non si sviluppano su terreni che contengono bile.
La sensibilità alla bacitracina a bassa concentrazione è stata utilizzata come metodo di screening, ma i
risultati non sono attendibili7. E’ stata segnalata resistenza alla benzilpenicillina.
La prova della pyrrolidonyl arylamidasi (o pyrrolinodyl-aminopeptidasi) è positiva per gli streptococchi di
Gruppo A e negativa per gli altri streptococchi classificabili, sebbene alcuni ceppi dei gruppi C e G isolati
dall’uomo siano positivi. Anche gli Enterococchi sono PYR positivi8.
Colonie puntiformi del gruppo S. anginosus possono reagire in modo crociato con anticorpi del gruppo A di
Lancefield8 e crescere su terreni contenenti bile.
Streptococcus agalactiae (gruppo B di Lancefield)
Gli Streptococcus agalactiae sono cocchi Gram-positivi, disposti in catenelle. Dopo 18 - 24 ore di
incubazione a 35°C - 37°C le colonie si sviluppano in modo lievemente maggiore rispetto agli altri
streptococchi (circa 1 mm) e producono un alone di ȕ-emolisi meno evidente. Alcuni ceppi non sono
emolitici9.
Gli streptococchi del gruppo B di Lancefield non crescono su terreni che contengono bile.
Il terreno di Islam9 può essere utile per il rilievo della produzione di pigmento arancio nella coltura di
isolamento primario e per l’identificazione preliminare, ma non è raccomandato in questo MNS.
Streptococcus dysgalactiae sottospecie equisimilis (gruppi A, C, G e L)10 Streptococcus equi
sottospecie zooepidemicus2 (groppo C di Lancefield) e streptococchi di gruppo G di Lancefield
All’osservazione microscopica queste specie sono rappresentate da cocchi Gram positivi disposti in
catenelle. Gli streptococchi dei gruppi C e G di Lancefield5 sviluppano colonie di grandi dimensioni (•0.5 mm)
simili a quelle degli streptococchi di Gruppo A. Nelle infezioni umane i ceppi S. dysgalactiae di Gruppo C e
G, sottospecie equisimilis, sono identificati più frequentemente di quelli dotati di antigene di Gruppo A (o L)10.
Gli streptococchi del gruppo C e G di Lancefield non crescono su terreni che contengono bile.
Colonie puntiformi del gruppo S. anginosus possono reagire in modo crociato con anticorpi dei gruppi C e G
di Lancefield11 e crescere su terreni contenenti bile.
Specie Enterococcus, gruppo Streptococcus bovis (gruppo D di Lancefield)
Il genere Enterococcus ed i microrganismi del gruppo S. bovis possiedono l’antigene del gruppo D di
Lancefield. All’osservazione microscopica sono rappresentati da cocchi Gram positivi, di aspetto sferico od
ovoidale (0.6 - 2.5 µm), di solito in brodocoltura si presentano a copie o in corte catenelle. Dopo 18 – 24 ore
d’incubazione su agar sangue a 35° - 37°C le colonie sono di 1 - 2 mm e su agar sangue di cavallo
presentano emolisi di tipo Į, ȕ o assenza di emolisi. La maggior parte delle specie si sviluppa su agar
nutriente a 45°C. Un numero ridotto si sviluppa a 50°C, pH 9.6 e NaCl 6.5%. Questi possono inoltre
sopravvivere ad esposizione termica di 60°C per 30 minuti.
Gli streptococchi del gruppo D crescono sui terreni che contengono bile; la prova dell’idrolisi rapida
dell’esculina in presenza di 40% di bile può differenziarli dagli altri streptococchi.
