studio di aggregati neuronali
microelettrodi
MACROELE TTRODI
ELETTROCORT ICOG RAMMA (EcoG)
ELET TROENCEFALOGRAMMA (EEG)
EEG: registrazione oscillazioni dell’attività elettrica di ampie popolazi oni di
neuroni cerebrali
Misura del flusso di corrente extracellulare generato dalla somma delle attività di
un numero elevato di neuroni
Tecnica: almeno 2 elettrodi, uno attivo ed uno indif ferente (di rif erimento, di
referenza)
Si mi sura sempre la differenza di potenziale tra i due elettrodi; siano entrambi attiv i
o attivo-indif ferente.
Collocazi one degli elettrodi: sistema 10-20
Distanza tra gli
elettrodi
EEG: di v eglia, in rilassamento, di sonno, durante stimolazioni sensoriali.
POTENZIA LE EVOCA TO SENSORI ALE o POTENZIALE EVENTO
CORRELATO:
attività EEG correlata ad uno specifico stimolo sensoriale signif icativo
ANA LISI EEG:
proprietà temporali (f requenza delle onde di cui è composto) e spaziali dei
tracciati EEG
analisi dell e frequenze si rif à all’analisi di Fourier:
la f unzione di una v ariabile (i l vol taggio in funzione del tempo) si può esprimere
come una serie di armoniche di onde sinusoidal i. L’EEG si può analizzare
usando filtraggi elettronici o ricorrendo anche ad algoritmi che sv iluppano una
serie di Fourier.
RAN GE EEG UMANO NORMALE: 1-30 Hz; 20-100 µV.
Ampiezza onde è attenuata dal cranio, scalpo, meningi, liquido crebrospinale.
Il range di frequenze è suddiviso i n BAND E o gruppi di f requenze:
delta 0,5-4 Hz
theta 4-7 Hz
alfa 8-13 Hz
beta 13-30 Hz
sonno profondo
sonno
vegli a rilassata
attività mentale intensa
F–C–P–O–T
F–C–P–O–T
P–O
F
vi sualizzazione da parametri ottici: nuova tecnica di visualizzazione ad alta
risoluzione spaziale di popolazione neuronali ricorrendo a traccianti sensibili al
voltaggio (rispondono a variazioni del potenziale di membrana cambiando spettro
di f luorescenza) INV ASIVA
neuroni cambiano loro fluorescenza intrinseca in funzi one dell’attività
tipologie di cellule cerebrali:
CELLULE PI RAMIDALI
- gli assoni proiettano ad altre regioni cerebrali e a midoll o;
- eccitatori;
- glutammergici;
- principali neuroni di proiezione delle corteccia;
- collaterali assoniche ricorrenti che proiettano localmente
(molti mm in piani paralleli)
(ruolo genesi di attività globale EEG e accessi epilettici)
- organizzazione dendritica x f acilitare integrazione vari segnali af ferenti
(dendriti apicali attraversano diversi strati corticali ma sono
sempre orientati perpendicolarmente alla superficie corticale
af ferenze da div ersi strati corticali);
- regioni sui dendriti che generano potenziali d’azione per amplificare
correnti sinaptiche
SONO FONTE PRINCI PALE DEI P OTENZI ALI (EEG)
CELL ULE NON PIRAMIDALI
- corpi cellulari ovali
- assoni non lasciano la corteccia (terminano su neuroni vicini =>
interneuroni corticali)
- morfol ogia eterogenea
cellule stellate:
assone orientato verticalmente sul piano
delle colonne
ricevono info dai neuroni talamici e
ritrasmettono
a interneuroni o a c. piramidali di stessa
colonna
(es. corteccia visiva con spine dendritiche)
cellula a canestro:
assoni orientati orizzontalmente;
forma fitte connessioni sinaptiche che
avviluppano il soma dei neuroni postsin-;
contengono grandi quantità di ac.
