MANUALE
TECNICO-APPLICATIVO
“Riqualificazione delle imprese del settore lattiero-caseario
tramite applicazioni biomolecolari e bioinformatiche di tracciabilità
e rintracciabilità dei prodotti per la sicurezza alimentare e la
creazione di una filiera tipica della razza caprina Girgentana”
Misura 124 - Cooperazione per lo sviluppo di nuovi prodotti,
processi e tecnologie nei settori agricolo e alimentare
e in quello forestale
MANUALE TECNICO-APPLICATIVO
“Riqualificazione delle imprese del settore lattiero-caseario
tramite applicazioni biomolecolari e bioinformatiche di tracciabilità
e rintracciabilità dei prodotti per la sicurezza alimentare e la
creazione di una filiera tipica della razza caprina Girgentana”
Misura 124 - Cooperazione per lo sviluppo di nuovi prodotti,
processi e tecnologie nei settori agricolo e alimentare e in quello forestale
Responsabile scientifico:
Prof. Baldassare Portolano
Università degli Studi di Palermo
Stampato nel mese di Febbraio 2014
da Arti Grafiche Fiorello - Partinico
INDICE
INDICE
1. IL PROGETTO
...................................................................
1.1 Obiettivi e azioni
............................................................................
1.2 Il Partenariato
pag. 7
pag. 9
pag. 9
................................................................................
2. LA RAZZA
.....................................................................
2.1 La capra Girgentana
pag. 11
pag. 13
3. LA COMPOSIZIONE DEL LATTE CAPRINO .........................................
................................................................
3.1 Caratteristiche generali
3.2 I polimorfismi delle caseine del latte di capra ..................................
pag. 15
pag. 17
pag. 20
..............................
4. I MARCATORI MOLECOLARI MICROSATELLITI
....................................
4.1 I marcatori molecolari microsatelliti
pag. 27
pag. 29
5. GENOTIPIZZAZIONE AI LOCI CASEINICI NELLA RAZZA CAPRINA GIRGENTANA
....................................
5.1 Applicazioni di biotecnologie molecolari
5.2 Protocolli di analisi di biologia molecolare ....................................
pag. 31
pag. 33
pag. 33
6. VALIDAZIONE MARCATORI MOLECOLARI MICROSATELLITI NELLA RAZZA
CAPRINA GIRGENTANA E BASI APPLICATIVE DEL SISTEMA DI TRACCIABILITÀ
6.1 validazione dei marcatori molecolari ...........................................
pag. 43
pag. 45
7. QUANTIFICAZIONE DELLE VARIANTI ALLELICHE DEI LOCI CASEINICI
PER LA CARATTERIZZAZIONE DEL LATTE DELLA RAZZA GIRGENTANA ..
..........................
7.1 Estrazione delle proteine da latte
..................
7.2 Analisi quantitativa mediante rp-hplc/uv-vis
7.3 Estrazione degli acidi grassi da latte e transesterificazione
.................
7.4 Analisi quantitativa mediante GC-FID
pag. 49
pag. 51
pag. 52
pag. 55
pag. 56
8. ATTIVITÀ DI TRASFERIMENTO APPLICATIVO
DELL’INNOVAZIONE E COLLAUDO DEI RISULTATI DELLA RICERCA
.
8.1 Architettura funzionale ..............................................................
8.2 Architettura tecnologica ...............................................................
8.3 Analisi funzionale ......................................................................
8.4 Acquisizione latte .......................................................................
8.5 Trasformazione
.........................................................................
8.6 Conservazione (per singolo lotto) ..................................................
8.7 Vendita ........................................................................................
pag. 59
pag. 61
pag. 61
pag. 62
pag. 64
pag. 65
pag. 65
pag. 65
9. DEFINIZIONE E STESURA DI DISCIPLINARI DI
PRODUZIONE DI PRODOTTI TIPICI “DISOLAGIRGENTANA”
9.1 Fiorita di capra girgentana .................................................................
9.2 Semistagionato di capra Girgentana
.........................................
9.3 Fresco di capra Girgentana
...................................................
9.4 Robiola di capra Girgentana
...............................................
9.5 Il marchio “disolaGirgentana”
............................................
pag. 67
pag. 72
pag. 72
pag. 73
pag. 73
pag. 74
BIBLIOGRAFIA
pag. 77
...................................................
1
IL PROGETTO
IL PROGETTO
1.1 Obiettivi e azioni
Il progetto è nato dalla volontà di dare
sostegno e supporto alla ristrutturazione e
riqualificazione delle imprese operanti nelle
produzioni zootecniche in base alle nuove
norme riguardanti la sicurezza alimentare, la
tracciabilità e la rintracciabilità di prodotto e
di processo. Inoltre, osservando la crescente
scomparsa dei siti tradizionali di allevamento di specie tipiche, si vuole ottemperare al rilancio dei suddetti siti con linee
guida per la conversione o adeguamento
delle aziende presenti.
Gli elementi chiave della proposta progettuale sono stati il trasferimento di applicazioni di tracciabilità genetica e quindi
riconoscibilità di prodotti razza specifici e il
trasferimento di applicazioni di sistemi di
rintracciabilità intesa come capacità di
ricostruire la storia di un prodotto e delle sue
trasformazioni con informazioni documentate, al fine di fornire sempre maggiori
garanzia e sicurezza ai consumatori.
Il sistema messo a punto e validato permetterà al consumatore di conoscere in tempo
reale l'origine del prodotto, la provenienza, il
metodo di produzione, di trasferimento e
commercializzazione del prodotto in questione. Sistemi di tale tipo si configurano come sistemi di certificazione di una data filiera
e costituiscono quindi uno strumento indispensabile per qualsiasi politica di qualità
oltre che per la valorizzazione commerciale,
merceologica e quindi economica di un
prodotto, anche per la salvaguardia e valorizzazione della biodiversità animale.
1.2 Il Partenariato
Capofila
Università degli Studi di Palermo-Dipartimento Scienze Agrarie e Forestali;
L'Università degli Studi di Palermo, operando nell'ambito della ricerca di base ed industriale, dello sviluppo sperimentale, dell'in9
novazione tecnologica e del trasferimento
tecnologico, ha coordinato le attività del
progetto.
Partners
Consorzio Regionale di Ricerca Bioevoluzione Sicilia;
Consorzio di Ricerca Innovazione AgroBio e Pesca Ecocompatibile;
Consorzio Security and Promotion Food
Innovazione;
Azienda Agricola Todaro Massimo;
Azienda Agricola Fazio Giovanni;
Azienda Agricola Vassallo Salvatore;
Azienda Agricola Sciortino Nicolò;
Azienda Agricola Vasotti Salvatore;
Azienda Agricola di trasformazione
Burgio Antonina;
Azienda L'Albatro sas di D'Anna Saverio.
Sistema di Autenticazione
Applicazioni di biotecnologie molecolari per la tracciabilità e
autenticazione dei prodotti lattiero-caseari
CONCLUSIONI
MARCATORI MOLECOLARI
Identificazione della specie
BOVINO
Caratterizzazione delle razze
Tracciabilità e autenticazione
dei prodotti lattiero-caseari
OVINO
CAPRINO
RAZZA 1
10
RAZZA 2
Formaggio di
RAZZA 1
Formaggio misto
RAZZA 1 - RAZZA 2
2
LA RAZZA
LA RAZZA
2.1 La Capra Girgentana
L'antenata della Capra Girgentana è ritenuta
la Markhor o Falconeri così detta da
Falconer, naturalista inglese che per primo la
vide nel Kashmir, nell'Afghanistan settentrionale e nel Belucistan. La razza caprina
Girgentana trae la sua denominazione da
“Girgenti”, oggi Agrigento, capoluogo della
omonima provincia e, dove un tempo, essa
segnava la maggiore densità numerica.
L'origine di questa razza costituisce uno degli
interrogativi che l'osservatore si pone. Allo
stato attuale, i pareri sono i più discordi.