Gli Enterococchi sono in grado di resistere al calore (60°C/30 min) e sono PYR-positivi, ciò li differenzia da
S. bovis e S. gallolyticus.
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Il gruppo S. bovis comprende sei specie10: S. bovis, S. equinus, S. gallolyticus (in precedenza S. bovis
biotipo I), S. infantarius (in precedenza S. bovis biotipo II/1), S. pasteurianus (in precedenza S. bovis biotipo
II/2) e S. lutetensis. All’osservazione microscopica dopo incubazione di 18 - 24 ore in CO2 o in anaerobiosi a
35°C - 37°C queste specie sono costituite da cocchi Gram positivi disposti in catenelle. Le colone sono di
solito non-emolitiche e su agar sangue presentano diametro di 1 - 2 mm. I membri del gruppo S. bovis
possono essere erroneamente identificati come enterococchi in quanto molti ceppi possiedono l’antigene di
gruppo D. E’ importante identificare i microrganismi del gruppo S. bovis nei materiali clinici, specialmente in
corso di batteriemie, perché S. gallolyticus e S. pasteurianus sono associati a malattia enterica cronica, in
particolare ad adenocarcinoma del colon12 Il gruppo S. bovis può essere differenziato dagli enterococchi per
prove negative alla PYR ed all’arginina; gli enterococchi sono di solito positivi ad entrambi questi saggi.
Gli enterococchi sono anaerobi facoltativi. Due specie del genere, Enterococcus cassiflavus ed
Enterococcus gallinarum, sono mobili. Gli enterococchi sono ossidasi negativi e fermentano i carboidrati. La
maggior parte delle specie è catalasi negativa, alcuni ceppi producono una pseudocatalasi.
La maggior parte degli enterococchi possiede l’antigene di gruppo D, sebbene alcuni ceppi possono reagire
in modo crociato con l’antisiero del gruppo G di Lancefield13.
Raramente E. faecalis sono resistenti all’ampicillina14. Gli enterococchi resistenti alla vancomicina o al
glicopeptide (V/GRE) sono in progressivo aumento e la diffusione della resistenza si ritiene sia causata da
trasposoni e plasmidi che diffondono fra le specie batteriche15.
Gruppo Streptococcus anginosus: Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus
sottospecie constellatus, Streptococcus constellatus sottospecie pharyngis, Streptococcus
intermedius (in precedenza gruppo “Streptococcus milleri”)
All’osservazione microscopica queste specie sono rappresentate da cocchi Gram positivi disposti in
catenelle. Sull’agar sangue le colonie sono piccole (”0.5 mm) e dopo 16 - 24 ore a 35°C - 37°C possono
presentare emolisi Į, ȕ o assenza d’emolisi. Nell’identificazione preliminare del gruppo S. anginosus le
condizioni d’incubazione possono assumere una certa importanza perché la crescita può essere favorita da
una bassa concentrazione di ossigeno e da aumento della CO216.
I microrganismi di questo gruppo possono avere antigene di Lancefield di gruppo A, C, F o G16 o non essere
classificabili in gruppi. S. intermedius non possiede l’antigene di gruppo. S. constellatus può esprimere
antigene di gruppo C, o F, e S. anginosus antigeni di gruppo A, C, F o G. Gli streptococchi isolati dall’uomo
che esprimono antigene di gruppo F appartengono con elevata probabilità al gruppo anginosus. Questi
microrganismi non crescono su terreni contenenti bile, ma sono alo-tolleranti.
Come prova di screening per i microrganismi del gruppo S. anginosus può essere utilizzata la resistenza a
sulfonamidi e bacitracina14.
L’identificazione in un campione clinico di un isolato appartenente a questo gruppo può essere clinicamente
significativa in quanto questi microrganismi possiedono caratteristiche che facilitano la loro presenza nelle
infezioni piogene invasive.
Streptococcus pneumoniae
Gli Streptococcus pneumoniae (“pneumococchi”) sono cellule che si presentano in coppie, Gram-positive,
tipicamente a forma lanceolata, possono essere capsulati. Le colonie sono Į-emolitiche, di 1 – 2mm, con
aspetto a ‘pedina di dama’ conseguente all’emolisi dei microrganismi dopo incubazione in 5 - 10% di CO2 a
35°C - 37°C per 16 - 24 ore. In condizioni anaerobiche le colonie possono apparire più larghe e mucose.
Gli S. pneumoniae sono di solito sensibili all’optochina (cloridrato di etilidrocupreina); ciò consente
un’identificazione rapida del microrganismo, anche se è stata segnalata resistenza a questo composto. Gli
S. pneumoniae sono solubili in soluzioni di sali biliari3.
Gli S. pneumoniae possono essere identificati con metodi sierologici. Per la tipizzazione di S. pneumoniae si
può utilizzare la prova microscopica, nota come ‘reazione di Quellung' (rigonfiamento capsulare)17,18. La
ricerca rapida dell’antigene pneumococcico può essere eseguita anche con confezioni commerciali di
agglutinazione, ma queste devono essere usate con cautela per possibili reazioni crociate con i gruppi di S.
oralis e S. mitis.
