Provette Leucosep
LTK.615
FOGLIO ILLUSTRATIVO
Per uso diagnostico in vitro
PI-LT.615-IT-V3
Informazioni generali
Uso previsto
Le provette Leucosep servono per la raccolta e la separazione delle cellule mononucleate di
sangue periferico (PBMC) dal sangue intero. Le provette agevolano la separazione delle PBMC dal
sangue intero durante la procedura con FICOLL-PAQUE* PLUS prima dell'utilizzo di queste cellule
nei saggi ELISPOT.
Introduzione
Le tecniche ELISPOT utilizzano le cellule T presenti nelle PBMC separate dal sangue intero. Un
metodo per la separazione di queste cellule richiede l'uso di FICOLL-PAQUE PLUS. Tale
procedura prevede una serie di passaggi da eseguire con attenzione per un risultato ottimale. L'uso
delle provette Leucosep riduce il numero dei passaggi necessari, rende la procedura più robusta, e
riduce il tempo necessario per la sua esecuzione.
Principio della procedura
Le provette Leucosep sono state disegnate per ottenere una separazione ottimale delle PBMC dal
sangue intero umano attraverso la centrifugazione in gradiente di densità. Le provette Leucosep
incorporano una barriera porosa in un tubo di polipropilene trasparente. Tale barriera
biologicamente inerte è costituita da polietilene di alto grado. Le provette Leucosep eliminano la
lunga e laboriosa stratificazione del campione sopra FICOLL-PAQUE PLUS. Il sangue intero
trattato con anticoagulante viene miscelato con il mezzo di coltura e quindi trasferito nella provetta
Leucosep. La barriera porosa impedisce la miscelatura del sangue con il mezzo di separazione
(FICOLL-PAQUE PLUS). Durante la centrifugazione, le PBMC vengono separate dagli eritrociti
indesiderati in virtù delle loro diverse densità, e successivamente queste vengono raccolte
nell'interfaccia al di sopra del mezzo di separazione. Una volta completata la separazione, la
barriera impedisce la ricontaminazione dello strato delle PBMC durante la sua rimozione.
Avvertenze e precauzioni
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Soltanto per uso diagnostico in vitro.
Soltanto per uso professionale; gli operatori devono essere addestrati a questa procedura.
Tutti i campioni ematici devono essere considerati potenzialmente infetti. E' necessario
prendere precauzioni durante la manipolazione di prodotti di origine umana.
La manipolazione dei campioni ematici e dei componenti dei test durante l'uso, la
conservazione e lo smaltimento deve essere eseguita in conformità alle procedure stipulate
dalle direttive o dai regolamenti nazionali appropriati per la protezione contro i rischi biologici.
Ogni variazione alle tecniche di pipettatura e di lavaggio indicate ed ai tempi e/o alle
temperature di centrifugazione può alterare la purezza delle PBMC isolate ed influenzare i
risultati del test.
Non raccogliere il sangue nelle Provette per la Preparazione Cellulare (CPT™, Becton
Dickinson) o nelle provette per la raccolta di sangue con EDTA, in quanto queste sono
incompatibili con le provette Leucosep.
Non refrigerare o congelare i campioni di sangue intero. Conservare e trasportare i campioni
di sangue al laboratorio mantenendoli a temperatura compresa tra 18 e 25°C oppure tra 10 e
25°C se i campioni devono essere trattati con il reagente T-Cell Xtend™.
Il sangue non deve essere conservato per più di 8 ore, o 32 ore se sarà trattato in seguito con
T-Cell Xtend.
Usare soltanto contenitori monouso per la raccolta di campioni di sangue venoso.
Non utilizzare dopo la data di scadenza.
Utilizzare una tecnica asettica durante l'uso del prodotto.
Non conservare le provette Leucosep alla luce diretta.
Non utilizzare se le provette Leucosep risultano danneggiate o se il FICOLL-PAQUE PLUS è
deteriorato. Il deterioramento è evidenziato da una netta colorazione gialla o dalla comparsa di
materiale particellare in una soluzione limpida.
Foglio Illustrativo Leucosep
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Materiali in dotazione
Ciascuna confezione contiene:
50 provette Leucosep preriempite con FICOLL-PAQUE PLUS.
Un CD contenente il foglio illustrativo e la Scheda di Sicurezza del Prodotto (Material Data Safety
Sheet - MSDS).