Nel lontano 1960, si asseriva che il pelame e
le corna della capra Girgentana ricordassero,
da vicino, i soggetti asiatici, viventi ancora
allo stato quasi selvatico e che non dovesse
scartarsi l'ipotesi che la sua origine fosse da
ricercarsi tra le capre asiatiche del Tibet, più
precisamente nella zona dell'Himalaya.
Amscheler sosteneva che questa capra
potesse provenire da una sottospecie della
capra Prisca. La Girgentana presenta alte
corna a “cavaturacciolo”, barba molto lunga
ed estesa a tutta la gola, mantello bianco
candido con delle macchie marroncine sul
collo e nella testa. È di taglia media, con la
fronte e i mascellari di colore fulvo tendenti
al roano e raramente al grigio, spesso caratterizzato da una picchiettatura (soggetti
piperini) più o meno estesa. Il pelo è ruvido e
di lunghezza media; la pelle bianco-rosea, a
volte con una leggera pigmentazione.
La capra misura al garrese 60-80 cm, mentre
il becco arriva a 85 cm, con lunghezza del
tronco di 1,06 m. Il peso vivo negli adulti è di
65 Kg nei maschi e 46 Kg nelle femmine; i
capretti alla nascita pesano circa 3,5 Kg ed a
60 giorni raggiungono il peso di circa 10 Kg.
L'indirizzo produttivo è quello della produzione del latte, 400-450 Kg per lattazione
(è una razza particolarmente vocata all'attitudine lattifera), che dura 150-180 giorni
nelle pluripare e che viene destinato al
consumo diretto sia per il sapore dolce che
13
per lo scarso odore ircino. Nel passato, nella
zona costiera, collinare e sub-montana
dell'Agrigentino la sua consistenza era
stimata intorno ai 30.000 capi; oggi risulta
notevolmente ridotta, tanto da prendere in
seria considerazione la messa a punto di
programmi di salvaguardia, allo scopo di
evitarne l'estinzione.
Fig. 2.1 - Capre di razza Girgentana
La vendita del latte, destinato al consumo
diretto, avveniva in passato al dettaglio e a
domicilio. Il subentrare di nuove norme in
materia di sanità e il conseguente divieto di
stabulazione delle capre entro i centri abitati
hanno determinato l'abbandono dell'alleva14
mento caprino da parte di molti allevatori.
La capra Girgentana potrebbe comunque
essere impiegata negli allevamenti a regime
stabulato, poiché non ha nulla da invidiare
alle razze altamente specializzate per il latte,
anzi, a parità di produzione produce un latte
altamente qualitativo e di elevato valore
nutritivo grazie al buon contenuto in protidi,
vitamine, lipidi ed elementi minerali, con
una percentuale media di grasso e proteine
rispettivamente del 4,7% e del 4,2%.
Essa potrebbe anche essere utilizzata per
valorizzare terreni aridi e marginali, allevandola in purezza oppure utilizzandola su
razze locali con l'incrocio di sostituzione, per
migliorare la morfologia della mammella che
si presenta globosa e ben attaccata
(http://www.capragirgentana.it/index2.htm).
3
LA COMPOSIZIONE
DEL LATTE CAPRINO
LA COMPOSIZIONE DEL LATTE CAPRINO
3.1 Caratteristiche generali
Il latte è un fluido biologico complesso
prodotto dalla ghiandola mammaria e caratterizzato da funzione nutrizionale, immunitaria e fisiologica. Per latte, in zootecnia, si
intende il prodotto ottenuto dalla mungitura
regolare, ininterrotta e completa della mammella di animali in buono stato di salute e
nutrizione.
Il latte è una miscela complessa di sostanze
di notevole importanza biologica e nutrizionale, quali proteine, grassi, zuccheri,
vitamine e sali minerali, e rappresenta un
alimento fondamentale che garantisce la
crescita e lo sviluppo dei neonati di tutti i
mammiferi. Le sostanze contenute nel latte
sono fondamentalmente uguali in tutte le
specie di mammiferi, ma le percentuali dei
singoli componenti variano in funzione sia di
fattori endogeni genetici (di razza e individuali) e fisiologici (stato di salute e stato di
lattazione), sia di fattori esogeni quali l'alimentazione, il clima, i sistemi di alleva-
mento, la tecnica e i tempi di mungitura.
La composizione e le caratteristiche biochimiche del latte dipendono in misura significativa dalla specie animale che lo produce
(Tabella 3.1).
Tab. 3.1 - Composizione del latte di differenti specie
Di seguito, i costituenti principali che compongono il latte di capra.
I lipidi
Per quanto riguarda la quantità di lipidi,
questa non differisce in modo significativo
dal latte vaccino, attestandosi intorno al 3,74,3%. Una sostanziale differenza si riscontra,
invece, nel diametro dei globuli di grasso
che, nel latte di capra, è inferiore rispetto al
latte vaccino; per questa ragione, il latte
caprino si presenta più omogeneo e dotato
17
di una maggiore digeribilità. Un'altra
differenza è data dalla presenza di una più
alta concentrazione di acidi grassi a corta
catena C4-C14.
Gli zuccheri
Essi sono rappresentati quasi esclusivamente dal lattosio che, nel latte caprino, si
trova in percentuale leggermente inferiore
rispetto al latte vaccino.
Le cellule somatiche
Le cellule somatiche sono elementi cellulari
derivanti dal sangue o dal tessuto ghiandolare mammario. Nel latte sono presenti
due categorie di cellule: i globuli bianchi o
leucociti (80% circa delle cellule totali nel
latte di mammelle sane), che sono presenti
in concentrazioni inferiori a 200.000 cellule/ml, e le cellule epiteliali (20% circa delle
cellule totali nel latte di mammelle sane),
che sono cellule di sfaldamento provenienti
dalla mucosa interna della mammella. Per
definizione, il contenuto in cellule somatiche
18
(CCS) è il numero dei leucociti nel latte. Gli
strumenti normalmente utilizzati nella conta
delle cellule somatiche non fanno distinzione tra leucociti e cellule epiteliali, per cui
anche queste ultime, comunemente, sono
incluse nel conteggio. Poiché nel latte di
capra le cellule epiteliali sono presenti in
maggiore quantità, ne deriva un contenuto
totale di cellule somatiche più alto nel latte
caprino rispetto a quello vaccino. Inoltre, nel
latte di capra è presente anche un numero
considerevole di particelle citoplasmatiche
provenienti dal sistema di secrezione apocrifa. Queste particelle, non possedendo
nuclei, non vengono classificate come cellule
per cui non vengono individuate tramite
strumenti specifici che rilevano la presenza
di DNA.
Le proteine
Le proteine costituiscono la maggior parte
delle sostanze azotate del latte, mentre la
restante parte è costituita da azoto non
proteico. Nel latte di capra la loro per-
LA COMPOSIZIONE DEL LATTE CAPRINO
centuale oscilla tra il 3,1 e il 4,5%.
La frazione proteica del latte è divisa in:
caseine, che rappresentano circa l'80%
delle proteine totali e vengono sintetizzate esclusivamente dalla ghiandola
mammaria (αs1-, αs2- β- e κ-caseina);
sieroproteine, costituite per la maggior
parte da β-lattoglobulina e α-lattoalbumina, anch'esse prodotte dalla ghiandola mammaria, ed in minima parte da
sieroalbumine e immunoglobuline di
provenienza ematica.
Le sieroproteine non sedimentano per
centrifugazione, precipitazione acida o
presamica e costituiscono circa il 20% delle
proteine del latte. Posseggono peso molecolare inferiore a quello delle caseine e sono
ricche di amminoacidi solforati, ragione per
cui sono dotate di elevato valore biologico.