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Streptococcus suis
Su agar sangue S. suis è ȕ-emolitico, resistente all’optochina e PYR-negativo. Questi microrganismi sono di
solito membri dei gruppi R, S e T di Lancefield. S. suis I è associato al gruppo S ed S. suis II al gruppo R.
Non si sviluppano in brodo contenente NaCl al 6.5%. Alcuni ceppi sono in grado di crescere in soluzione
contenente bile al 40% ed idrolizzano l’esculina.
Altri streptococchi (streptococchi “viridans”)
Queste specie sono costituite da cocchi Gram positivi disposti in catenelle, alla colorazione Gram non sono
distinguibili dagli streptococchi ȕ-emolitici. Le colonie sono di 0.5 - 1.0 mm e su agar sangue, dopo
incubazione anaerobica a 35°C – 37°C per 16 – 24 ore, possono presentare Į emolisi o assenza di emolisi.
“Viridans” deriva dalla parola Latina viridis, colore verde.
Di solito questi streptococchi, se isolati da sedi nelle quali fanno parte della flora residente, non richiedono
identificazione successiva, diversa da streptococco Į o non emolitico. Nei casi di sospetta endocardite la loro
identificazione assume valore nel confermare la diagnosi ed a fini epidemiologici. Alcune specie di
streptococchi, quali Streptococcus sanguinis e Streptococcus oralis (in precedenza mitior), possono essere
responsabili fino all’80% di tutti i casi di endocardite streptococcica19.
Varianti Nutrizionali di Streptococchi (VNS)
Le VNS sono state recentemente classificate come Granulicatella adiacens, Granulicatella elegans e
Abiotrophia defectiva20,21. Per la loro crescita le VNS richiedono terreni arricchiti di piridossale o cisteina.
Sospettare VNS quando da emocolture positive si isolano cocchi Gram positivi simili a streptococchi che poi
non si sviluppano in sottocoltura. Ripetere la sottocoltura del brodo sospetto ed associare su agar sangue
una semina strisciata di Staphylococcus aureus; verificare la crescita per satellitismo dei VNS attorno allo
stafilococco. In modo alternativo, arricchire il terreno con 10 mg/L di cloridrato di piridossale.
Il riconoscimento di queste specie è importante nei casi di infezioni profonde per garantire la terapia
antimicrobica più appropriata (specialmente nei casi di endocarditi)22.
Specie Aerococcus
Nelle colture gli Aerococchi sono simili agli streptococchi “viridans”, ma l’aspetto microscopico è differente
per le caratteristiche formazioni a tetradi od a grappoli, come quelle degli stafilococchi. Talvolta è prodotta
una debole reazione della catalasi o pseudocatalasi. Alcuni ceppi di Aerococcus viridans sono bile esculina
e PYR positivi. Aerococcus urinae è bile aesculina e PYR negativo. Alcuni sistemi commerciali identificano
Helcococcus kunzii come A. viridans.
Specie Facklamia23
Nelle colture le Facklamia assomigliano agli streptococchi “viridans” ma al microscopio sono differenti per le
formazioni caratteristiche a coppie, tetradi od a grappoli. Sono state classificate sei specie, ma quella più
frequentemente isolata nell’uomo è la Facklamia hominis. Presentano moderata attività Į emolitica e di solito
idrolizzano l’urea.
Specie Gemella
Sono note quattro specie: Gemella haemolysans, Gemella morbillorum (in precedenza Streptococcus
morbillorum), Gemella bergeriae e Gemella sanguinis24. Questi batteri si decolorano facilmente al Gram, si
presentano come cocchi Gram–negativi in coppie, tetradi, a grappoli o corte catenelle. Su agar sangue le
specie Gemella sono Į o non-emolitiche ed assomigliano alle colonie di streptococchi viridans. Alcuni sistemi
commerciali identificano erroneamente gli streptococchi viridans come specie Gemella.