Conservazione e stabilità del prodotto
Conservare nella confezione integra a 4-30°C, fino alla data di scadenza indicata sulla scatola.
Dopo l'apertura, conservare il prodotto a temperatura ambiente (18-25°C) e riutilizzare entro 12
settimane dalla prima apertura della confezione esterna, a meno che tale data non ecceda la data
di scadenza indicata sulla scatola.
Attrezzatura e materiali necessari ma non forniti
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Provette con eparina per la raccolta di sangue.
®
Terreno di coltura sia AIM V sia RPMI.
Provette per centrifuga da 15 ml.
Centrifuga per l'isolamento delle PBMC capace di almeno 1000 RCF (g) e di mantenere i
campioni a temperatura ambiente (18-25°C).
Cabina di sicurezza biologica di classe II (BL 2) (raccomandata).
Pipette e punte sterili.
Kit ELISPOT.
In caso di campioni più vecchi di 8 ore può essere necessario usare il reagente T-Cell Xtend.
Procedura
Nota: Eseguire i seguenti passaggi utilizzando I Principi di Buona Pratica di Laboratorio:
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Prima dell'uso assicurarsi che la quantità necessaria di provette Leucosep sia a temperatura
ambiente (18-25°C).
Se il FICOLL-PAQUE PLUS si è raccolto al di sopra della barriera porosa (frit), centrifugare le
provette Leucosep a 350 xg per un minuto per portare il FICOLL-PAQUE PLUS sotto il frit.
Invertire il campione di sangue intero e quindi diluirlo in rapporto di 5 parti di sangue per 3 parti
di terreno per la coltura cellulare AIM V o RPMI in una provetta per centrifuga da 15 ml.
Invertire la provetta per centrifuga più volte per miscelare.
Trasferire il sangue diluito direttamente nella provetta Leucosep e centrifugare a 1000 xg per
10 minuti a 18-25°C, senza inserimento del freno.
Aspirare lo strato torbido delle PBMC e portare a ~10ml con AIM V o RPMI in una provetta da
centrifuga da 15 ml. Invertire la provetta da centrifuga per miscelare.
Centrifugare a 600 xg per 7 minuti. Scartare il supernatante.
Sospendere nuovamente il pellet di cellule in AIM V o RPMI, portare a ~10 ml con AIM V o
RPMI e centrifugare a 350 xg per altri 7 minuti.
Scartare il supernatante e risospendere nuovamente il pellet di cellule nel volume di AIM V
(non RPMI) richiesto dal saggio ELISPOT.
Se le cellule servono per la stimolazione antigenica in un saggio ELISPOT, diluire le cellule
appropriatamente utilizzando AIM V (non RPMI).
Limitazioni
1.
Come per altri mezzi di separazione, le provette Leucosep possono alterare la quantità di
alcune popolazioni di PBMC (ad esempio le cellule T e B) rispetto a quelle presenti nel sangue
intero non separato. Tale alterazione è ritenuta essere relativamente insignificante nei casi
normali.
Foglio Illustrativo Leucosep
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Controllo di qualità
I test condotti in-house non hanno dimostrato alcuna diminuzione significativa nei risultati delle
PBMC, dopo aver messo a confronto FICOLL-PAQUE PLUS con le provette Leucosep. Quale
parte dell'attività di controllo di qualità del singolo laboratorio, i metodi per la conta delle cellule
devono essere disegnati e validati in modo da garantire l'acquisizione di un numero sufficiente di
PBMC per il sistema del test specifico utilizzato. Inoltre, le attività di controllo di qualità devono
prevedere l'uso di controlli sia in positivo che in negativo, allo scopo di garantire la performance
attesa delle cellule T nel sistema di test in oggetto.
Caratteristiche della performance
Sangue conservato usando il reagente T-Cell Xtend
Sono stati ottenuti due campioni di sangue da 6 ml da 46 donatori. Per ciascun donatore, un
campione è stato trattato entro 8 ore dalla venipuntura, mediante stratificazione manuale con
FICOLL*; il secondo campione è stato trattato in una provetta Leucosep in seguito a conservazione
per 29-32 ore usando il reagente the T-Cell Xtend.
Usando entrambi i metodi, sono state ottenute cellule sufficienti per un saggio ELISPOT, e le
cellule ottenute da tutti i campioni sono risultate funzionali al saggio.