Le caseine
Le caseine costituiscono, sia per peso che
per importanza, le principali proteine del
latte. Dal punto di vista nutrizionale, infatti,
sono proteine ad elevato valore biologico in
quanto contengono praticamente tutti gli
amminoacidi essenziali che, non essendo
sintetizzabili dal nostro organismo, siamo
costretti ad assumere con la dieta. Inoltre, da
un punto di vista tecnologico, esse sono alla
base del processo di coagulazione del latte e
quindi alla base del processo di caseificazione, di cui ne influenzano sensibilmente
la resa.
Sono presenti nel latte allo stato micellare e
sono caratterizzate dall'avere una parte
idrofobica ed una idrofila polare carica; le
regioni anioniche della zona polare sono
responsabili della sensibilità al calcio e di
alcune proprietà fisico-chimiche di queste
proteine (Greppi e coll., 2005). Le micelle
sono costituite da una frazione proteica e da
una componente minerale (fosfato di calcio),
possono essere separate per ultracentrifugazione, acidificazione e coagulazione enzimatica.
Il latte di capra, rispetto a quello vaccino, è
più ricco in sieroproteine e più povero in
19
caseine. Per questo motivo, esso produce
cagliate meno consistenti, poco adatte ad
essere portate ad alte temperature, più
difficili da spurgare e pressoché impossibili
da filare.
3.2 I polimorfismi delle caseine del latte di
capra
Nel latte dei ruminanti sono presenti quattro
diversi tipi di caseine: αs1-caseina, αs2caseina, β-caseina e κ-caseina. Queste
caseine possono essere suddivise in calcio
sensibili (αs1-caseina, αs2-caseina e βcaseina) e calcio insensibili (κ-caseina).
Le caseine sono codificate da 4 loci
autosomici (CSN1S1, CSN2, CSN1S2 e CSN3)
strettamente associati (Figura 3.1) che si
localizzano su un tratto di DNA di circa 250 kb
sul cromosoma 6 della specie caprina
(Martin e coll., 1996; Rijnkels, 2002).
Fig. 3.1 - Localizzazione dei geni delle caseine sul
cromosoma 6 della specie caprina.
BTA6/CHI6
250 Kb
αs1
20
β
αs2
κ
LA COMPOSIZIONE DEL LATTE CAPRINO
Gli studi sul polimorfismo delle proteine
ebbero inizio nel 1955 grazie ai lavori di
Aschaffeburg e Drewry che per primi misero
in rilievo la presenza di due varianti di βlattoglobulina nel latte bovino. La base
molecolare dei polimorfismi presenti nelle
proteine del latte è dovuta comunemente
alla sostituzione o all'eliminazione di aminoacidi nella catena proteica.
Le tecniche elettroforetiche vengono comunemente utilizzate per l'individuazione delle
frazioni proteiche del latte. Molto spesso,
grazie a queste tecniche, è stato possibile
individuare nuove varianti (alleli) in quanto
cambi amminoacidici sono responsabili della
variazione del punto isoelettrico delle proteine stesse.
3.2.1 L’αs1-caseina dal punto di vista
molecolare
Il gene dell’αs1-caseina (CSN1S1) si estende
su un tratto di DNA di circa 17 kb. È costituito
da 19 esoni compresi tra 24 bp e 385 bp, e 18
introni, tra 90 bp e 1685 bp (Ramunno e coll.,
2004). Per questo gene sono state identificate 17 varianti alleliche corrispondenti a 4
livelli di espressione/contenuto di questa
proteina nel latte (alto, medio, debole e
nullo).
Gli alleli forti (A, B1, B2, B3, B4, C, H, L, M)
sono associati ad un contenuto nel latte di s1caseina pari a 3,5 g/l; gli alleli intermedi (E, I)
ad un contenuto di 1,1 g/l; gli alleli deboli (F,
D, G) a 0,45 g/l e gli alleli nulli (01, 02, N) ad
una totale assenza di s1-caseina nel latte di
individui omozigoti (Chianese e coll., 1997;
Bevilacqua e coll., 2002; Ramunno e coll.,
2005).
Nel latte di capra, l'allele B1 è quello che
mostra la più stretta analogia con la corrispondente variante B dei bovini e degli
ovini, ragion per cui, si ha motivo di credere
che da questa variante, per sostituzioni
amminoacidiche, si sarebbero originate le
varianti di tipo A (A, G, I, H, 01 and 02) e di
tipo B (B2, B3, B4, C, E, F, L and D) (Martin e
coll., 1999).
21
La maggior parte delle mutazioni responsabili della formazione dei diversi alleli sono
state già identificate: in particolare, gli alleli
A, B1, B2, B3, B4, C, G, H, L e M, si sarebbero
originati per singole sostituzioni amminoacidiche (Chianese e coll., 1997; Martin e
coll., 1999; Bevilacqua e coll., 2002). In
particolare, l'allele C si è originato dall'allele
B4 per una singola sostituzione amminoacidica in posizione 8 (His-Ile) (Martin e coll.,
1999); l'allele L, si è originato dall'allele B, dal
quale differisce per la sostituzione di Arg con
His (Chianese e coll., 1997); l'allele M è
caratterizzato da una transizione C→T in
posizione 23 nell'ottavo codone dell'esone 9
che lo differenzia, quindi, dall'allele B da cui
esso deriva (Bevilacqua e coll., 2002). L'allele
E, invece, si origina da una inserzione di un
segmento di DNA tra il 124° e il 125°
nucleotide dell'esone 19, che riduce la
stabilità dell'RNA messaggero ed è probabilmente responsabile del ridotto livello di
questa proteina nel latte (Perez e coll., 1994).
L'allele F, secondo Martin e colleghi (1999),
22
deriva dall'allele B2 e presenta una delezione interna della citosina che riguarda il
23° nucleotide dell'esone 9 e l'inserzione di
11 bp e 3 bp nell'introne 9. Anche l'allele N si
caratterizza per la stessa delezione, che
conduce alla formazione di un codone di
stop prematuro al 12° esone (Ramunno e
coll., 2008). Infine, l'allele 01 è caratterizzato
da una delezione di un tratto di DNA di circa
8,5 Kb, che ha inizio dal 181° nucleotide del
12° introne ed include gli ultimi 7 esoni del
gene (Cosenza e coll., 2003).
3.2.2 L’αs2-caseina dal punto di vista
molecolare
Il gene dell’αs2-caseina (CSN1S2) si estende
su un tratto di DNA di circa 18.5 Kb ed è
costituito da 18 esoni, di lunghezza variabile
tra 21 bp e 266 bp, che codificano per 208
aminoacidi (Groenen e coll., 1993). Ad oggi,
sono stati identificati 8 alleli associati a
differenti livelli di espressione di αs2-caseina
nel latte caprino. Gli alleli A, B (Boulanger e
LA COMPOSIZIONE DEL LATTE CAPRINO
coll., 1984), C (Bouniol e coll., 1994), E
(Lagonigro e coll., 2001) ed F (Ramunno e
coll., 2001b) sono alleli forti e sono associate
ad un contenuto normale di questa proteina
nel latte (circa 2,5 g/l per allele). L'allele
intermedio D è associato ad un contenuto
ridotto (circa 1,5 g/l per allele), mentre
l'allele 0 è associato alla totale assenza di
questa proteina nel latte (Ramunno e coll.,
2001a, 2001b). La variante G, associata ad un
contenuto normale di αs2-caseina, è stata
identificata a livello proteico tramite IEF
(Erhardt e coll., 2002) ma non è ancora stata
caratterizzata a livello molecolare. Dal punto
di vista evolutivo (Ramunno e coll., 2000;
Sacchi e coll., 2005) l'allele A dell’αs2-caseina
può essere considerato l'allele ancestrale da
cui gli alleli B, C ed F si sono originati, ognuno
dei quali è caratterizzato da sostituzioni di
singoli nucleotidi responsabili di sostituzioni
aminoacidiche. L'allele B differisce dall'allele
A per una transizione G→A al 10° nucleotide
dell'esone 9, che causa la sostituzione
Glu64→Lys64, mentre l'allele C differisce da A
per una trasversione A→T al 5° nucleotide
dell'esone 16 responsabile della sostituzione
Lys167→ Ile167 nella proteina matura (Bouniol e
coll., 1993, 1994). Paragonando gli alleli A, B,
C ed E, si può dedurre che E deriva da C
poiché entrambi condividono la sostituzione
Lys167→ Ile167 (Lagonigro e coll., 2001; Sacchi e
coll., 2005). Ad ogni modo, la mutazione che
causa la formazione dell'allele E è una
trasversione C→G all'83° nucleotide dell'esone 16, responsabile della sostituzione
aminoacidica Pro197→ Arg197. L'allele F è
caratterizzato da una trasversione G→A al
13° nucleotide dell'esone 3 e causa la sostituzione amicoacidica Val7→ Ile7 (Ramunno e
coll., 2001b). L'allele D è caratterizzato da
una delezione di 106 bp che coinvolge 11 bp
dell'esone 11 e le prime 95 bp del successivo
introne (Ramunno e coll., 2001b); ciò causa
la perdita dei codoni Pro (CCC122), Thr (ACC123)
e Val (GTG124). In questo modo, l'ultimo
nucleotide (A) dell'esone 11 (il primo del
codone 121) insieme ai due nucleotidi (AT)
del successivo introne, porta alla formazione
23
di un nuoco codone (AAT121). In questo caso,
la variante è costituita da 205 aminoacidi e
porta Asn121 invece di Thr121 (Ramunno et al.