Specie Globicatella25
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Questi microrganismi assomigliano agli enterococchi per morfologia ed aspetto microscopico in quanto
cocchi Gram positivi disposti in coppie o corte catenelle. Non producono leucina aminopeptidasi.
Helcococcus kunzii
Helcococcus kunzii, descritto recentemente, è simile alle specie Aerococcus. H. kunzii produce colonie di
colore verde attenuato, lievemente Į-emolitiche; la crescita è stimolata dall’aggiunta al terreno base di siero
o Tween 80. Alcuni sistemi commerciali identificano erroneamente A. viridans come Helcococcus kunzii.
Specie Lactococcus
Le specie Lactococcus sono simili per caratteristiche fisiologiche agli Enterococchi. Sono cocchi Gram
positivi Į o non-emoltici che si presentano isolati, in coppie o catenelle. Sono bile aesculina-positivi, ma non
possiedono l’antigene di gruppo D26.
Specie Leuconostoc
Le specie Leuconostoc sono costituite da cocchi Gram-positivi, di aspetto lenticolare, si presentano in coppie
o catenelle, sono caratterizzate da resistenza alla vancomicina. Possono essere erroneamente scambiate
per enterococchi in quanto la maggior parte di loro è positiva alla prova della bile esculina, producono gas
dal glucosio ed alcune reagiscono in modo crociato con antisieri di Gruppo D 26.
Specie Pediococcus
In coltura le specie Pediococcus assomigliano a streptococchi viridans, ma l’aspetto microscopico è simile a
quello degli stafilococchi. Sono cocchi Gram positivi disposi a coppie, tetradi ed a grappolo e sono
vancomicina resistenti. Per la positività alla prova bile esculina e reazione crociata con gli antisieri di Gruppo
D possono essere erroneamente scambiati per enterococchi.
PRINCIPI DI IDENTIFICAZIONE
Gli Isolati dalle coltura primaria sono identificati da: aspetto della colonia, colorazione Gram, prova della
catalasi, classificazione di gruppo di Lancefield e sensibilità all’optochina. Per la differenziazione di specie,
l’identificazione successiva può avvalersi di prove biochimiche o di altro tipo. Se la suddivisione in gruppi di
Lancefield non consente un’identificazione soddisfacente per le esigenze cliniche, si può ottenerne una
completa con un sistema commerciale, associandola ai risultati delle prove di sensibilità. In alcuni casi,
avvalendosi dell’aspetto delle colonie, informazioni cliniche ed esperienza dell’operatore, si possono
omettere le prime fasi dell’identificazione (colorazione di Gram e catalasi) e procedere ad altri accertamenti.
Tutte le prove di identificazione devono in teoria essere eseguite con colonie sviluppate su agar non selettivi.
Porre particolare attenzione ad isolati che forniscono identificazione insolita. Alcune confezioni commerciali
possono fornire risultati d’identificazione inattendibili per gli streptococchi Į-emolitici. Se è richiesta la
conferma dell’identificazione, inviare i ceppi ad un Laboratorio di Riferimento che esegua l’identificazione
tassonomica degli streptococchi o di altri generi batterici correlati Gram positivi, catalasi negativi. In teoria.
tutte le prove d’identificazione devono essere eseguite con crescite da agar non selettivo.
INFORMAZIONE TENICA
N/D
IDENTIFICAZIONE DI SPECIE STREPTOCOCCUS, SPECIE ENTEROCOCCUS E MICRORGANISMI MORFOLOGICAMENTE
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1
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA27-37
Microrganismi di Gruppo di Rischio 2.
Fare riferimento alle linee guida sulla sicurezza della manipolazione per tutti i microrganismi
presentati in questo documento.
Eseguire le procedure di laboratorio che generano aerosol infettivi in cabina di sicurezza
microbiologica.
Le linee guida precedentemente esplicitate devono essere supplementate con la COSHH locale e
con la valutazione del rischio.
E’ essenziale il rispetto delle regolamentazioni di spedizione postale e di trasporto.