Sangue fresco
Sono stati ottenuti due campioni di sangue da 6 ml da 52 donatori. Entrambi i campioni di ciascun
donatore sono stati trattati entro 8 ore dalla venipuntura. Il primo campione è stato trattato
mediante stratificazione manuale con FICOLL; il secondo campione è stato trattato in una provetta
Leucosep.
Usando entrambi i metodi, sono state ottenute cellule sufficienti per un saggio ELISPOT, e le
cellule ottenute da tutti i campioni sono risultate funzionali al saggio.
Guida ai problemi nella raccolta e separazione delle PBMC per ELISPOT
Problema
Basso numero di cellule
Foglio Illustrativo Leucosep
Possibile causa
Leucopenia
Possibile soluzione
Aggiungere un ulteriore tubo
per la raccolta del sangue
Raccolta del sangue non
corretta
I CPT ed i tubi per la raccolta
del sangue contenenti EDTA
non sono compatibili con le
provette Leucosep
Il tubo per la raccolta del
sangue non è a temperatura
ambiente (18-25°C)
Lasciare che il tubo di raccolta
del sangue raggiunga la
temperatura ambiente
La conservazione del sangue
non
è
alla
temperatura
richiesta
Assicurarsi che la spedizione
avvenga a 18-25°C oppure a
10-25°C se si usa il reagente
T-Cell Xtend
Uso di volumi o diluizioni
diversi da quelli raccomandati
Assicurarsi che le istruzioni
vengano seguite
correttamente
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Contaminazione con eritrociti
La conservazione del sangue
non è alla temperatura
richiesta
Assicurarsi che il trasporto del
sangue avvenga a 18-25°C
oppure a 10-25°C se si usa il
reagente T-Cell Xtend
Il tubo per la raccolta del
sangue non è a temperatura
ambiente (18-25°C)
Lasciare che il tubo di raccolta
del sangue raggiunga la
temperatura ambiente
Il sangue non è diluito
Assicurarsi che il sangue
venga diluito secondo la
procedura
Inversione del campione del
sangue all'interno della
provetta Leucosep
Assicurarsi che la provetta
Leucosep rimanga in
posizione verticale prima della
centrifugazione
Centrifugazione non corretta
Assicurarsi che le istruzioni
per la centrifugazione vengano
seguite correttamente
Controllare che la centrifuga
sia capace di refrigerare a
18-25°C
Assenza di uno strato definito
o distinto di cellule
mononucleari
Risultati non validi
Foglio Illustrativo Leucosep
Separazione del campione
incomplete
Controllare che il freno della
centrifuga sia disinnescato
Separazione del campione
incomplete
Incrementare di 10 minuti lo
step di centrifugazione
Incrementare di 10 minuti lo
step di centrifugazione
La centrifuga non è calibrata
correttamente
Calibrare la centrifuga
Centrifugazione eseguita in
maniera scorretta
Assicurarsi che le istruzioni
per la centrifugazione vengano
seguite correttamente
Campione di soggetto
iperlipemico
I risultati non validi possono
essere provocati da una serie
di problemi legati alla
manipolazione dei campioni
Raccogliere un campione di
sangue a digiuno
Fare riferimento a quanto
sopra
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Glossario dei simboli
»
3
4
´
Ó
i
1
j
²
Utilizzare entro (Anno-Mese-Giorno)
Numero di lotto
Codice
Attenzione, leggere le istruzioni per l'uso
Fabbricante
Sufficiente per “n” test
Dispositivo per diagnosi in vitro
Limite di temperatura/Conservare entro
Fare riferimento alle istruzioni per l'uso
T-Cell Xtend e il logo Oxford Immunotec sono marchi depositati di Oxford Immunotec Limited.
AIM V è un marchio depositato di Invitrogen.
CPT è un marchio depositato di Becton Dickinson.
* FICOLL e FICOLL-PAQUE sono marchi depositati di GE Companies.
L’uso del reagente T-Cell Xtend è protetto dai seguenti brevetti, depositati ed in corso di registrazione:
EP2084508; US13/253,598, CN101529221, AU2007-303994, JP2009-530943, IN2165/DELNP/2009,
CA2665205
© Oxford Immunotec Limited, 2013. Tutti i diritti riservati.
Fabbricante:
Oxford Immunotec Ltd
94C Innovation Drive, Milton Park, Abingdon
Oxfordshire, OX14 4RZ, RU
+44(0)1235 442796
www.oxfordimmunotec.com
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