2001b).
Infine, l'allele 0 è caratterizzato da 19 SNPs
(Single Nucleotide Polymorphisms o polimorfismi a singolo nucleotide), ma la mutazione responsabile del contenuto nullo di
questa variante sembra essere una transizione G→A all'80° nucleotide dell'esone 11
che determina la formazione di un codone di
stop prematuro in posizione 110 con una
riduzione della lunghezza della proteina
matura a 109 aminoacidi invece che 208.
Come conseguenza, gli individui che portano
questo allele in condizioni omozigote presentano la totale assenza di questa frazione
proteica nel latte come dimostrato da alcuni
studi sperimantali basati su SDS-PAGE
(sodium dodecyl sulphate and urea-poly
acrylamide gel electrophoresis), RP-HPLC
(reverse phase-high performance liquid
chromatography) e HPLC/ESI-MS (HPLC
electrospray ionization mass spectrometry)
24
(Ramunno e coll., 2001a; Marletta e coll.,
2002).
3.2.3 La β-caseina dal punto di vista
molecolare
Tra le caseine, la β-caseina è la proteina più
abbondante nel latte rappresentando oltre il
50% del contenuto totale in caseine. Il gene
della β-caseina (CSN2) si estende su un tratto
di DNA di 9 kb ed è costituito da 9 esoni di
ampiezza variabile da 24 bp (esone 5) a 492
bp (esone 7) (Roberts e coll., 1992; Hayes e
coll., 1993). Ad oggi, sono stati identificati 10
alleli, di cui A, A1, C, C1, E, 0 e 0 caratterizzati
a livello molecolare (Rando e coll., 1996;
Persuy e coll., 1999; Chessa e coll., 2005,
2008; Cosenza e coll., 2005), B e D descritti
solo a livello proteico (Mahé e Grosclaude,
1993; Galliano e coll., 2004), ed un'altra
variante trovata da Chianese e coll. (2007) a
livello proteico ma non ancora caratterizzata. A livello di sintesi, le varianti alleliche A,
A1, B, C, C1, D ed E sono associate ad un
LA COMPOSIZIONE DEL LATTE CAPRINO
contenuto normale di β-caseina nel latte (~5
g/l per allele) (Roberts e coll., 1992; Mahé e
Grosclaude, 1993; Neveu e coll., 2002;
Galliano e coll., 2004; Cosenza e coll., 2005;
Caroli e coll., 2006), mentre gli alleli nulli 0 e
0’ sono associati ad un contenuto nullo di βcaseina nel latte di capra (Ramunno e coll.,
1995; Persuy e coll., 1999).
3.2.4 La κ-caseina dal punto di vista
molecolare
Il gene della κ-caseina (CSN3) è costituito da
5 esoni, ma più del 90% della regione codificante è contenuta nell'esone 4, infatti,
contiene la sequenza relativa a 162 dei 171
amminoacidi totali. Questa proteina è
essenziale per la formazione, l'aggregazione
e la stabilità delle micelle caseiniche, quindi
per le proprietà tecnologiche del latte
(Gutierretz e coll., 1996). Paragonando il
gene della κ-caseina (CSN3) delle specie
bovina, caprina e ovina, si evidenzia un'elevata omologia di sequenza, che, proba-
bilmente, può essere spiegata dal ruolo che
la proteina svolge nella stabilizzazione delle
micelle caseiniche (Alexander e coll., 1988).
Di Luccia e coll. (1990), identificarono le
prime due varianti proteiche nella specie
caprina, che furono confermate in un
secondo tempo a livello molecolare da Caroli
e coll. (2001). Successivamente, attraverso
l'applicazione di differenti metodologie di
analisi a livello molecolare, furono identificate un totale di 18 varianti (Yahyaoui e
coll., 2001; Angiolillo e coll., 2002; Chessa e
coll., 2003; Yahyaoui e coll., 2003; Jann e
coll., 2004; Prinzenberg e coll., 2005; Di
Gerlando e coll., 2013). Gli ultimi studi sulla
κ-caseina (Prinzenberg e coll., 2005) hanno
proposto di differenziare la nomenclatura a
livello proteico da quella a livello molecolare
introducendo due codici corrispondenti ai
due gruppi caratterizzati da punto isoelettrico (pI) differente: AIEF che comprende le
varianti A, B, B', B'', C, C', F, G, H, I, J, L, N e BIEF
di cui fanno parte le varianti D, D, E, K e M.
25
4
I MARCATORI
MOLECOLARI
MICROSATELLITI
I MARCATORI MOLECOLARI MICROSATELLITI
4.1 I marcatori molecolari microsatelliti
- AFLP ( A m p l i f i e d Fr a g m e nt L e n g t h
Polymorphism);
I marcatori molecolari sono sequenze conosciute di DNA e possono essere descritti
come una sorta di variazione nella sequenza
nucleotidica, che può sorgere in seguito a
mutazione o alterazione nei loci genomici e
che può essere osservata. I marcatori
molecolari possono essere costituiti da corte
sequenze di DNA, come la sequenza di
nucleotidi che circonda un polimorfismo a
singolo nucleotide (Single Nucleotide
Polymorphism o SNP), o da lunghe sequenze
di DNA come i microsatelliti. Possono essere
usati, per esempio, per studiare la relazione
tra la trasmissione di una malattia ereditaria
e le sue cause genetiche (una particolare
mutazione di un gene che codifica una
proteina difettosa) (Poetsch e coll., 2004;
Pelotti e coll., 2007).
I marcatori molecolari più frequentemente
utilizzati sono:
- RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism);
- RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA);
- SNP (Single Nucleotide Polymorphism);
- Microsatelliti (Short Tandem Repeats o
STRs).
Una delle caratteristiche peculiari più importanti dei marcatori molecolari è l'ereditabilità, la possibilità quindi di essere trasmessi da una generazione alla successiva.
Altre caratteristiche distintive sono l'associazione ad uno specifico locus, l'elevato
polimorfismo, la possibilità di essere applicati universalmente e di essere distribuiti
uniformemente nel genoma (RakoczyTroyanouska e Bolibok, 2004).
Tra i marcatori molecolari sopra citati, i microsatelliti posseggono un elevato polimorfismo e sono ampiamente distribuiti sul
genoma, caratteristiche che li rendono particolarmente idonei negli studi di genetica di
popolazione.
