DIAGNOSTICA
OSSIDATIVA
Aldo Tomasi
Dipartimento servizi diagnostici e di
laboratorio, Università di Modena e Reggio
Emilia
Lo stress ossidativo: cos’è
Esiste una definizione (condivisa)?
•
A disturbance in the prooxidant-antioxidant balance in favour of the
prooxidant, leading to potential damage (H. Sies, 1985-1991)
•
Una modifica dell’equilibrio pro- anti ossidante a favore del primo,
con conseguenti potenziali danni.
•
The harmful condition that occurs when there is an excess of free
radicals, a decrease in antioxidant levels, or both.
•
Una condizione dannosa che avviene ogni volta che si forma un
eccesso di radicali liberi, ovvero un calo delle difese antiossidanti, o
di ambedue.
Fa male lo stress ossidatvo ?
Patologia umana e stress ossidativo (da
radicali liberi)
Ampio consenso sull’importanza di radicali liberi nella
patologia umana
Meccanismi
fisiopatologici:
–Infiammazione
–Cancerogenesi
–Autoimmunità
–Ischemia-riperfusione
–Tossicità da farmaci
Malattie:
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Aterosclerosi
Cancro
Infarto cardiaco
Ipertensione
Ictus
Shock
M. di Parkinson
Diabete
S. di Down
Trapianto d’organo
Da dove nasce lo stress
ossidativo?
Il problema nasce dal fatto che
respirariamo …...ossigeno
L’ossigeno, molecola strana
• L’ossigeno costituisce il 21% dell’atmosfera, e
l’89% del peso dell’acqua marina (come
componente della molecola dell’acqua)
• Per oltre un miliardo di anni l’ossigeno è stato
“liberato” nell’atmosfera dalla fotosintesi, da
batteri e alghe.
• Praticamente tutto l’ossigeno presente sulla
terra è il risultato di questi processi
• L’ossigeno è quindi un prodotto di “scarto”, (un
“inquinante?).
• Non dovrebbe essere quindi sorprendente il
fatto che l’ossigeno sia dotato di “tossicità”
• L’ossigeno atmosferico è quasi completamente
costituito da molecole costituite da due atomi di
ossigeno legate da un forte legame covalente.
• Una forma di ossigeno costituita da tre atomi
(ozono) è presente nell’alta atmosfera (è al suolo
in città inquinate)
• L’atomo di ossigeno può dare origine molto
facilmente a legami covalenti. E’ elettronegativo,
e quindi legami formati sono polari (idrofilia)
• La molecola di ossigeno è un di-radicale. In
quanto ha due elettroni spaiati in orbitali esterni.
La molecola dell’ossigeno è un diradicale libero
+
+
Elettrone mancante
Elettrone mancante
Reazioni radicaliche
DNA
lipidi
single- double
perossidazione
lipofuscine
-strand breaks
Reazioni modulate da
Ossidazione delle basi
metalli
ossigeno
Anti-ossidanti
proteine
Degradazione
Legami crociati
zuccheri
ossidazione
glicossidazione
Maillard
Attacco ossidativo e difese
antiossidanti
SOD
Vit. E
GSH
O 2 -. H O .
H2 O2 R .
idr
of
li
Come “funziona” un antiossidante
lip
of
ili
a ti
ci ,
No
ne
nz
im
No
ne
nz
im
a ti
ci,
GSH-reductase i
ti c
a
im
z
n
GSH
e
i
m
e
Un antiossidante
è tale solo in determinate condizioni;
t
s
i
S
tocoferolo
cambiando le condizioniascorbico
può agire come pro-ossidante.
GSSG Spesso è un radicale libero
deidroascorbico
tocoferilchinone
NADH
tà
i
n
u
m
m
/i
e
l
cinetiche di interazione
a
n
o
i
z
o
i
NAD
compartimentalizzazione
utr
n
o
t
Sta
concentrazione
equilibrio energetico
mobilizzazione
Come “funziona” un antiossidante
R.
