Introduzione
• Il sangue è un tessuto connettivale di consistenza liquida di colore
rosso caratteristico
• Il sangue è formato da elementi figurati (eritrociti, leucociti e
piastrine) e da una sostanza intercellulare liquida di colore giallo
pallido, denominata plasma
• Il plasma è la componente fluida del sangue, cioè il sangue
deprivato degli elementi figurati, ma che contiene i fattori della
coagulazione
• Il siero identifica quel liquido normalmente chiaro che si separa dal
sangue quando questo viene lasciato coagulare. Quindi il siero è la
componente liquida del sangue che rimane dopo la rimozione degli
elementi figurati e del coagulo di fibrina
• Il sangue può essere prelevato dalle arterie, dalle vene o dai capillari.
Il sangue venoso (o il sangue capillare) è di scelta per le indagini
chimico-cliniche di routine. Il sangue arterioso è standard per lo
studio degli equilibri acido-base e dei gas del sangue
L’esame emocromocitometrico
• La valutazione ematologica completa o esame emocromocitometrico
di un campione di sangue periferico può fornire importanti indicazioni
cliniche e diagnostiche delle tre principali componenti: eritrociti o
globuli rossi, leucociti o globuli bianchi, e le piastrine
• L’analisi ematologica comprende 4 fasi principali
÷Raccolta e preparazione del campione di sangue periferico
÷Determinazione della conta ematica completa
÷Definizione della conta differenziale dei leucociti
÷Striscio su vetrino per potenziali anomalie morfologiche
• Il campione di sangue venoso periferico viene raccolto in una provetta
con anticoagulante EDTA (trisodio citrato o eparina)
• Esame di routine e esame di follow-up: popolazione generale o
selezionata
1
Il sangue
2
Il sangue
• Il sangue è un tessuto formato da una sospensione di cellule (~45%) in un liquido
chiamato plasma (~55%)
• costituisce circa 1/12 del peso corporeo, circa quindi 5-6 litri
• Il sangue svolge numerose ed importanti funzioni:
÷ Respiratoria: per mezzo dell'emoglobina contenuta negli eritrociti, porta
l'ossigeno ai vari tessuti e ne preleva l'anidride carbonica (CO2)
÷ Nutritizia ed escretrice: trasporta sostanze nutritive (amminoacidi,
zuccheri, sali minerali) e raccoglie quelle escrete dai vari apparati che
verranno eliminate attraverso il filtro renale od elaborate dal fegato
÷ Regolazione: Il sangue trasporta inoltre ormoni, enzimi e vitamine
÷ Difesa: Presiede anche alla difesa dell'organismo attraverso l'azione svolta
dai globuli bianchi
÷ Termoregolatrice
÷ Mantenimento del tasso idrico
÷ Regolazione dell’emostasi
÷ Mantenimento della pressione osmotica (minerali) e oncotica
(proteine)
Il plasma
• Il plasma è un fluido leggermente alcalino (pH 7,4), con caratteristico colore giallino,
costituito per il 90% da acqua e per il 10 % da sostanza secca
• La sostanza secca è formata al 90% da sostanze organiche
÷ glucidi (glucosio)
÷ lipidi (colesterolo, trigliceridi, fosfolipidi, lecitina, grassi), proteine (globuline,
albumine, fibrinogeno)
÷ glicoproteine
÷ ormoni (gonadotropine, eritropoietina, trombopoietina)
÷ amminoacidi
÷ vitamine
• mentre il 10% è costituita da minerali, dissolti sotto forma ionica, cioè dissociati in
ioni positivi e negativi
• Il plasma contribuisce al mantenimento del volume del sangue (volemia) – in diverse
condizioni fisiologiche (invecchiamento, gravidanza, posizione del corpo, ecc.) o
patologiche (ustioni, epatopatie, nefropatie, malattie del metabolismo, ecc.) si
