Metodi di conta
microbica
esistono
differenti
metodiche
per
la
determinazione quantitativa dei microrganismi
tecniche colturali e non colturali
conta diretta ed indiretta
il tipo di microrganismo/i ed il tipo di campione
possono necessitare di specifiche tecniche
Conta in piastra
Si basa sulla produzione di colonie microbiche, a
partire da singole cellule, su terreni agarizzati
Unità formanti colonia = UFC
Le cellule devono essere vive e vitali (viable cell
count)
Il terreno deve essere appropriato al tipo di
conta
Fase critica: preparazione del campione
Preparazione del campione
Stato fisico del campione (solido, liquido, ecc.)
Prelievo e trasporto del campione (sterilità e
tempi)
Rappresentatività del campione
Uso del mixer o dello stomacher
Uso delle diluizioni seriali
diluizioni
diluizioni
Semina in piastra
Conta in piastra
Si contano le piastre con 20-200/30-300 colonie
Si moltiplica il numero delle colonie contare per
l’inverso del fattore di diluizione
Si riporta tutto al ml o g di campione
È preferibile operare la semina in doppio o in
triplo per aumentare la precisione
Conta in piastra
Sistema alternativo:
N=
ΣC
_
V(n1 + 0,1n2) . d
ΣC = somma delle colonie nelle piastre considerate
V = volume dell’inoculo seminato
n1= numero delle piastre considerate, per la prima diluizione
n2 = numero di piastre considerate, per la seconda diluizione
d = fattore di diluizione corrispondente alla prima diluizione
esempio
Volume inoculo 1,0 ml
Prima diluizione 10-2 : 168 e 215 colonie
Seconda diluizione 10-3 : 14 e 25 colonie
N = 168 + 215 + 14 + 25
= 422 = 19812
1 X [(1x2) + (0,1 x 2)] x 0,01 0,022
19812 = 1,9 x 104 UFC/g-ml
Sensibilità della metodica
Qual è la concentrazione limite che posso
determinare?
Se non ho nessuna colonia in piastra, come
esprimo il risultato?
Quante diluizioni devo fare?
Pregi e difetti
Tecnica versatile e relativamente economica
Permette di contare le sole cellule vive e vitali
Si può selezionare il terreno per contare solo specifici
microrganismi
Utile per campioni a concentrazione microbica medioalta
Poco sensibile
Non tiene conto dei VBNC
Richiede molto tempo (almeno 24h)
MPN – most probable number
Si basa sull’utilizzo di terreni liquidi
È un metodo statistico
Utile per test di conferma e per ricercare specie
microbiche in campioni a bassa concentrazione
Il più utilizzato è l’MPN simmetrico a 3 o 5 serie
di provette
MPN
Si allestiscono 3 o 5 serie di diluizioni decimali
(3-5 provette per ciascuna diluizione)
Si inocula una aliquota di campione in ciascuna
serie di provette
Si mette ad incubare in termostato per 24-48 ore
Si leggono i risultati riportando il numero di
provette (per ciascuna diluizione) in cui c’è
torbidità dovuta alla crescita microbica
MPN
Il risultato si confronta con delle tabelle statistiche (Mac
Crady)
MPN = N x F Vs
V
N = valore letto sulla tabella
F = fattore di diluizione della serie
V = fattore di diluizione base della tabella (1 – 0,1 - 0,5)
Vs = quantità di riferimento (es. 1ml, 25 g)
MPN
3-2-1 = MPN tab. 15
1:10
MPN = 15 x 10 x 1 ml = 150
1
1:100
1:1000
Membrane filtranti
Metodica utilizzata per l’analisi delle acque
Utile per campioni aventi una carica microbica
molto bassa
Concentrazione del campione
Uso di membrane sterili a porosità inferiore al
diametro delle cellule batteriche
Membrane filtranti
In questo caso la conta microbica richiede la
moltiplicazione del numero di colonie cresciute sulla
piastra per il fattore di concentrazione
Conta diretta al microscopio
È un sistema di conta diretta rapido
Permette di contare le cellule senza doverle
coltivare su terreni specifici
Non è possibile distinguere cellule vive da cellule
morte
Non permette di identificare particolari specie
microbiche
Misura della resistenza elettrica
Il contatore coulter permette di quantificare le
cellule misurando il variare della conducibilità
elettrica di un fluido in un elettrocapillare al
passare delle cellule microbiche.
Non distingue cellule vive da morte
È molto rapido
Può dare informazioni anche sulle dimensioni
cellulari
Quantificazione spettrofotometrica
Lo spettrofotometro è uno strumento che
misura la assorbanza o transmittanza di un fascio
di luce che attraversa un campione in soluzione
Relazione lineare tra assorbanza e
concentrazione di un soluto
Densità ottica (1 OD600nm ≈ 8,0 x 108 cellule di
E. coli)
Misurazione della massa microbica
Si può determinare il determinare il peso secco
di una soluzione contenente biomassa cellulare
Il peso è proporzionale al numero di cellule
presenti nel campione
Occorre standardizzare per ogni tipologia di
microrganismo
E’ una tecnica laboriosa
Utile per batteri filamentosi e muffe
Misurazione della massa microbica
Si centrifuga il campione cellulare
Si sottopone a 2-3 lavaggi
Si porta a secco in stufa 80-100°C
Si misura il peso secco del campione
Metodi chimici
Misurare la concentrazione di DNA, RNA,
proteine, ATP
Misurare la fluorescenza emessa da fluorocromi
selettivi (FISH, Baclight live/dead cell)
Misurare la quantità di substrato
consumata/prodotta nell’unità di tempo
PCR quantitativa