2
MICRORGANISMI BERSAGLIO
Specie Streptococcus segnalate come causa di infezione nell’uomo2, 6, 8-12, 14, 16, 18-20, 24
Streptococchi con antigene A-G del gruppo Lancefield
Group A
Le sottospecie di Streptococcus pyogenes (Streptococcus anginosus e Streptococcus constellatus
sottospeciie constellatus possono manifestare reazione crociata con l’antigene di gruppo A di
Lancefield)
Group B
Streptococcus agalactiae
Group C
Streptococcus dysgalactiae sottospecie equisimilis, Streptococcus equi sottospecie equi,
Streptococcus equi sottospecie zooepidemicus (Streptococcus anginosus e Streptococcus
constellatus sottospecie pharynges possono manifestare reazione crociata con l’antigene di gruppo
C di Lancefield)
Group D
Specie Enterococcus (consultare di seguito)
Streptococcus bovis
Streptococcus gallolyticus
Group F
Streptococcus anginosus
Streptococcus constellatus sottospecie constellatus
Group G
Streptococchi di Gruppo G (Streptococcus anginosus e Streptococcus constellatus sottospecie
constellatus possono manifestare reazione crociata con l’antigene di gruppo G di Lancefield)
Altri streptococchi
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus suis
Gruppo Streptococcus anginosus
Streptococcus anginosus
Streptococcus constellatus sottospecie constellatus
Streptococcus constellatus sottospecie pharyngis
Streptococcus intermedius
Gruppo Streptococcus mutans
Streptococcus mutans
Streptococcus sobrinus
IDENTIFICAZIONE DI SPECIE STREPTOCOCCUS, SPECIE ENTEROCOCCUS E MICRORGANISMI MORFOLOGICAMENTE
SIMILI
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Gruppo Streptococcus sanguinis
Streptococcus cristatus
Streptococcus gordonii
Streptococcus sanguis
Streptococcus parasanguinis
Gruppo Streptococcus mitis
Streptococcus mitis
Streptococcus oralis
Gruppo Streptococcus salivarius
Streptococcus salivarius
Streptococcus vestibularis
Varianti nutrizionali di streptococchi
Granulicatella adjacens
Abiotrophia defectiva
Granulicatella elegans
Specie Enterococcus segnalate come agenti di infezioni nell’uomo
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Enterococcus casseliflavus
Enterococcus dispar
Enterococcus durans
Enterococcus flavescens
Enterococcus gallinarum
Enterococcus raffinosus
Altri generi segnalati come agenti di infezioni nell’uomo
Specie Aerococcus
Specie Facklamia
Specie Gemella
Specie Globicatella
Specie Helcococcus
Specie Lactococcus
Specie Leuconostoc
Specie Pediococcus
3
IDENTIFICAZIONE
3.1
ASPETTO
MICROSCOPICO
Colorazione Gram (consultare BSOPTP 39 – Procedura di Colorazione)
Le specie Streptococcus, Enterococcus e Lactococcus sono Gram-positive, con cellule rotonde od
ovali disposte a coppie, in corte o lunghe catenelle e talvolta a grappolo.
Streptococcus pneumoniae sono Gram-positivi, di forma lanceolata disposti in coppie, spesso dotate
di capsula visibile.
Le specie Aerococcus, Pediococcus, Facklamia, ed Helcococcus sono cocchi Gram-positivi disposti
a grappolo o tetradi.
Le specie Gemella e Leuconostoc sono cocchi Gram-positivi disposti in coppie, grappoli e corte
catenelle (Gemella possono essere facilmente decolorate).
IDENTIFICAZIONE DI SPECIE STREPTOCOCCUS, SPECIE ENTEROCOCCUS E MICRORGANISMI MORFOLOGICAMENTE
SIMILI
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3.2.
TERRENI DI ISOLAMENTO PRIMARIO
Agar sangue incubato in 5 - 10% di CO2 a 35°C – 37°C per 16 – 48 ore o in anaerobiosi a 35°C 37°C per 16 - 24 ore per i tamponi faringei (consultare BSOP 9 - Ricerca su tamponi faringei).
Agar Staf/Strep incubato in aerobiosi a 35°C – 37°C per 16 - 48 ore.
Agar CLED incubato in aerobiosi a 35°C – 37°C per 16 - 24 ore.
Agar per anaerobi esigenti incubato in anaerobiosi 16 - 48 ore.