glutammico-decarbossilasi (catalizzatore di
GABA): responsabile di inibizione
pericolonnare (ogni colonna indipendente e
indisturbata da quelle vicine)
POTENZIA LI EV OCATI SE NSORIA LI
Variazione specifica dell’EEG in conseguenza a stimolazi one di una via sensoriale
(potenziali evento-correlati dipendono dal contesto: stimolo atteso o improvviso)
estrazione del PE grazie a programmi che calcolano la risposta media di risposte
singole ripetute per aumentare il rapporto segnale-rumore
si registra EEG mentre si provocano stimoli ripetitiv i
registrazione di campioni di EEG prima, durante e immediatamente dopo la
stimolazione
Averaging
nei potenziali sensoriali: diverse componenti correlate a processi di elaborazione
sottocorticale e corticale dei segnali sensoriali
(anche se registrazioni EEG sono essenzialmente corticali)
elaborazione delle caratteristiche fi siche dello stimolo: perciò PE utili in clinica x
valutare stato funzionale dei sistemi sensoriali e accertare presenza malattie
demielinizzanti (sclerosi multipl a)
in tal caso veloci tà ridotta della trasmissione nervosa cioè della conduzione
assonica:
latenza più breve
COMPONENTI PRECOCI
latenza più breve
COMPO NENTI TARDI VE
f (x) corticali superiori
POTENZIALI EV OCATI UDITIVI
potenziali evocati del tronco dell’encefalo o potenziali di campo l ontano
prima onda rif lette attiv ità orecchio interno e seguita da potenziali
generati dai principali nuclei di ritrasmissione uditivi del ponte e del
mesencefal o e dalla propagazione dei segnali lungo v ie uditiv e;
onde successive originano nel nucleo di trasmissione talamico e nella
corteccia
Potenziali uditivi evento-correlati mediati da aree uditiv e superiori e da cortecce
associative hanno latenze maggiori a quelle dei potenziali evocati sensoriali.
Ampiezza di tali potenziali dipende dal contesto in cui lo stimol o è presentato.
DOVE VI ENE GENERAT O L’EEG (flusso di correnti)???
Registrazione extracellul are attraverso macroelettrodi: registrazione in siti lontani
dalle sorgenti.
EEG ( ECG) si basano su teoria del volume conduttore: descrive il flusso delle
correnti ioniche generate da cellule nervose o muscolari nello spazio extracellulare.
Scalpo: v ariazioni di potenziale
Corteccia (miglialia di neuroni sottostanti): somma dell e correnti ioniche
Corrente ionica netta = voltaggio esistente attraverso la resistenza dello spazio
extracellulare.
Esempio: un neurone singol o!
Flusso di corrente generato da un potenziale post sinaptico eccitatorio del dendrite apicale di
una cellula corticale piramidale.
Potenziale postsinaptico eccitatorio (EPSP) generato da una corrente (I EPSP ) che va
verso l’interno attraverso la mem brana extrasinaptica.
Registrazione intracellulare: vol taggio come resistenza totale data da resistenza di
membrana R m e resistenza extracellulare Rex. Viene misurato in V m
Rex molto piccolo rispetto a Rm quindi trascurabile = v oltaggio è corrente per
resistenza di membrana
IEPSP x R m
Genesi:
una corrente (I EPSP ) che attraversa la membrana (ad alta resistenza Rm ) induce
variazione di potenziale attraverso la mem brana (∆V m ) molto maggiore di quel la
che produce quando attraversa la resistenza extracellulare Rex .
Quindi : potenziali intra sono ampi (mil liv olt) mentre quelli extra sono piccoli
(microvolt).
… MA MICROELETTRODO MISURA ATTIVITA’ DI TA NTE CELLULE
si registra attivi tà di neuroni prossimi alla punta di un elettrodo
allontanando elettrodo da sorgente, ampiezza potenziali diminui sce con radice
quadrata della distanza.
Ampiezza dei potenziali è un f attore critico quando punta elettrodo lontano da
neuroni attivi
(registrazione da scalpo) = somma attività di molti neuroni (poco selettivo)
migliaia di neuroni corticali sono attivati sincronamente da af ferenze talamiche
segnale talamico
minimo in strati profondi ( dove sono sinapsi
eccitatorie) e sorgente in strati superficial i
EEG
potenziali extracellulari di potenziali d’azione?
CONT RIBU ISCONO poco a EEG di superficie ( tranne che se scaricano tanti in
sincronia)
EEG è flusso di corrente extracellulare generato da sommazione di potenziali
postsinaptici di cellule piramidali attivate.
Piramidali : orientamento parallelo l’una rispetto all’altra e dendriti apicali
perpendicolari a superficie corticale.
Non piramidali e glial i senza orientamento specifico tra di loro e contributo è
minimo (dispersione)
Potenziali sinaptici contribuiscono a EEG + dei potenziali d’azione poiché sono +
lenti e con una sommazione + ef fi cace.
ACC ESSI EP ILETTICI
Neuroni interconnessi tra di loro in stessa area e tra aree dif ferenti
Elaborazione in serie ed in parallelo.