possono riscontrare variazioni del volume plasmatico:
• Normovolemia
• Ipovolemia o oligoemia
• Pletora o ipervolemia
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Conta Ematica Completa
• È il cardine di ogni esame emocromocitometrico e fornisce indicazioni
sullo stato funzionale del midollo osseo (e degli altri organi
ematopoietici, quali milza e tessuti linfatici dei vari animali) –
determina le caratteristiche:
• ERITROCITI
÷ numero totale: RBC
÷ indici degli eritotrociti di Wintrobe: MCV, MCHC, MCH
÷ ampiezza di distribuzione: RDW
• LEUCOCITI (conta differenziale)
• PIASTRINE (conta e volume piastrinico medio MPV)
Alterazioni nel numero:
• -penia: deficienza del componente cellulare ematico (deficit di
produzione o aumentata distruzione)
• -citosi: aumento del componente cellulare ematico (risposta
fisiologica ad uno stimolo periferico o proliferazione incontrollata)
4
Valori di Riferimento di Alcuni Parametri Ematici
•Ematocrito
M: 39 - 49 %
F: 35 - 45 %
•Eritrociti
M: 4.5 - 5.9 x 106 /µL
F: 4.5 - 5.1 x 106 /µL
•Reticolociti
0.50 - 1.50 %
•Leucociti
4.5 - 11.0 x 103 /µL
•Piastrine
150 - 350 x 103 /µL
•Emoglobina
M: 14.0 - 17.5 g/dl
F: 12.0 - 15.5 g/dl
Eritrocita
• La grande maggioranza degli elementi
figurati è rappresentata dagli eritrociti
• Questi sono cellule prive di nucleo ed
organelli
• Hanno una superficie biconcava a forma di
ciambella con diametro di 7 micron
• Non sono dotati di movimento ameboide ma
sono provvisti di una notevole elasticità.
• All’interno dell’eritrocita si trova
l’emoglobina, una cromoproteina
tetramerica che ha il compito di trasportare
O2 ai tessuti periferici e rimuovere CO2 dagli
stessi
• L’energia per tale processo è ricavata dalla
glicolisi anaerobia perché le emazie sono
sprovviste di mitocondri
5
La membrana dell’eritrocita
Le camera contaglobuli
• Dispositivo per il conteggio visivo delle cellule presenti in un campione. Consiste in un
vetrino portaoggetti fornito di una o due depressioni sulla superficie superiore, nel cui
fondo è incisa una minutissima quadrettatura. La sovrapposizione del vetrino
coprioggetti viene a delimitare una o due minuscole camere a volume noto.
• L'osservazione al microscopio ottico di una sospensione di cellule (per esempio
sangue opportunamente diluito) contenuta entro la camera permette di determinare
la concentrazione delle cellule, generalmente espressa come numero di elementi per
mm3. La camera contaglobuli viene utilizzata soprattutto per la conta di eritrociti,
leucociti e piastrine nel sangue. I tipi di camere contaglobuli più comuni sono la
camera di Bürker e la camera di Thoma-Zeiss
6
Conta Ematica Completa
• La conta totale degli eritrociti avviene per metodi automatizzati di
impedenza elettrica (le cellule attraversano un’apertura attraverso cui passa la
corrente: viene misurata la variazione nella resistenza elettrica che è proporzionale
alla dimensione cellulare –principio di Coulter) o per metodi di diffusione laser
(tubi fotomoltiplicatori che individuano cambiamenti nella diffusione della luce da un
flusso di cellule)
+
-
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Indici eritrocitari
• Volume Corpuscolare Medio – VCM o MCV ♀80.8-100/♂80.5-99.7 fl
• È importante nel classificare le anemie come: normocitiche, microcitiche,
macrocitiche
• Viene calcolato sulla distribuzione dell’istogramma di distribuzione degli eritrociti
• Ampiezza di distribuzione – RDW ♀/♂ <15%
