Prenatal BoBs : una nuova
tecnologia per l’analisi rapida di
aneuploidie e sindromi da
microdelezione e microduplicazione in
diagnosi prenatale
Bertinoro, 19 ottobre 2013
Liturri Olimpia
TREND DEGLI ULTIMI ANNI:
TEST RAPIDI SU CAMPIONI FRESCHI
FISH
su Amniociti non coltivati
QF--PCR
QF
Su campioni freschi
freschi:: esclusione rapida (24
24--36
36h)
h) di aneuploidie dei
chr 13
13,, 18
18,, 21
21,, X e Y che rappresentano circa il 70
70%
% degli
sbilanciamenti cromosomici fetali
Grati et al. 2010
In alcuni Paesi QFQF-PCR è applicata come sola analisi nei casi con AMA e aumentato
rischio dopo screening biochimico (Hills et al, 2010)
2010)
Hills et al, 2010
QFQF-PCR viene applicata con funzione anticipatoria, per controllare l’ansia materna, di
un risultato che arriverà, più completo, col cariotipo in media 15
15gg
gg dopo
QFQF-PCR in sostituzione del metodo diretto nell’analisi dei villi coriali:
coriali: con questo
approccio citogenetico incompleto si può incorrere in falsi negativi dovuti a:
• Nei casi con cariotipo femminile non si ha la certezza di analizzare metafasi di origine
fetale
• Si può incorrere in Falsi negativi
citotrofoblasto
correlati ai mosaicismi fetali veri confinati al solo
• Si può incorrere in Falsi negativi correlati alla mancata ricerca di UPD nei casi di
mosaicismo confinato al solo citotrofoblasto
Grati et al, 2006
TREND DEGLI ULTIMI ANNI:
ANTICIPAZIONE DELLA DIAGNOSI PRENATALE NEL PRIMO
TRIMESTRE
1) Esecuzione dei test
screening nel 1° trimestre
di
2)AUMENTO DI VILLOCENTESI
è possibile riconoscere sbilanciamenti cromosomici nel cariotipo fetale ancor prima che segni
ecografici specifici possano essere visibili (anche dopo un’ecografia dettagliata) o nei casi in cui siano
presenti segni lievi e/o aspecifici (es:
es: nella sindrome di Wolf
Wolf--Hirschhorn si evidenzia solo IUGR e
oligoidramnios dopo 26 w.g)
consente alle famiglie di poter essere informate con largo anticipo riguardo alla salute del proprio
feto e poter quindi fare un scelta riguardo all’applicazione di ulteriori indagini, al futuro della
gravidanza e alla pianificazione familiare
familiare..
Test molecolari rapidi e con maggiore risoluzione sembrano sempre più
necessari per aumentare la d.r.
d.r. degli sbilanciamenti cromosomici e per
ridurre il rischio residuo di anomalie cromosomiche legate alla risoluzione del
cariotipo fetale.
fetale.
Studio multicentrico Europeo per validare una nuova tecnologia,
Prenatal BACsBACs-on
on--BeadsTM, sviluppata allo scopo di diventare una
piattaforma di screening prenatale targettata nei casi senza
indicazioni specifiche alla diagnosi prenatale
TOMA Advanced Biomedical Assays
- CHI de PoissyPoissy-Saint and Germain
- Hôpital Robert Debré
Francesca R. GRATI,
GRATI, Simona
DE TOFFOL, Livia MARCATO,
Beatrice GRIMI, Federico
MAGGI, Giuseppe SIMONI
Francois VIALARD,
VIALARD, Denise
MOLINA--GOMES, Azedine
MOLINA
ABOURA, Christelle LE
SCIELLOUR, Fabrice BRU,
Dept of Obs/Gyn, North Bronx Healthcare Network,
Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva
University, Bronx, New York
Susan GROSS
(design)
Tecnologia BACsBACs-onon-Beads™ (BoBs
(BoBs)
)
e’ una tecnologia di Array in sospensione che
utilizza microsfere/biglie Luminex® marcate in
fluorescenza con tecnologia xMAP.
xMAP.
Ogni biglia è adesa con DNA amplificato
con i BAC e può avere una differente
molecola sulla sua superficie
superficie..
Ognuna di queste biglie contiene una
diversa miscela di due fluorocromi (rosso e
infra rosso) che ha un ben definito spettro di
emissione
InfraRed Dye
Red Dye
Ogni biglia viene analizzata singolarmente da due diversi laser
dall’analizzatore Luminex
L’interazione specifica del DNA del campione/
campione/reference
reference con la
sequenza target (BAC) viene quantificata dal sistema di rilevazione
Sindromi da microdelezione
Range di normalità
Range di normalità
Descrizione dei criteri adottati per disegnare il
pannello di anomalie cromosomiche incluse nel kit
prevalenza alla nascita relativamente elevata (1/4.000
000-->1/200
200..000
000)
);
mortalità e/o morbidità significativa;
significativa;
ecografia prenatale silente o con segni lievi/aspecifici
lievi/aspecifici;;
correlazioni genotipogenotipo-fenotipo note (penetranza completa
completa;; no CNV a significato clinico incerto =>
counseling chiaro in virtù della conoscenza della storia naturale della patologia);
patologia);
elevata detection rate (≥70
(≥70%
% dei pazienti mostra come meccanismo prevalente la delezione;
delezione; non
sono incluse sindromi causate prevalentemente da mutazioni puntiformi e difetti di metilazione;
metilazione;
incidenza >1/3000
3000)
).