SINCRONI ZZAZI ONE abnorme di scarica di ampi aggregati neuronali
Sincronizazione può scatenare ACCESSO EPILETTICO:
Alterazioni parossistiche stereotipate ed invol ontarie del comportamento
- Movimenti a scatti
- Attimi assenza di coscienza
- Convulsioni generalizzate
- Perdita totale di coscienza
Causa di tale scarica anormale:
Traumi
Ischemia
Tumori
Inf ezioni
Stati tossic
50% dei casi senza etiologia specif ica
dopo ictus epilessia è la più comune malattia neurologica: 0.5%-1% di
incidenza in popolazione
accessi epilettici parziali e generalizzati
A.E.
parziali
o focali
A.E.
parziali
complessi o
psicomotori
A.E.
generalizzati
non focali
accessi epilettici parziali o focali:
- iniziano in una regione cerebrale circoscritta e vi rimangono,
diffondendo solo nelle aree immedi atamente circostanti
- non alterano necessariamente coscienza
- manif estazioni cliniche f unzione delle aree interessate (limitate)
se originano in area motoria attività elettrica diff onde dal f ocolaio alle aree
vi cine interessando gruppi di muscoli in sequenza (mano, polso, gom ito,
spalla, faccia, gambe)
accessi motori jacksoniani: paziente cosciente se accesso circoscritto ad un
emisfero
accessi epilettici parziali complessi o accessi epilettici psicomotori:
- complesse allucinazioni sensoriali
- complessi atti motori semif inali zzati
sono causati da interessamento di lobo temporale e corteccia orbitofrontale (sistema limbico)
epilessia generalizzata o non focale:
- da subito colpisce aree estese e distanti tra loro
- causa sempre perdita di coscienza
si registrano punte EEG ma tale attiv ità parossistica non è circoscritta
apochi elettrodi : tutto scalpo
Div erse forme tra cui:
PETIT MAL
e
GRAND MAL
Accessi epilettici di petit mal
- tipici di infanzia, con perdita transitoria della coscienza (assenza);
- durante tali accessi epilettici complessi punta-onda, f req.: 3 c/ secondo;
- interruzione processi percettivi-cognitivi-mnestici f ino a f ine crisi;
- tono muscolare mantenuto: raramente cadono in terra.
Accessi epilettici di grand mal
- improvvisa perdita di coscienza e controllo posturale;
- insorgenza movim enti tonico-clonici (contraz. muscolari-mov. a scosse);
- sintomi possono persistere anche oltre la fi ne dell’accesso epilettico.
EEG normale
Onde di grande ampiezza quando c’è sincronizzazione di gruppi neuronali
Alpha ad ampio voltaggio
Theta
Delta
Sincronizzazione anche durante gli spike EEG e i complessi punta-onda
Applicazione transitoria di farmaci convulsivanti sulla corteccia di animali da
laboratorio
Penicill ina a dosi elevate blocca inibizione GABAergica che f acilita epilessia f ocale
acuta (senza variazioni morf ologiche macroscopiche)
Applicazione di crema di ossido di alluminio può produrre epilessia focale cronica
(con v ariazioni morfologiche: riduzi oni spine dendritiche, arborizzazione dendritica
o numero sinapsi inibitorie)
Stimolazione elettrica ripetitiva può causare alterazioni EEG circoscritte,
probabilmente anche a livello morf ologico
Accessi f acilitati con stimolazione elettrica ad alta f requenza in aree limbiche
(negli animali i n amigdala):
KINDLI NG o accensione: m odificazione a lungo termine delle proprietà dei
neuroni: a distanza di mesi dal kindling si può indurre epilessia con relativamente
pochi stimoli elettrici.
Modelli sperimentali di accessi epilettici generalizzati
Penicill ina a dosi tossiche per via sistemica.
Modelli genetici
Animali colpiti dopo particolari perturbazioni presentano tipici complessi puntaonda e convulsioni
QUA LI SONO MECCANISMI CE LLULARI CHE INDU CONO I NSORGENZA
DI ACCESSI EPILETTICI FO CALI ?
COME UN ACCESSO EPILETTICO FOCALE PUÒ TRASFO RMARSI I N
GENE RALIZZATO?
QUA LI SONO I MECCANISMI DEGLI ACCESSI EPILE TTICI
GENE RALIZZATI?
PRIMO ev ento elettrico anormale dell’EEG:
comparsa sull’EEG di onde negativ e intermittenti di elevato
voltaggio dette punte interictali poiché assomigli ano alle onde
a punta visibili nell’EEG tra un accesso all’altro.