Un microsatellite è una specifica sequenza
non codificante di basi nucleotidiche
29
costituita da piccoli blocchi di ripetizioni in
tandem semplici (da 1 a 4 basi) e dispersi nel
genoma (Turnpenny e Ellard, 2005). Sono
abbastanza comuni le ripetizioni mononucleotidiche (A)n o (T)n, più rare le ripetizioni
(G)n e (C)n. Le ripetizioni dinucleotidiche
sono molto comuni, e sono altamente polimorfiche in quanto presentano un numero
variabile di ripetizioni in coppia. Le triple e le
quadruple ripetizioni sono invece molto
meno frequenti e più instabili (Tabella 4.1).
Tab. 4.1 - Esempi di sequenze di ripetizioni
Tandem Repeats (STRs), o Variable Number
of Tandem Repeats (VNTRs), a seconda della
lunghezza e della complessità della ripetizione (Rakoczy-Troyanouska e Bolibok,
2004). Sul genoma possiamo quindi ritrovare
queste particolari sequenze nucleotidiche il
cui polimorfismo è generato dalle differenze,
riscontrabili a ciascun locus, nel numero delle ripetizioni. Tale polimorfismo fa sí che i
microsatelliti siano ampiamente distribuiti
sul genoma e che presentino codominanza e
facilità di analisi.
Fig. 4.2 - Elettroferogramma di marcatori molecolari
microsatelliti
I microsatelliti si possono riscontrare nel
DNA intergenico, negli introni e nelle regioni
codificanti dei geni. Le regioni fiancheggianti
i microsatelliti risultano altamente conservate, per cui è possibile disegnare dei
primers specifici complementari ad esse. I
microsatelliti possono anche essere chiamati Simple Sequence Repeats (SSRs), Short
30
5
GENOTIPIZZAZIONE
AI LOCI CASEINICI
NELLA RAZZA CAPRINA
GIRGENTANA
GENOTIPIZZAZIONE AI LOCI CASEINICI NELLA RAZZA CAPRINA GIRGENTANA
5.1 Applicazioni di biotecnologie molecolari
5.2 Protocolli di analisi di biologia molecolare
Le applicazioni di innovazione tecnologica e
successivo trasferimento delle conoscenze
sono state rivolte a cinque aziende delle
province di Agrigento e Palermo impiegando
campioni individuali di animali di razza
Girgentana. In totale l'attività di validazione
dei protoccolli di analisi molecolari disponibili ha riguardato un totale di 373 campioni
di individui di entrambi i sessi provenienti
dalle aziende: Vasotti (Palermo), Fazio,
Sciortino, Gatì e Vassallo (Agrigento).
Al fine di definire l'innovazione tecnologica e
trasferire i risultati della ricerca, sono stati
utuilizzati diversi protocolli di analisi di biologia molecolare e di chimica analitica ottenuti come risultati della ricerca applicata
industriale sviluppata in altri progetti di
ricerca finanziati al Dipartimento.
Il protocollo di analisi molecolare utilizzato
prevede l'estrazione del DNA dai campioni
individuali di sangue, la quantificazione del
DNA estratto tramite spettrofotometro e la
diluizione del DNA estratto alle opportune
concentrazioni di lavoro in modo tale da
poter essere utilizzato nelle successive analisi che hanno riguardato la genotipizzazione ai loci caseinici e la genotipizzazione a
marcatori molecolari microsatelliti.
5.2.1 Estrazione
Estrazione del
del DNA
DNA genomico
genomico da
da
5.2.1
sangue intero
intero
sangue
Per
Per l'estrazione
l'estrazione del
del DNA
DNA genomico
genomico èè stato
stato
usato
un
metodo
salting-out
(noto
come
usato un metodo salting-out (noto come
metodo
metodo di
di James).
James). IlIl protocollo
protocollo di
di estrazione
estrazione
ha
previsto
due
giorni
di
lavoro.
ha previsto due giorni di lavoro.
Fig. 5.1 - Estrazione del DNA
33
Le attività svolte, per la validazione dei
protocolli selezionati, sono state le seguenti:
- Durante il primo giorno, dal sangue intero
prelevato in Vacutainer contenente EDTA
come anticoagulante, è stato isolato un
buffy coat di globuli bianchi, dal quale
è stata allontanata l'emoglobina tramite
lavaggi effettuati con l'utilizzo di una
soluzione di lisi RBC (Red Blood Cells) e di
una soluzione TBS (Tris Buffered Saline) a
pH 7,4. Il pellet di globuli bianchi è stato
quindi risospeso in una soluzione TE
buffer a pH 8,0 in un tubo da 15 ml.
Successivamente, è stato aggiunto al
tubo contenente il pellet una soluzione
composta da EDTA 0,5 M, SDS 10% e
proteinasi K. L'aggiunta di questa
soluzione è necessaria per la digestione
delle proteine e, una volta effettuato
questo passaggio, i campioni sono stati
lasciati in bagno termostatico over night a
50°C.
- Durante il secondo giorno, dopo aver
aggiunto una soluzione satura di NaCl
34
6M, i campioni sono stati vortexati e
centrifugati per far precipitare le
proteine. Quindi, il surnatante è stato
trasferito in un nuovo tubo da 15 ml a cui
è stato aggiunto precedentemente
etanolo assoluto ghiacciato. Questo
passaggio ha il compito di fare flocculare
il DNA, infatti agitando il tubo per
inversione comparirà un fiocco di DNA. Il
fiocco di DNA è stato recuperato dal tubo
da 15 ml e trasferito in un microtubo da
1,5 ml a cui è stato aggiunto precedentemente etanolo assoluto ghiacciato. A questo punto i campioni sono
stati centrifugati a massima velocità (circa
13.500 RPM) per circa 10 minuti a 4°C in
modo tale da permettere al DNA di
depositarsi sul fondo del tubo. Successivamente, è stato eliminato il surnatante
per inversione, aggiunto etanolo
ghiacciato al 70% ed è seguita
un’ulteriore centrifugazione a 4°C per
circa 3-5 minuti, alla massima velocità per
eliminare i residui di etanolo assoluto.
GENOTIPIZZAZIONE AI LOCI CASEINICI NELLA RAZZA CAPRINA GIRGENTANA
Quindi viene nuovamente eliminato il
surnatante per inversione, si lascia
evaporare l'etanolo a temperatura
ambiente per due ore circa.
Infine, il DNA è stato risospeso in 50 µl di
acqua sterile e i campioni vengono lasciati
over night a 4°C per permettere al pellet di
DNA di risospendersi completamente.
Per accertare la buona riuscita dell'estrazione è stata effettuata la quantificazione del
DNA tramite Nanodrop ND-1000.
Fig. 5.2 - Spettrofotometro Nanodrop Nd1000
trazione e della qualità del DNA, quindi del
grado di purezza del campione analizzato. I
campioni estratti, con il protocollo sopra descritto, hanno confermato un buon grado di
purezza e hanno presentato un rapporto di
assorbanza 260/280 maggiore o uguale a 1,8
e un rapporto di assorbanza 260/230 compreso tra 1,8 e 2,2. Tali valori sono indici di
riferimento per la valutazione qualitativa
della buona riuscita dell'estrazione e del
grado di purezza del DNA ottenuto. Dopo
essere stato quantificato, il DNA genomico
deve essere diluito a concentrazioni di 50
ng/µl in modo tale da poter essere utilizzato
nelle successive fasi di lavoro.