• Fornisce informazioni sulla variazione delle dimensioni eritrocitarie, o anisocitosi
• Viene calcolato sulla distribuzione dell’istogramma di distribuzione degli eritrociti
e rappresenta il coefficiente di variazione (deviazione standard)
Indici eritrocitari
• Se invece le variazioni riflettono lo forma degli eritrociti, si parla di poichilocitosi
(da non confondere con alterazioni dovute ad artefatti di preparazione)
SFEROCITI
DACRIOCITI
A FALCE
EMAZIE SPINOSE
8
Normal
membrane
cytoskeleton
Hereditary spherocytosis
loss of membrane = loss of SA = loss of deformability = increased splenic clearance
9
Indici eritrocitari (soggetto sano)
Indici eritrocitari (con LLA)
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Emoglobina
L’emoglobina è una proteina composta (cromoproteina) da quattro subunità e da una
porzione prostetica eme
L’eme è costituito da quattro anelli pirrolici contenenti al centro un atomo di Fe2+ che può
legare O2 in modo reversibile
La funzione dell’Hb è quella di assumere O2 a livello degli alveoli polmonari e distribuirli a
livello dei tessuti
Nell’ontogenesi dell’Hb l’inserimento dell’atomo di Fe++ avviene nei mitocondri
dell’eritroblasto dove avviene pure la sintesi e l’attacco delle catene globiniche. Queste
ultime sono sette:
2 catene a-simili: catene α, catene ζ
5 catene b-simili: catene β, catene G-γ (Hb
Gowers dell’embrione, catene A-γ (Hb fetale),
catene δ (Hb A2), catene ε
Emoglobina
Esistono diversi tipi di Hb a seconda dello stadio evolutivo dell’essere umano
Durante la vita intrauterina :
Hb Gower1
2ζ 2ε
Hb Gower2
2α 2ε
Hb Portland
2ζ 2ε
Durante il periodo neonatale :
Hb fetale
2α 2γ
80%
Hb A
2α 2β
20%
Durante il periodo post-neonatale (adulto) :
Hb F
2α 2γ
0.5%
Hb A
2α 2β
99%
Hb A2
2α 2 δ 0.5%
L’Hb A è in grado di legare glucidi sulla Valina N-terminale dando luogo ad emoglobina
glicosilata di cui la più importante è l’Hb-Alc che lega carboidrati irreversibilmente.
Rappresenta un indice della glicemia media di periodi pregressi. E’ elevata nei diabetici.
L’Hb F ha un’affinità maggiore per l’O2 rispetto alla Hb A. Ciò le permette di ricevere
ossigeno dall’emoglobina materna nella circolazione placentare.
11
Emoglobina
Si esprime in g/100 mL
Si misura con il Metodo della Cianmetaemoglobina:
è il classico metodo fotometrico di Drabkin per la determinazione
dell’emoglobina utilizzato sia manualmente sia dagli strumenti
automatici. Il metodo della cianmetaemoglobina. L’emoglobina viene
trasformata dal reattivo in cianmetaemoglobina, pigmento molto
stabile utilizzato per l’analisi fotometrica. La quantità di pigmento
sviluppato, direttamente proporzionale all’emoglobina, viene
determinata leggendo l’estinzione in fotometro a 540 nm di
lunghezza d’onda
20 ml di sangue + 5 ml di Soluzione di DRABKIN (ferricianuro +
cianuro di potassio)
Emoglobina
• Contenuto emoglobinico medio – MCH ♀26.5-34 /♂26.6-33.8 pg
- È la quantità di emoglobina contenuta in media in un globulo rosso
MCH ( pg / cell ) =
Hb( g / L)
RBC (cell / L)
• Concentrazione emoglobinica globulare media – MCHC ♀31.435.8/♂31.5-36.3 %
- Indica la percentuale di emoglobina contenuta negli eritrociti a seconda della loro
grandezza
- Valori inferiori si riscontrano nelle anemie ipocromiche, valori superiori negli stati emolitici
(configurazione sferocitica dei globuli)
MCHC ( g / dL) =
Hb( g / dL)
Htc( L / L)
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Velocità di eritrosedimentazione (VES)