Quando diventano più frequenti tendono ad associarsi con onde
negative più lente.
due componenti:
una rapida (a punta)
una lenta (ad onda)
possono comparire associate a onde rapide basso voltaggio.
Punta interictale registrabile in superficie con elettrodi
nel f ocolaio:
si osserva un potenziale depolarizzante a rapida
insorgenza (onda di depolarizzazione parossistica)
in corrispondenza della componente iniziale della
punta interictale.
A questo potenziale si sovrappone spesso una raffica di potenziali d’azione.
Onda depolarizzazione parossistica ha origine da un potenziale postsinaptico
eccitatorio più grande della norma e dalla sua eccezionale ampli fi cazione
particolari caratteristiche intrinseche (voltaggio-dipendenti) dell a membrana
Tali potenziali possono essere bloccati da tetrodotossina (che blocca canali Na+ ) e
pertanto dipendono da aumentata conduttanza al Na+.
I potenziali d’azione a lunga durata sono bloccati da Mg++ che blocca i canali Ca ++
Probabilmente zone dendritiche sono degli amplificatori delle correnti sinaptiche
che originano in zone lontane dalla zona d’innesco dei potenziali d’azione
(innesco assonico) che fanno si che insorgano potenziali d’azione.
Durante accesso epilettico equilibrio è sbilanciato verso eccitamento: potenziale
postsinaptico eccitatorio può innescare raff ica di potenziali d’azione dendritici
(potenziali Ca ++ -dipendenti) che sommandosi provocano comparsa di ampia e
prolungata depolarizzazione.
Punta interictale: l’attivazione sincrona della popolazione neuronale
COME AVVIENE LA SINCRONI ZZAZIONE?
Di soli to grosso peso per inibizione: in epilessia meccanismi responsabili di
sincronizzazione basati sulla diminuzione di ini bizione sinaptica.
in corteccia diminuisce inibizione GABAergica
raff iche di potenziali d’azione che eccitano fortemente le loro cellule bersaglio
Ippocampo: di minuendo ini bizione GA BA aumenta eccitazione di neuroni
bersaglio e dei neuroni eccitati dai bersaglio.
Dopo blocco di azione GABA possibi lità di eccitare neuroni bersaglio sale dal 5%
al 30%.
Blocco GABA
attivazione sincrona di popolazioni neuronali
Grazie a raff ica di molti potenziali d’azione
(se uno solo si ha poca possibili tà: sommazione temporale)
Altri meccanismi :
eventi extracellulari (sommazione correnti extracellul ari)
variazioni ambiente ionico (accumulo ioni K + in spazio extracell.)
MA PUNTE INTERICTALI E AC CESSI EPILETTI CI FOCALI
SPESSO SONO LI MITATI A POCH E ZONE CEREBRALI
COME MAI?
Onda di depolarizzazione parossistica (e raf fi ca di pot. d’azione) vi ene seguita da
periodo di iperpolarizzazione durante cui si ha riduzione eccitabilità corticale.
Limite a diff usione di accesso epilettici
in corteccia sinapsi inibitorie molto potenti
apertura canali K +voltaggio-dipendenti e Ca++-dipend.
in corteccia GABA e enzima che lo sintetizza (acido glutammico-decarbossilasi)
identificati in cell ule non piramidali che sono detti neuroni privi di spine
(dendritiche)
i neuroni GA BA ergici proiettano localmente (ad eccezione di cellula di
Purkinje)
organizzazione complessa : non solo annullamento eccitazione
di norma, sinapsi inibitorie
sinapsi eccitatorie
local izzate vicino al som a
dendriti
es. cellule a canestro sono interneuroni inibitori che si connettono ai neuroni
piramidali (con ruolo ini bitorio diretto in genesi di potenziali d’azione)
oltre a posizioni strategiche hanno anche capacità di azioni a lunga durata (f ino a
10-20 volte in più)
COME PROVO CARE SPERIMENT ALMENTE ACCESSI EPILETTICI
GENE RALIZZATI?
Evi denza: complesso punta-onda simultaneamente su aree diverse della corteccia.
Babbuini
complessi punta-onda dif fusi e convulsioni
generalizzate con stimolazioni fotiche ripetitive
Gatto
elevate dosi di peni cillina x via sistemica…
petit mal (situazione sim ile)
Inibizione intracorticale a lungo termine presente solo tra un potenziale
eccitatorio e l’altro
Oscill azioni EEG sia corticali che talamiche