5.2.2 Amplificazione, analisi e genotipizzazione ai loci caseinici
Il Nanodrop è uno spettrofotometro UVVisibile capace di dare, tramite l'assorbimento a varie lunghezze d'onda (230-260280 nm), una misura esatta della concen-
Lo step successivo è stato la validazione della
genotipizzazione ai quattro loci caseinici αs1(CSN1S1), β-(CSN2), αs2-(CSN1S2) e κ-(CSN3)
che è stata condotta su circa 200 individui di
sesso femminile in lattazione. Questi sono
35
stati scelti, all'interno delle aziende in
esame, in modo tale di evitare animali imparentati tra di loro al fine di prelevare la
massima variabilità genetica presente entro
la popolazione. Le analisi sono state condotte seguendo i protocolli molecolari precedentemente messi a punto ed utilizzando
per le successive elaborazioni il software
POPGENE versione 1.31 (Yeh e coll., 1999)
per il calcolo delle frequenze alleliche e
genotipiche relative a ciascun locus. Ioltre
sono stati utilizzati altri software specifici per
l'allineamento delle sequenze ottenute.
Per il locus all’αs1-caseina, le genoti-
Tale protocollo consente la chiara separazione dei frammenti amplificati. Da questa
prima analisi è stato possibile evidenziare gli
alleli A*/0, B*/E, F ed N. Il gruppo A*
comprende gli alleli A, G, I, e H, mentre il
gruppo B* comprende gli alleli B1, B2, B3 e
B4. Per discriminare tra gli alleli A* e 0, e tra
gli alleli B ed E sono stati applicati due distinti
protocolli AS-PCR (Allele Specific-PCR).
Fig. 5.4. Elettroforesi
pizzazioni sono state eseguite applicando un
protocollo PCR-RFLP e una corsa su gel di
poliacrilamide.
Fig. 5.3 - Termociclatore
I protocolli molecolari prescelti e validati
hanno permesso l'identificazione degli alleli
A* e B*, definiti alleli forti, che sono associati
ad un contenuto di questa proteina nel latte
36
GENOTIPIZZAZIONE AI LOCI CASEINICI NELLA RAZZA CAPRINA GIRGENTANA
di ~3,6 g/l per allele, dell'allele E che è
definito allele intermedio perché associato
ad un contenuto di 1,1 g/l per allele,
dell'allele F che è definito allele debole e che
è associato ad un contenuto di 0,6 g/l per
allele e dell'allele N che rientra nel gruppo
degli alleli associati ad un contenuto nullo di
questa proteina nel latte.
Come si può notare dalla Tabella 5.1, che
riporta la frequenza degli alleli individuati, il
65% circa degli animali presenta alleli forti
(A*, B*) favorevoli per i processi tecnologici
di caseificazione.
Tab. 5.5 - Frequenza degli alleli individuati al locus
dell’αs1-caseina
I genotipi individuati sul totale degli individui
analizzati sono riportati nella Tabella 5.5.
Tab. 5.6 - Genotipi riscontrati sul totale degli individui
analizzati al locus dell’αs1-caseina
Alcuni studi condotti da Ramunno e coll. nel
2008 hanno evidenziato che un maggior
contenuto di αs1-caseina nel latte comporta
una migliore composizione in termini di
sostanza secca, proteina, fosforo ed un pH
più basso rispetto al latte con un minor
contenuto di tale frazione proteica. Effetti
positivi sono stati osservati anche per i
parametri di coagulazione e sulla resa in
formaggio: genotipi AA, AB e BB hanno una
resa in formaggio nettamente superiore ai
genotipi “deboli” come FF. È stata rilevata,
37
inoltre, un'influenza sulle proprietà organolettiche dei formaggi ottenuti con latte ad
alto contenuto di αs1- che è caratterizzato
per un sapore ed un odore meno intenso
rispetto a quello ottenuto da capre omozigoti per alleli deboli e nulli.
Per il locus β-caseina, le genotipizzazioni
sono state eseguite applicando un primo
protocollo PCR che permette l'identificazione degli alleli A*, C*, E e 0 (Chessa e
coll., 2005), seguito da un secondo protocollo PCR per discriminare gli alleli dei
gruppi A* e C*, ed in particolare A da A1 e C
da C1 (Chessa e coll., 2008). Le genotipizzazioni a questo locus prevedono il sequenziamento di entrambi i frammenti
ottenuti dalle amplificazioni PCR, tramite
ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied
Biosystems).
Le sequenze ottenute sono state analizzate
con software SeqScape versione 2.5 e successivamente allineate con software
ClustalW.
I protocolli molecolari prescelti e validati
38
hanno permesso l'identificazione degli alleli
A, C e C1, definiti alleli forti, associati ad un
contenuto di questa proteina nel latte di 6 g/l
per allele e dell'allele 0 che risulta associato
ad un contenuto nullo di questa proteina nel
latte (Tabella 5.3). Come si può notare dalla
tabella sottostante, quasi il 95% degli animali
presenta alleli forti (A, C e C1) che sono
associati, come già detto, ad un contenuto
elevato di questa proteina nel latte. Di
notevole importanza è la presenza dell'allele
nullo 0 che, nonostante risulti molto raro, è
presente negli individui di razza Girgentana
con una frequenza del 5,4%. Infatti la
presenza di tale allele, anche se con una
frequenza molto bassa, nella popolazione,
consente di ipotizzare impieghi alternativi
alla trasformazione in prodotti lattiero
caseari, della produzione di latte di questi
animali.
GENOTIPIZZAZIONE AI LOCI CASEINICI NELLA RAZZA CAPRINA GIRGENTANA
Tab. 5.7 - Frequenza allelica riscontrata al locus della
β-caseina nella popolazione analizzata
Per conoscenza nella Tabella 5.7 si evidenziano i genotipi riscontrati al locus della βcaseina sul totale degli individui analizzati.
Tab. 5.8 - Frequenza genotipica riscontrata al locus
della β-caseina nella popolazione analizzata
molecolari hanno permesso l'identificazione
degli alleli A, C, E ed F definiti alleli forti,
associati ad un contenuto di questa proteina
nel latte di ~2,5 g/l per allele. La Tabella 5.5
mostra che la totalità degli individui
analizzati presenta alleli forti ovvero associati ad un contentuto alto di questa
proteina nel latte.
Tab. 5.9 - Frequenza allelica riscontrata al locus
dell’αs2-caseina nella popolazione analizzata
Nella Tabella 5.9 vengono riportate le
frequenze genotipiche riscontrate al locus
dell’αs 2 -caseina nella razza caprina
Per il locus αs2-caseina, le genotipizzazioni
Girgentana.
sono state eseguite applicando protocolli
PCR-RFLP e AS-PCR con successiva corsa su
gel di agarosio per una chiara separazione
dei frammenti amplificati. I protocolli
39
Tab. 5.10 - Frequenza genotipica riscontrata al locus
dell’αs2-caseina nella popolazione analizzata
Dai risultati ottenuti è stato possibile notare
la mancanza sia dell'allele forte B che
dell'allele intermedio D e dell'allele nullo 0.
Per il locus κ-caseina, le genotipizzazioni
sono state eseguite applicando un protocollo PCR per l'amplificazione dell'esone 4
del gene tramite l'utilizzo di primers specifici.
Le genotipizzazioni prevedono il sequenziamento del frammento ottenuto dall'amplificazione PCR, tramite ABI PRISM 3130xl
Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Le
sequenze così ottenute sono state analizzate
con software SeqScape versione 2.5 e
successivamente allineate con il software
ClustalW (Thompson e coll., 1997).
La traduzione in sequenze aminoacidiche
40
delle sequenze nucleotidiche ottenute è
stata eseguita mediante il software ExPASyTraslate. Lo stesso software è stato usato per
calcolare il punto isoelettrico (IP) delle nuove
varianti genetiche identificate in modo tale
da poterle inserire in uno dei due gruppi, AIEF
o BIEF, corrispondenti ai due punti isoelettrici
(IP=5,53 e 5,78, rispettivamente) identificati
utilizzando il metodo isolettroforetico (IEF).
L'analisi delle sequenze nucleotidiche ha
mostrato la presenza, all'interno della razza
Girgentana, degli alleli A, B, D e G, identificati
in precedenti ricerche. Nei campioni
analizzati sono state riscontrate due nuove
varianti alleliche, chiamate D' e N, nell'esone
4 del gene della κ-caseina. La Tabella 5.7
mostra le frequenze alleliche riscontrate nel
totale degli individui analizzati e, si può
notare, che circa l'88% degli animali ha
presentato l'allele AIEF.