3.3
ASPETTO COLONIE
Microrganismo
“gruppo”
Streptococchi ȕ-emolitici
Emolisi
Streptococchi “viridans”
Į o non
Enterococchi
Į, ȕ o non
Le colonie sono di dimensioni maggiori di quelle
degli streptococchi, di solito 1 – 2 mm, aspetto
umido. Emolisi di tipo variabile
S. pneumoniae
Į
Colonie di 1 – 2 mm possono apparire a ‘pedina di
dama’. Dopo incubazione anaerobica le dimensioni
delle colonie possono essere maggiori e di aspetto
mucoso
“S. anginosus”
Į, ȕ or non
VNS
Į or non
Colonie piccole (” 0.5 mm), emolisi di tipo variabile.
Alcuni ceppi possono presentare un addensamento
bianco sopra la colonia
Colonie piccole (” 0.5 mm), per la crescita
richiedono piridossale
Specie Aerococcus
Į
Assomigliano a streptococchi “viridans”
Specie Facklamia
Į or non
Assomigliano a streptococchi “viridans”
Specie Gemella
Į or non
Assomigliano a streptococchi “viridans”
Specie Globicatella
Į
Specie Helcococcus
non
Specie Lactococcus
Į or non
Assomigliano ad enterococchi
Specie Leuconostoc
Į or non
Colonie di 0.5 - 1.0 mm, margine continuo
Specie Pediococcus
Į or non
Assomigliano a streptococchi “viridans”
ȕ
Caratteristiche di crescita su agar sangue dopo
incubazione a 35°C - 37°C per 16 – 24 ore
Circa 0.5 mm, margine continuo, possono
assumere aspetto asciutto, può essere difficile
prelevare le colonie dalla piastra
Le colonie sono di 0.5 - 1.0 mm, margine continuo
Assomigliano a specie Aerococcus
Colonie di 0.5 - 1.0 mm, margine continuo
IDENTIFICAZIONE DI SPECIE STREPTOCOCCUS, SPECIE ENTEROCOCCUS E MICRORGANISMI MORFOLOGICAMENTE
SIMILI
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3.4
PROCEDURE DI PROVA
Prova della catalasi (consultare BSOPTP 8 – Prova della Catalasi)
Gli Streptococchi ed i microrganismi di aspetto morfologico simile sono solitamente catalasi-negativi.
Prova della idrolisi bile-esculina (consultare BSOPTP 2 –Prova di Idrolisi dell’Esculina)
Enterococchi, streptococchi di Lancefield di Group D e lattococchi idrolizzano l’esculina in presenza
di bile al 40%, gli altri streptococchi sono negativi. Alcuni ceppi delle specie Aerococcus possono
idrolizzare l’esculina.
Prova di Sensibilità all’optochina (consultare BSOPTP 25 – Prova dell’Optochina)
S. pneumoniae è di solito sensibile all’optochina, gli altri streptococchi sono solitamente resistenti.
Occasionalmente alcuni ceppi di S. oralis, S. mitis e S. pseudopneumoniae possono essere sensibili
all’optochina.
Classificazione di gruppo degli Streptococchi (confezione commerciale)
Per gruppi di Lancefield A, B, C, D, F e G. Si possono verificare reazioni crociate.
PYR11 - pyrrolidonyl arylamidasi (PYR-aminopeptidasi)
Enterococchi e S. pyogenes sono positivi, gruppo S. bovis e gruppo S. anginosus sono negativi.
Prova di solubilità nella bile (opzionale) (consultare BSOPTP 5 – Prova di solubilità nella bile)
S. pneumoniae è solubile nei sali biliari al 10%, S. pseudopneumoniae è parzialmente solubile e gli
altri streptococchi Į-haemolytic non sono solubili.