Seguendo questi criteri le 9 MD selezionate hanno mostrano globalmente alla
nascita una frequenza di 1/1700. Esse sono:
+
La sindrome DiGeorge
22q11.2 Deletion Syndrome
21
22
Per applicare la tecnica FISH è necessario la coltura
cellulare e l’analisi viene effettuata sui cromosomi in
metafase.
Il 90% dei casi di DGS è da delezione di 22q11.2.
Segnalati casi con del10p13 e con del 18q21.33.
La maggioranza delle delezioni sono de novo.
Circa il 12% risulta da segregazioni sbilanciate di
traslocazioni o da ricombinazioni di inversioni
pericentriche parentali.
CARATTERISTICHE della tecnologia Prenatal BoBs
facile esecuzione (protocollo in piastra automatizzabile, bassa
quantità/qualità di DNA richiesto, colture cellulari non necessarie, elevata
efficienza e processività
processività);
);
elevata specificità (>99%; Falsi positivi <1%);
elevata sensibilità (>98%; Falsi negativi <2% e tutti correlati ai cariotipi
euploidi);
euploidi
);
elevata riproducibilità (risultati solidi in virtù del confronto con due DNA di
controllo);
alto valore predittivo (penetranza completa ed elevata frequenza di 1/1700)
elevata capacità di anticipazione diagnostica (ancor prima che i segni clinici
si manifestino: elevato rapporto incidenza/prevalenza)
Prenatal BoBs applicato sul DNA (
(da
da villo nativo)
nativo)
permetterebbe minimizzare il rischio residuo di anomalie
cromosomiche anche in gravidanze a basso rischio
Prenatal BoBs studio mondiale
Overall abnormal results
(aneuploidies + partial
unbalances)
INDICATIONS FOR PRENATAL n° cases n° cases
DIAGNOSIS
included analyzed
%
Incidence of partial unbalances
detectable by PNBoBs only
Total n° partial unbalances
N°
%
detectable
by
karyotype
detectable by
targetted FISH
(based on
clinical suspicion)
detectable
by PNBoBs
only
%
1/
Low risk
813
777
13,1
93
12,0
3
0
5
0,64
155
US abnormalities High risk
1220
1165
19,7
217
18,6
6
17
10
0,86
117
Unknown
198
187
3,2
34
18,2
1
0
1
0,53
187
Increased MSS for Down
Syndrome
1133
1081
18,3
81
7,5
1
0
6
0,56
180
AMA (≥35y)
1131
1121
18,9
42
3,7
0
0
3
0,27
374
Maternal anxiety (<35y)
536
529
8,9
5
0,9
0
0
0
Miscarriage
196
189
3,2
28
14,8
0
0
4
2,12
47
Previous fetus with
Parent carrier of a chr abn
142
37
136
34
2,3
0,6
3
3
2,2
8,8
0
0
0
1
0
0
Other
141
127
2,1
12
9,4
4
0
2
1,57
64
Unknown
578
572
9,7
31
5,4
1
0
1
0,17
572
Total number of cases
6125
5918
96.6
547
9,2
16
18
66
32
total low risk
total imbalances
detectable by
BoBs
%
1/
95% CI
3508
14
0,40
251
0,00220,0063 (1/4611/158)
0,54 185
95% CI
0,028-0,01502
(1/363-1/67)
0,0047-0,0157
(1/214-1/64)
0,0009-0,0297
(1/1059-1/34)
0,0025-0,0121
(1/393-1/83)
0,0009-0,0078
(1/1098-1/128)
0,0083-0,0531
(1/121-1/19)
0,0043-0,0556
(1/231-1/18)
0,0003-0,0098
(1/3240-1/102)
0,0037-0,0074
(1/271-1/135)
Prenatal BoBs in combinazione a cariotipo fetale in
gravidanze a basso rischio
VANTAGGI
Analisi di sbilanciamenti di zone critiche del DNA associate a patologie note,
non determinate dal cariotipo fetale (Cariotipo
Cariotipo:: risoluzione è di 6-10 Mb,
Prenatal BoBs
BoBs:: 1Mb)
Utile in gravidanze senza specifiche indicazioni o nei casi in cui siano
presenti segni lievi e/o aspecifici
Facile esecuzione, rapidi tempi di risposta (48
48h),
h), facile interpretazione
SVANTAGGI
Non consente di rilevare le poliploidie
poliploidie,, riarragiamenti cromosomici bilanciati
bilanciati,,
mutazioni puntiformi,
puntiformi, difetti di metilazione,
metilazione, anomalie cromosomiche a mosaico
≤ 30
30%
% e sbilanciamenti cromosomici di regioni non rappresentate nel kit.
kit.
contaminazione materna ≥70
70%
% può essere fonte di diagnosi errata
CONCLUSIONI
Il Prenatal BoBsTM non ha lo scopo di sostituire il cariotipo
convenzionale in particolare se vi è un sospetto di anomali fetali in
QF-ecografia,, ma può essere una valida alternativa alla FISH o QF
ecografia
PCR, sia per il costo,
costo, sia per i tempi di risposta (tecnica
comparabile)).
comparabile
Prenatal BoBsTM in un corretto percoso clinico e scelto un
appropriato laboratorio di riferimento può aiutare e migliorare le
ansie della coppia e pianificare al meglio le cure del nascituro.
nascituro.
Nei progetti futuri c’è quello di aggiungere nuove sindromi da
microdelezioni aumentando così il pannello a disposizione.
disposizione.