GENOTIPIZZAZIONE AI LOCI CASEINICI NELLA RAZZA CAPRINA GIRGENTANA
Tab. 5.11 - Frequenze alleliche riscontrate nel totale
degli individui analizzati al locus della κ-caseina
Tab. 5.12 - Frequenza genotipica riscontrata nella
popolazione analizzata al locus della κ-caseina
La Tabella 5.11 mostra le frequenze genotipiche al locus della κ-caseina sul totale degli individui
analizzati.
41
6
VALIDAZIONE MARCATORI
MOLECOLARI MICROSATELLITI
NELLA RAZZA CAPRINA
GIRGENTANA E BASI
APPLICATIVE DEL SISTEMA
DI TRACCIABILITÀ
Validazione marcatori molecolari microsatelliti nella razza caprina
Girgentana e basi applicative del sistema di tracciabilità
6.1 Validazione dei marcatori molecolari
Il DNA estratto dai campioni individuali di
sangue è stato utilizzato per analizzare gli
individui di razza caprina Girgentana con un
pannello di marcatori microsatelliti.
In totale sono stati analizzati 240 animali
amplificando, tramite multiplex PCR, 20
marcatori microsatelliti (Tabella 6.1 ).
Tab. 6.1 - Marcatori microsatelliti analizzati
I marcatori analizzati sono stati scelti in
modo tale da coprire il maggior numero di
cromosomi e quindi da ottenere un quadro
quanto più possibile informativo sulla
variabilità nella popolazione. L'analisi dei
marcatori microsatelliti è stata in primo
luogo eseguita tramite elettroforesi capillare
con ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer
(Applied Biosystems) e i dati sono stati
analizzati con il software GeneMapper
versione 4.0 (Applied Biosystems).
I risultati ottenuti dalle genotipizzazioni di
tutti gli animali sono stati analizzati con
diversi software:
Cervus versione 3.0 (Kalinowski e coll.,
2007) per stimare il numero medio di
alleli per locus (MNA), l'eterozigosità
attesa e osservata (He e Ho), il
Polymorphic Information Content (PIC)
determinato dal numero di varianti
alleliche che presenta ciascuno dei
marcatori utilizzati.
45
FSTAT (Goudet 1995) per il calcolo
dell'allelic richness (AR), un parametro
che misura il polimorfismo di un
marcatore molecolare aggiustato per la
numerosità del campione.
Genetix (Belkhir e coll., 2004) per
l'analisi delle corrispondenti fattoriali.
Per studiare la struttura genetica e il grado di
differenzazione dell'intera popolazione
considerata, verranno calcolati gli indici di
fissazione di Wright (Fis, Fit e Fst) e l'inbreeding
mediante il software Molkin versione 2.0.
L'analisi di validazione dei microsatelliti
prevede anche la individuazione di marcatori razza specifici (alleli privati), ovvero
possibili alleli presenti solo all'interno di una
determinata razza, potenzialmente utilizzabili per il sistema di tracciabilità molecolare. Ad oggi infatti, la maggiore criticità
evidenziata per la filiera lattiero-casearia è
l'assenza di un sistema di certificazione
univoco ed oggettivo, soprattutto per quelle
produzioni classificate monorazza, ovvero
ottenute con latte appartenente ad una
46
specifica razza. Concepire un mercato
alimentare di prodotti monorazza, dotati di
un sistema di certificazione di origine
animale, contribuirebbe a migliorare la redditività delle razze e nel caso specifico della
razza Girgentana, al tempo stesso la
sostenibilità delle loro produzioni zootecniche.
Per la definizione del sistema di tracciabilità
sono stati analizzati 41 campioni individuali
di razza caprina Maltese e 33 campioni di
razza caprina Derivata di Siria. I campioni
sono stati genotipizzati, tramite multiplex
PCR, ai 20 marcatori microsatelliti ed è stato
selezionato un subset di microsatelliti
potenzialmente utilizzabili per la definizione
del sistema di tracciabilità molecolare.
L'analisi dei marcatori microsatelliti è stata in
primo luogo eseguita tramite elettroforesi
capillare con ABI PRISM 3130xl Genetic
Analyzer (Applied Biosystems) e i dati sono
stati analizzati con i softwares GeneMapper
versione 4.0 (Applied Biosystems). I risultati
ottenuti dalle genotipizzazioni sono stati
Validazione marcatori molecolari microsatelliti nella razza caprina
Girgentana e basi applicative del sistema di tracciabilità
analizzati con i diversi software citati in
precedenza per il calcolo delle frequenze
alleliche, il numero medio di alleli (MNA),
l'allelic richness (AR), l'eterozigosità osservata (Ho) e attesa (He), il Contenuto di
Informazione Polimorfica (PIC) e l'equilibrio
di Hardy-Weinberg (HWE). I risultati ottenuti
hanno mostrato una elevata variabilità ed
informatività del subset di microsatelliti
(PIC=0,65; MNA=8,67). L'AR variava da un
minimo di 4,585 per il locus TGLA122 che
presentava 6 alleli e un massimo di 9 per il
locus OLADRB con 11 alleli.
In particolare i marcatori microsatelliti con
alleli privati nelle singole razze sono stati
FBC48, FBC20, CSRD247, SRCRSP0005,
OLADRB, SRCRSP0008, OARAE54, FCB11,
ETH225, SRCRSP0024, McM64. In totale
sono stati trovati 13 alleli privati in
Girgentana, 11 alleli in Maltese e 3 in
Derivata di Siria.
Il microsatellite TGLA122 pur non avendo
alleli privati nelle singole razze è stato
selezionato per la tracciabilità dei prodotti
lattiero-caseari perché presentava l'allele
151 nelle razze Maltese e Derivata di Siria ma
non presente in Girgentana. Per la
tracciabilità sono stati utilizzati anche l'allele
109 al marcatore microsatellite FCB20 e
l'allele 177 al marcatore microsatellite
SRCRSP0005. I marcatori microsatelliti con
alleli privati sono stati validati su pools di
DNA, costruiti artificialmente in laboratorio,
mescolando, in proporzioni variabili, il DNA
proveniente dalle tre razze. Successivamente, l'analisi è stata condotta anche su
DNA estratto da formaggio prodotto con
latte di sola capra Girgentana.
Marcatore microsatellite FCB20
47
Marcatore microsatellite Sp05
Marcatore microsatellite TGLA122
I risultati ottenuti hanno evidenziato, attraverso un'analisi molecolare rapida, precisa e poco
costosa, la possibilità di utilizzare questi tre marcatori microsatelliti per la tracciabilità dei
prodotti lattiero-caseari di razza Girgentana al fine di rilevare la presenza di latte appartenente
ad altre razze caprine.
48
7
QUANTIFICAZIONE DELLE
VARIANTI ALLELICHE
DEI LOCI CASEINICI
PER LA CARATTERIZZAZIONE
DEL LATTE
DELLA RAZZA GIRGENTANA
Quantificazione delle varianti alleliche dei loci caseinici
per la caratterizzazione del latte della razza Girgentana
7.1 Estrazione delle proteine da latte
Sono stati analizzati campioni di latte
individuale, appartenenti ad animali con
genotipo noto alle caseine, per la quantificazione delle varianti alleliche ai loci
caseinici.