Confezione d’identificazione commerciale
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SIMILI
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Riassunto risultati delle prove
Gruppo B, C, F,
eG
S. pneumoniae
Gruppo D
Enterococchi
S. bovis
Specie
Aerococcus
Gruppo A
Gruppo S.
anginosus
Streptococchi
“viridans”
Specie
Falklamia
Specie Gemella
Specie
Globicatella
Specie
Helcococcus
Specie
Leuconostoc
Specie
Pediococcus
Presenza di
antigene di
gruppo
Lancefield
Prova di
sensibilità
all’optochina19
Catalasi
Idrolisi Bile
Esculina
(Confezione
commerciale)
+
(BSOP TP 25)
(BSOP TP 8)
(BSOP TP 2)
R
-
-
-
+
+
+
-
S
R
R
R
R
v
v
+
+
+
v
d
+
d
+
v
R
R
-
v
+
-
-
v
-
-
R
-
-
+
-
R
R
w
-
+
+
+
R
-
-
+
d
d
+
-
v variabile R resistente
w reazione debole
3.5
R
cr
S sensibile
R
cr reazione crociata
-
PYR
d 6 - 84 % di ceppi positivi
IDENTIFICAZIONE SUCCESSIVA
N/D
3.6
CONSERVAZIONE ED INVIO
Se richiesto, eseguire la sottocoltura dell’isolato puro su agar sangue a becco di clarino per l’invio al
Laboratorio di Riferimento.
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Į-emolisi
Alcuni S. pneumoniae
possono essere
resistenti alla optochina:
Se sospetto clinico di
infezione pneumococcica,
confermare saggiando la
solubilità nella bile
S. pneumoniae:
Sensibile
Optochina
non emolisi
Streptococchi
“viridans”:
Resistente
&
PYR positiva, LAP negativa
considerare
Globicatella,Aerococcus
viridans, Dolosicoccus
(PYR & LAP positive)
Per PYR e LAP positive
considerare
Aerococcus,Lactococcus,
Fraklamia, Dolisigranulus.
Enterococcus ssp
Positiva
Negativa
Considerare
Aerococcus,
Pediococcus
Gruppo B di Lancefield
Gruppo S. anginosus
(Esculina +, PYR-)
(o PYR o gruppo)
Idrolisi rapida dell'Esculina
(1-2 mm possono essere Į, ȕ o non emolitici.
Considerare i rilievi clinici
Sospetto Enterococcus
Positiva
Gruppo A
Positiva
Gruppo S. anginosus
PYR
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Non classificabili
in gruppi (ripetere, considerare
Listeria, verificare le prove
precedenti)
Gruppo Lancefield
Ǻeta-emolisi
Positiva
(Probabile Staphylococcus)
Può essere prodotta debole reazione della catalasi o
pseudocatalasi prodotta da alcuni ceppi di specie
Aerococcus e Enterococcus
A ,B,C,D,F,G
(A,C,G, considerare
il gruppo S.
anginosus)
Identificazione successiva su indicazione clinica
Identificazione con confezione commerciale o con identificazione biochimica di altro tipo,
oppure inviare al Laboratorio di Riferimento
(Considerare Leuconostoc
Gemella, Helcococcus)
Occasionalmente ceppi
di S. oralis possono essere
optochina sensibili:
S. pseudopneumoniae
optochina sensibile,
solubilità nella bile
non definibile
(Considerare Gemella)
Negativa
Catalasi
Cocchi Gram positivi in coppie o corte catenelle
Colorazione Gram
(sangue, CLED, terreno Staf/Strep o agar per anaerobi esigenti)
Piastra di isolamento primario
Campioni clinici
4 IDENTIFICAZIONE DI STREPTOCOCCHI ED ENTEROCOCCHI - DIAGRAMMA DI FLUSSO
5
REFERTAZIONE
5.1
IDENTIFICAZIONE PRELIMINARE
Se si riscontrano appropriate caratteristiche di crescita, aspetto della colonia, colorazione Gram della
coltura, catalasi e risultati sierologici.
5.2
CONFERMA DELL’IDENTIFICAZIONE
Successiva all’identificazione biochimica/sierologica e/o referto del Laboratorio di Riferimento.
5.3
MEDICO MICROBIOLOGICO
Informare il medico microbiologo di tutti gli isolati con identificazione preliminare e confermata di
specie Streptococcus, Enterococcus, e di microrganismi morfologicamente simili, isolati da campioni
prelevati da sedi normalmente sterili.