RH
tocoferolo
radicale
tocoferile
Radicale
ascorbile
Radicale
ascorbile
ascorbato
Deidro ascorbato
Un buon marker (di stress ossidativo)
dovrebbe essere:
• Preciso, accurato, riproducibile
• Un prodotto rappresentativo
• Utilizzabile sia per studi cinetici che
“steady state”
• Utilizzabile su materiale congelato
• La dieta non dovrebbe costituire un fattore
confondente
Marker funzionali
• Spessore arterie (Doppler)
• Funzione endoteliale (Pulse
wave analysis)
• Perfusione (infrarosso in vivo)
Identificazione di marker di stress
ossidativo
• Misure indirette
–
–
–
–
–
–
–
Maillard
Lipofuscine
Pentosidina
Malonaldeide (TBAR)
Proteine carbonilate
Dieni coniugati
Ossidazione di
substrati
• Utilizzazione della
riserva funzionale
– Consumo di
antiossidanti
– Alterazione
dell’equilibrio redox
– Misura della “lag
phase”
– Misure di “resistenza
all’ossidazione
Identificazione di marker di stress
ossidativo (misure dirette)
Spettroscopia di Risonanza dell'Elettrone (ESR)
misura:
• radicali liberi
• metalli di transizione
• sensibilità:10-9 mole free spin
• le preparazione del campione non pone
problemi
• Svantaggi:
– Acqua assorbe le microonde
– Misure possibili solo su piccoli campioni
Malondaldeiyde (MDA o TBAR)
•
•
•
•
Un mebabolita importante, ma “tardivo”
Misura facile, poco costosa, riproducibile
Utilizzable su materiali congelati
Non è altamente specifico. (soluzione, utilizzare
metodiceh più costose e complesse; ad es. HPLC)
• E’ in parte influenzato dalla dieta
• Raccomandazioni: non usare in studie
epidemiologici; sì in studi caso-controllo, usare
HPLC.
E’ un buon marker di stress
ossidativo?
Misure di stress ossidativo: GSH
GSH (nmol 10^6 cells)
NAC PREVENTION OF BSO/D-RIB COMBINED
TREATEMENT IN PBMC
1
Ctrl
0.8
D-RIB+BSO
0.6
D-Rib + NAC 10 mM
0.4
D-Rib+BSO+NAC 10 mM
0.2
0
0
24
48
Hours
72
Fosfolipidi con Dieni coniugati
Origine dietetica
• Circa il 90% dei DC
nel plasma
• Si differenziano
utilizzando
tecniche complesse
Dieni coniugati da
stress ossidativo
Meno del <10% dei
DC totali nel
plasma
• Si differenziano
utilizzando
tecniche complesse
Fosfolipidi con Dieni coniugati
•
•
•
•
Un metabolita importante, ma “tardivo”
Misura facile, poco costosa, riproducibile
Utilizzabile su materiali congelati
E’ influenzato dalla dieta
E’ un buon marker di stress
ossidativo?
Diagnostica ossidativa ?
Sfortunatamente, si è venuta a creare una
notevole confusione riguardo al ruolo della
perossidazoine in patologia umana, soprattutto
per una inappropriata applicazione a campioni
umani di due tecniche: i dieni coniugati e la
reazione all’acido tiobarbiturico
Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance.
Barry Halliwell and Susanna Chirico.
Am J Clin Nutr 1993;57(suppl):715S-725S.
Isoprostani in Plasma e Urine
• Gli isoprostani formati in vivo derivano,
quasi esclusivamente, da processi nonenzimatici di perossidazione lipidica
• Isoprostani F2 circolano nel plasma e
sono secreti nelle urine.
• Il test non è influenzato dalla dieta
(attenzione , arginina ↓ isoprostani)
Isoprostani in Plasma e Urine
• Sono prodotti secondari del processo di ossidazione
• I metodi di misura disponibile sono molto complessi e
costosi (GC-MS unico metodo ritenuto affidabile)
• Immunoassay disponibili non sono ancora accurati e
precisi
E’ un buon marker di stress
ossidativo?