• La VES è un test tradizionale – in laboratorio, la VES misura la velocità di
sedimentazione degli eritrociti nel plasma in cui sono sospesi, o meglio misura la
distanza percorsa da un eritrocita in una provetta verticale in un determinato
intervallo di tempo
• Il principio dietro questo processo è l’aumento di cariche negative che le varie
proteine infiammatorie (fibrinogeno, α- β- e γ-globuline) esercitano sugli
eritrociti – queste promuovono la separazione delle cellule e quindi una più
rapida caduta
• Si basa sulla legge di Stokes:
V=
2r 2 (d1 − d 2 ) g
9η
V= velocità di sedimentazione
r= raggio delle particelle sferiche
d1=densità delle particelle sferiche - emazie 1,10
d2=densità del fluido di sospensione - plasma 1,02
g=accelerazione di gravità
h=viscosità del liquido
Velocità di eritrosedimentazione (VES)
• Il metodo attuale di riferimento è il Westergren: campione di sangue con sodio
citrato in una provetta di vetro lunga 30cm e θ=2.5mm
• Nuovi metodi di fotometria capillare quantitativa - il valore della VES non è più
rilevato con un'unica lettura dopo un intervallo di tempo, ma risulta dalla
misurazione dinamica del processo di formazione degli agglomerati di eritrociti.
Questo processo risente della spinta delle proteine, specie della fase acuta, ma non
viene influenzato dal grado di anemia, dalla poliglobulia, dalla presenza di
crioglobuline o paraproteine e permette di analizzare campioni con volume scarso
(bambini) e fornisce risultati in tempi brevi
• Indice di sedimentazione o indice di Katz= [VES(1a ora)+VES(2a ora)/2]/2
• Risulta essere aumentata in patologie infiammatorie e infettive, ma la specificità è
bassa - nel 3% dei casi è aumentata in assenza di malattia rilevabile
• Le sue variazioni sono più significative del rilievo di un singolo valore elevato
• Può permettere l'identificazione di malattie nascoste o a monitorare il decorso o la
risposta alla terapia di certe malattie
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Velocità di eritrosedimentazione (VES)
Ematocrito
• È semplicemente il rapporto tra il volume degli eritrociti e il
volume plasmatico
• Sebbene possa essere determinato con la semplice
centrifugazione (ematocrito spurio – con pipette capillari a
15000g), ma viene di norma calcolato come:
Ematocrito % = MCV (litro/cellule) x RBC (cellule/litro)
• Risultati erronei dell’ematocrito possono derivare in
condizioni di policitemia, macrocitosi, sferocitosi, anemie
ipocromiche, alterazioni morfologiche degli eritrociti
• Risulta essere ridotto per diminuzione dei globuli rossi o
per riduzione del loro volume
14
Ematocrito
Approccio diagnostico alle anemie
Definizione: una riduzione nella concentrazione di emoglobina al
di sotto dei valori normali per età e sesso
criteri WHO:
Maschio
< 13g/dL
Femmina
< 12g/dL
Femmina in gravidanza
< 11g/dL
- Anamnesi, esame fisico e valutazione bioclinica
Esami di prima scelta
- Emocromo: Hb, Hcrit, indici eritrocitari, conta cellulare e dei
reticolociti
- Esame morfologico
- Biochimica: L-ADM con LDH
Esami di seconda scelta
- Sideremia/TIBC/Ferritina
- Biochimica epatica e renale, ormonale
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Approccio diagnostico alle anemie
Bicitopenia o Pancitopenia
- anemia aplastica
- MDS
- leucemia acuta
- ipersplenismo/malattia autoimmune
- anemia megaloblastica (non sempre)
1.
Anemia soltanto o no?
2.
Microcitica, Normocitica, o Macrocitica ?