Per motivi correlati a potenziali malattie invasive, allo sviluppo di sequele di tipo immunologico o
mediate da tossine, segnalare al medico microbiologo, secondo i protocolli locali, gli isolati di
Streptococcus pyogenes ritenuti di “nuovo isolamento” ed i microrganismi dotati di antigeni C o G di
Lancefield che sviluppano “grosse colonie”.
Considerare la possibilità d’informare il medico microbiologo, secondo i protocolli locali, quando il
modulo di richiesta contiene informazioni importanti od aggiuntive che fanno sospettare un’infezione
streptococcica grave o di tipo invasivo quale:
x
Fenomeni mediati da tossina (Sindrome da Shock Tossico o Scarlattina)
x
Fascite (necrotizzante) o miosite, sepsi puerperale
x
Endocardite
Ricerca di possibile epidemie o sospette infezioni crociate in ospedale od in altre istituzioni.
Profili insoliti di resistenza antimicrobica di specie Enterococcus, includenti vancomicina o altro
glicopeptide, e resistenza di S. pneumoniae alla penicillina.
Secondo i protocolli locali il medico microbiologo deve essere informato degli isolati di streptococco
ȕ-emolitico di Gruppo B di Lancefield quando:
x
La paziente è gravida, nell’immediato post partum o neonato
Seguire I protocolli locali per la refertazione al medico del paziente
5.4
CCDC
Fare riferimento al Memorandum locale di Informazione.
5.5
CENTRO PER INFEZIONI38
Fare riferimento alle linee guida attuali del CDSC ed alle indicazioni del COSURV.
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5.6
GRUPPO DI CONTROLLO DELLE INFEZIONI
In accordo con i protocolli locali, informare il gruppo di controllo delle infezioni degli isolati di
streptococchi di Gruppo A, specie Enterococcus glicopeptide resistenti e pneumococchi penicillina
resistenti isolati da pazienti degenti. Secondo le disposizioni locali si deve anche valutare la
possibilità di informare il Gruppo di Controllo delle Infezioni sull’entità di questi isolamenti in pazienti
che sono attualmente presenti in comunità (incluse le istituzioni per infermiere professionali), in
modo particolare nel caso di sospetta trasmissione crociata.
6
RIFERIMENTI
6.1
LABORATORI DI RIFERIMENTO
Per informazioni sugli accertamenti disponibili, tempi di risposta, procedure di trasporto ed altre,
riguardanti il laboratorio di riferimento, rivolgersi a:
http://www.hpa.org.uk/cfi/reference_tests_index.htm
Streptococcus and Diphtheria Reference Unit
Respiratory and Systemic Infection Laboratory
Health Protection Agency Centre for Infection
61 Colindale Avenue
London
NW9 5HT
http://www.hpa.org.uk/cfi/rsil/rsiluser.pdf
Enterococci:
Laboratory of Hospital Infection
Centre for Infections
61 Colindale Avenue
London
NW9 5HT
http://www.hpa.org.uk/cfi/dhcaiar/DHCAIAR_User_Manual.pdf
Contattare il centralino principale: Tel. +44 (0) 20 8200 4400
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7
RINGRAZIAMENTI E CONTATTI
Questo Metodo Nazionale Standard è stato sviluppato, revisionato e controllato dallo Standard
Methods
Working
Group
for
Bacteriology
(http://www.hpastandardmethods.org.uk/wg
bacteriology.asp). Si ringraziano per la collaborazione i numerosi operatori dei laboratori di
batteriologia e le organizzazioni specialistiche che hanno fornito informazioni e commenti durante lo
sviluppo di questo documento, ed il Redattore Medico per la revisione finale.
I Metodi Nazionali Standard Method sono emessi dalla Standards Unit, Evaluations and Standards
Laboratory, Centre for Infections, Health Protection Agency London.
Per altre informazioni prendere contatti con:
Standards Unit
Evaluations and Standards Laboratory
Centre for Infections
Health Protection Agency
Colindale
London
NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
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IDENTIFICAZIONE DI SPECIE STREPTOCOCCUS, SPECIE ENTEROCOCCUS E MICRORGANISMI MORFOLOGICAMENTE
SIMILI
Revisione no: 2.1 Data di revisione: 14.09.07 Emesso da: Standards Unit, Evaluations e Standards Laboratory
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IDENTIFICAZIONE DI SPECIE STREPTOCOCCUS