Ossisteroli
7α hydroxycholesterol
27 α-hydroxycholesterol
•
↑↑ nelle lesioni aterosclerotiche
• ↓ con trattamento antiossidantei
• molto stabili
•Non influenzati dalla dieta (ma pochi studi)
Ossisteroli
• Misura complessa e costosa (GC-MS)
• Utilizzabile su materiale congelato
• Non è chiaro se sia un metabolia
rilevante
E’ un buon marker di stress
ossidativo?
Antioxidant Consumption
Antioxidant consumption in vitro
100
100
80
80
[antioxidant]
[antioxidant]
Antioxidant consumption in vivo
60
40
20
0
time
60
40
20
0
time
Capacità antiossidante del plasma o
del sangue (Misure di utilizzazione della riserva funzionale)
• total antioxidant status (TAS)
• ferric reducing ability of plasma
(FRAP)
• oxygen radical absorbance capacity
(ORAC)
• total (peroxyl) radical scavenging
antioxidant capacity (TRAP)
FRAP
(ferric reducing ability of plasma)
• La riduzione da ione ferrico a ferroso a basso
pH dà origine ad una complesso colorato
(ferrous-tripyridyltriazine complex)
• Acido urico, bilirubina ecc. influenzano la
misura in modo importante
E’ un buon marker di stress
ossidativo?
TAS (total antioxidant status)
• Determinerenne la presenza di radicali
perossidici nel plasma. Darebbe informazioni
sulla capacità protettiva di ascorbato, urato,
albumina e, in minor misura, del glutatione e
della taurina
• E’ automatizzato ed è stato utilizzato un
numerosi studi umani
TAS (Total Antioxidant Status)
• Il test si basa sulla assorbanza di una sostanza che si
colora allo stato di radicale catione (ABTS)
• La reazione non ha, in effetti, un “end-point”
• Il prodotto colorato può essere ridotto (scavenger)
da vari composti, inoltre il tasso di riduzione è
sconosciuto
• Potrebbe essere usato in studi caso/controllo, con
molta prudenza
E’ un buon marker di stress
ossidativo?
Determinazione di Idroperossidi
•
•
•
•
D-ROM® test
Gli idroperossidi sono degradati da ioni ferrosi (aggiunti al
plasma) in ambiente acido, dando origine a radicali alcossili
Un processo di “electron transfer” porta alla formazione di
un radicale catione radicale (N,N-diethyl-pphenylendiamine).
Si misura facilmente con spettrofotometri (anche portatili) a
505 nm
Formazione del colore potrebbe dipendere non solo dalla
presenza di idroperossidi, il radicale può essere ridotto
E’ un buon marker di stress
ossidativo?
Marker di stress ossidativo sul DNA
• 7,8-Dihydro-8-oxo-guanine (8-OHGua or 8OHdG) sono usati in molti studi e sono ritenuti
maker molto sensibli di danno ossidativo al DNA
• Si determinano nel plasma e nelle urine
• È ben conosciuta l’ossidazione della guanina
provocata dalle procedure di isolamento del DNA
• Costoso e complesso
E’ un buon marker di stress
ossidativo?
Ricerca di nuovi marker di stresso
ossidativo
• La situazione non è soddisfacente
• Per avere un quadro appena soddisfacente sullo
stato ossidativo è necessaria la determinazione
di svariati marker, spesso costosi, complessi e
difficilmente automatizzabili.
• Mancano studi (soprattutto epidemiologici) che
indichino con chiarezza la relazione tra patologia
studiata e modifica dello stato ossidativo.
• Nuove metodiche si stanno affacciando, in
particolare molte speranze si stanno
appuntando sullo studio del proteoma.
Proteomica e stato ossidativo
• La proteomica studia le proteine (plasma, urine, tessuti)
• Le proteine vanno incontro a numerose modifiche posttraduzionali (con lo stesso numero e tipologia di geni si è
dato origine a Berlusconi e a Bertinotti)
• Numerosi modifiche osservate sulle proteine sono
indotte da reazioni radicaliche/ossidative
• Le metologie che si stanno sviluppando (protein-chip;
MS/MS; MALDI-TOF ecc.) sono automatizzabili e veloci
• Metodica costosa, ma è possibile automatizzare ed
esaminare un gran numero di campioni, abbassando il
costo.