Controllare il MCV
MCV < 80
anemia
microcitica
MCV 80 - 100
anemia
normocitica
MCV > 100
anemia
macrocitica
Classificazione Morfologica
ANEMIA MACROCITICA
•
Transitoria o pseudomacrocitica (ipocromica) – durante la fase di
rigenerazione conseguente a:
–
–
•
Perdita acuta di sangue
Anemia emolitica acuta
Macrocitica vera (normocromica)
–
–
Da disordini mieloproliferativi
Da carenza di vitB12 (anemia megaloblastica)
ANEMIA MICROCITICA (IPOCROMICA)
•
Da carenza di Ferro (valutare sideremia e ferritina)
–
–
–
–
Dieta carente
Aumentata richiesta
Diminuito assorbimento
Emorragia
•
Da incapacità di utilizzare il Ferro (carenza Cu, vitB6)
ANEMICA NORMOCITICA NORMOCROMICA
•
Da diminuita produzione (anemia aplastica o ↓ Epo)
•
Fase iniziale di: anemia postemorragica o postemolitica
16
3. Conta retinocitica
• Un reticolocita è un eritrocita che contiene sempre i ribosomi e altri organelli ma ha perso
il nucleo (nel precedente stadio di eritoblasta ortocromatico)
• Il reticolocita ha una vita di 3-4 giorni e forse 24h in circolo
• Clinicamente, la percentuale di reticolociti può essere utilizzata come un indicatore della
eritropoiesi ed è spesso utilizzata per valutare i pazienti anemici: ad esempio, un numero
= o ↓ di reticolociti in un paziente anemico significa una scarsa poiesi da parte del midollo
osseo, come per un deficit di Fe, folati o vitB12 – una reticolocitosi può invece indicare
emolisi o emorragia
• La valutazione del numero dei reticolociti può essere manuale (colorazione con blu di
metilene o blu cresolo brillante) o automatica (con citometria di flusso o analisi di
immagine)
Indice reticolocitario
• Correzione per fattori di diluizione
• = Reti(%) x Ematocrito/45
Normal
Anemia
4. Anomalie cellulari
• Eritrociti
-
microsferociti
eritrociti frammentati
Eritroblasti
Dacriociti o a lacrima
• Leucociti
-
Blasti: LLA, MDS
Tutta la serie mieloide: LMC
Neutrofili ipersegmentati: anemia megalobastica
Leucoeritroblastosi: Mieloftisica, altre cause
17
5. Biochimica clinica
Globuline: mieloma multiplo
LDH: leucemia, anemia emolitica,
mieloma multiplo, anemia megaloblastica
sGOT, Bilirubina: anemia emolitica,
anemia megaloblastica, MDS
Calcio: mieloma multiplo
BUN/Creatininemia: mieloma multiplo,
insufficienza renale cronica
acidi urici: leucemia
I leucociti o globuli bianchi
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Lo striscio di sangue
1.
2.
3.
4.
5.
Raccolta del campione
Preparazione del vetrino
Fissaggio
Colorazione con Giemsa (blu di metilene ed eosina)
Montaggio e osservazione
Leucociti: conta differenziale
Formula leucocitaria
- granulociti
neutrofili (55-70%)
eosinofili (2-3%)
basofili (0,5-1%)
- linfociti (20-30%)
- monociti (3-8%)
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Leucociti
• Il loro numero globale varia da 5.000 a 9.000 per mm3 (ml) di
sangue
• Sono detti così perché quando il sangue viene posto in una
provetta a sedimentare si collocano in uno strato biancastro
posto superiormente agli eritrociti
• Sono cellule che svolgono la loro funzione nel connettivo e
perciò utilizzano il sangue per migrare dal midollo osseo ai
tessuti
• Possono essere distinti a seconda della presenza o meno di
granulazioni citoplasmatiche in:
–granulari (neutrofili, basofili , eosinofili)
–non granulari (linfociti, monociti)
GRANULOCITI
Neutrofili
Eosinofili
Basofili
20
granulociti neutrofili o polimorfonucleati (65%)
•Sono cellule molto mobili dotate di attività fagocitaria
• Intervengono nelle fasi iniziali della risposta infiammatoria
• Sono attratti (chemiotassi) da varie sostanze tissutali e batteriche
(chemiotassine) nella sede dove devono esercitare la loro azione; una volta che
hanno esercitato la loro azione, vanno incontro a distruzione costituendo il pus
• Sono simili in tutte le specie animali
MORFOLOGIA
• Hanno un Ø di poco superiore a 15 mm e
presentano un citoplasma scarsamente
colorato con granuli specifici non
evidenziati dalle comuni colorazioni.
• Il nucleo ha la caratteristica forma
plurilobata (2-5 lobi uniti tra loro da
filamenti di cromatina)
granulociti neutrofili o polimorfonucleati (65%)
I granuli sono di diverso tipo e
contengono enzimi idrolitici,
perossidasi, enzimi capaci di
degradare i mediatori
dell’infiammazione e altre sostanze
che permettono di esercitare attività
fagocitaria ed antibatterica.
Granuli specifici: piccolissimi e
numerosi.
Contengono:fagocitina,lisozima…
Granuli azzurofili: più grandi e meno
numerosi. Sono lisosomi che
contengono gli enzimi lisosomiali.
Granuli terziari: gelatinasi…
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granulociti eosinofili (3%)
Il loro numero aumenta nei processi allergici e nelle infezioni parassitarie
(istoflogistica). Sono in grado di degradare l’istamina.
• Hanno un diametro di 15 mm e presentano un citoplasma con granuli
specifici acidofili (eosinofili) e il nucleo è bilobato (nucleo a bisaccia)
• Questi sono i granuli specifici: sono piuttosto grandi e contengono al centro un
cristalloide denso circondato da una matrice meno densa (contengono proteine
basiche (P.B.M.), enzimi idrolitici, perossidasi, istaminasi)
• Sopravvivono 8-12 giorni
granulociti basofili (<1%)
• Hanno un diametro di 15 mm e
presentano un citoplasma con granuli
specifici basofili
• I granuli specifici sono grandi e
contengono istamina ed eparina.
• I granuli azzurrofili sono lisosomi
• Il nucleo può essere di varie forme
(S,U,J..), ma negli strisci comuni è
mascherato dai granuli
• Svolgono la stessa funzione
dei mastociti
• Non sono i precursori dei
mastociti tissutali
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AGRANULOCITI
Linfociti
Monociti
linfociti (25%)
• Sono piccole cellule (Ø di 7-15 mm) con un grande nucleo rotondo e scarso
citoplasma
• Piccoli linfociti Ø : 8-10 mm
• Nucleo rotondo, cromatina addensata, sottile orletto di citoplasma
moderatamente basofilo (azzurro chiaro) - Prevalgono in cane, gatto e cavallo
• Grandi linfociti Ø : 10-15 mm
• Nucleo con cromatina meno addensata e citoplasma più abbondante.
Prevalgono nei ruminanti
• Sono le cellule responsabili delle difese immunologiche
• Esistono diverse famiglie o sottopopolazioni di linfociti: linfociti B (25%), linfociti
T (70%) e cellule natural killer(NK)(5%)
• I linfociti B sono le cellule che si trasformano in plasmacellule e provvedono a
produrre anticorpi circolanti (risposta umorale);
• I linfociti T presentano sulla loro superficie TCR. Sono responsabili della risposta
immunitaria mediata da cellule.
• Le cellule NK distruggono le cellule estranee o trasformate senza l’intervento di
cellule T
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monociti (2-8%)
Sono i precursori ematici dei macrofagi.
MORFOLOGIA
• Sono cellule piuttosto grandi con Ø di 20
mm.
• Il citoplasma è poco colorabile
• Il nucleo presenta spesso una profonda
insenatura su di un lato (reniforme)
PIASTRINE o trombociti
• Normalmente sono in numero di 300.000 circa per
mm3 di sangue.
• Sono piccole porzioni cellulari anucleate che
derivano dalla frammentazione del citoplasma di
grandi cellule del midollo osseo dette
megacariociti.
MORFOLOGIA
•Hanno forma biconvessa e una lunghezza di 1-3 mm.
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