I campioni di latte prelevati presso le 3
aziende (Fazio, Vasotti e Sciortino), sono
stati liofilizzati subito dopo il prelievo e
congelati a -80°C per garantirne una migliore
conservazione. Prima dell'analisi, ogni liofilizzato è stato opportunamente solubilizzato, e come previsto dal protocollo di
Bobe e coll. (1998), un'aliquota da 500 µl di
campione è stata congelata a -20°C fino al
momento dell'analisi. In una seconda fase,
all'aliquota congelata è stata aggiunta una
soluzione contenente 0,1 M BisTris buffer
(pH 6,8), 6 M GdnHCl, 5,37 mM di citrato di
sodio e 19,5 mM di DTT (pH 7,0) in un
rapporto di 1:1 (v:v) a temperatura
ambiente. Dopo lo scongelamento, ciascun
campione è stato vortexato per circa 10
secondi e incubato per 1 ora a temperatura
ambiente. Successivamente, il campione è
stato centrifugato per 5 minuti a 16000xg.
Rimosso lo strato di grasso superficiale con
una spatola, il campione rimanente è stato
nuovamente diluito in un rapporto 1:3 (v:v)
con una soluzione contenente 4,5 M GndHCl
e solvente A costituito da acetonitrile, acqua
ultrapura e acido trifluoroacetico
(100:900:1, v:v:v, pH 2,0). Con questo
protocollo la concentrazione delle proteine
del latte nella soluzione finale risultava
diluita otto volte circa, ciò significa che se la
concentrazione proteica fosse all'incirca 4
mg/ml nel diluito, quella nel campione di
latte iniziale sarebbe circa 32 mg/ml.
Il campione così trattato è stato infine
trasferito in vials prima dell'analisi cromatografica.
51
7.2 Analisi quantitativa mediante RPHPLC/UV-Vis
Al fine di separare e quantificare le più
comuni varianti alleliche delle proteine è
stato sviluppato e validato il metodo di
analisi mediante RP-HPLC/UV-Vis (Bonfatti e
coll., 2008).
Fig. 6.1 Apparecchiatura RP-HPLC
52
La Cromatografia Liquida ad Elevate
Prestazioni (HPLC) è una tecnica che,
sfruttando le diverse affinità delle molecole
nei confronti di due diverse fasi (una fase
stazionaria rappresentata dalla colonna
cromatografica e una fase mobile fatta scorrere in modo continuo sulla fase stazionaria)
ne consente la separazione da miscele più o
meno complesse. L'eluente viene pompato
in modo continuo e riproducibile nella colonna di acciaio contenente la fase stazionaria,
mentre il campione in analisi viene introdotto direttamente nel flusso di eluente. I
composti in uscita dalla colonna vengono
rilevati ed evidenziati, sia dal punto di vista
qualitativo che quantitativo, da un rivelatore UV-Visibile che registra la variazione
di assorbimento delle molecole nella regione dell'UV-Visibile. Nello specifico, la
cromatografia liquida in fase inversa (RPHPLC) è costituita da una fase stazionaria
apolare (di natura idrofoba non solubile in
acqua) e una fase mobile polare (di solito
una miscela di acqua e acetonitrile).
Quantificazione delle varianti alleliche dei loci caseinici
per la caratterizzazione del latte della razza Girgentana
Questa tecnica cromatografica permette di
separare le proteine/molecole in base alla
polarità, inoltre, a seconda della lunghezza
delle catene idrofobe della fase stazionaria,
è possibile separare proteine di diversa
grandezza.
È stata utilizzata una colonna analitica C8
(Zorbax 300SB RP-C8, 3,5 μm, 300A, 150×4,6
ID) e la rivelazione UV-Vis è stata effettuata a
una lunghezza d'onda di 214 nm.
Per gli esperimenti di calibrazione varianti
genetiche pure sono state estratte da campioni di latte individuale di animali con
genotipo noto, considerando che in commercio non erano disponibili le varianti
alleliche delle caseine caprine.
In particolare, sono stati utilizzati animali
con genotipo omozigote alle singole caseine
ed in particolare i genotipi: AA, BB, FF e NN
all' αs1-caseina, CC e C'C' alla β-caseina, AA e
FF alla αs2-caseina, ed infine AA e BB alla kcaseina. Gli estratti proteici ottenuti contenenti le rispettive varianti alleliche omozigoti sono stati liofilizzati e successivamente
solubilizzati con solvente A al fine di ottenere
le rispettive soluzioni standard necessarie
per la fase di calibrazione strumentale.
La validazione del metodo prevedeva il test
di linearità e le stima di ripetibilità, riproducibilità e precisione. Nello specifico sono
stati analizzati dieci campioni di latte
individuale. La linearità è stata testata
analizzando lo stesso campione a volumi di
iniezione crescenti 5-80 µl, in triplicato.
L'accuratezza, invece, è stata determinata
quantificando ciascuna variante allelica in
due campioni e ripetendo la quantificazione
con miscele diverse di essi (a 75, 50 e 25%)
analizzate in duplicato.
Una relazione lineare è stata osservata tra le
concentrazioni delle proteine e le aree
sottese dal picco nell'intervallo di concentrazione in analisi con l'ottenimento di limiti
di rilevabilità bassi. Per ciascuna variante
caseinica sono state costruite le curve di
calibrazione iniettando volumi crescenti (5,
10, 20, 40 e 80 µl) di soluzione standard
corrispondente.
53
L'analisi condotta mediante RP-HPLC ha
confermato una buona separazione delle
varianti alleliche all’αs1-caseina a differenza
Tab. 6.2 - Dati quantitativi ottenuti
delle restanti varianti caseiniche.
Successivamente alla fase di validazione del
metodo sono stati analizzati numerosi campioni con genotipo omozigote ed eterozigote
alle varianti alleliche dell’αs 1 -caseina,
mentre con genotipo omozigote alle restanti
varianti caseiniche, che hanno consentito la
quantificazione per singolo allele.
La precisione del metodo è stata valutata
stimando la ripetibilità, con iniezioni
consecutive di campioni, e la riproducibilità,
analizzando ogni campione in quattro giorni
diversi. La ripetibilità e riproducibilità sono
risultate soddisfacenti sia per i tempi di
ritenzione che per le aree sottese ai picchi.
I dati ottenuti hanno mostrato che le varianti
alleliche A e B dell’αs1-caseina sono alleli
forti, cioè associati ad un alto contenuto di
caseina nel latte, mentre la variante F è un
allele debole associato ad un basso livello di
αs1-caseina nel latte.
Infatti l'espressione dell'allele B rispetto ad A
determina un contenuto maggiore di αs1caseina nel latte.
Il confronto dei dati ottenuti per l’αs2caseina, con quelli riportati in letteratura ha
mostrato un contenuto paragonabile per gli
alleli A e F, definiti alleli "forti" e associati con
un contenuto normale di questa proteina nel
latte.
54
Quantificazione delle varianti alleliche dei loci caseinici
per la caratterizzazione del latte della razza Girgentana
Il confronto dei dati per la β-caseina con
quelli pubblicati ha mostrato un contenuto
inferiore di questa proteina associata
rispettivamente agli alleli C e C1 (3,0 ± 0,8 e
2,0 ± 0,7) .
Importanti risultati sono stati ottenuti per la
κ-caseina, perché in letteratura non ci sono
dati di quantificazione per singola variante
allelica. I dati disponibili confermano che il
gruppo BIEF rappresenta il gruppo di varianti
più favorevoli in termini di contenuto in κcaseina nel latte rispetto al gruppo AIEF.
7.3 Estrazione degli acidi grassi da latte e
transesterificazione
La determinazione del profilo di acidi grassi è
stata effettuata mediante gascromatografia
con rivelatore a ionizzazione di fiamma (GCFID).
Il metodo validato prevede due fasi principali: una fase preparativa del campione e
una fase di separazione ed analisi qualiquantitativa delle diverse componenti. Rela-
tivamente alla preparazione del campione,
per l'estrazione della materia grassa, il metodo messo a punto si basa su un'estrazione
da una soluzione ammoniaco-alcoolica del
latte con etere etilico ed etere di petrolio
seguita da evaporazione dei solventi mediante l'utilizzo della strumentazione
Rotavapor R-215 BÜCHI.
Nello specifico vengono pesati in un cilindro
da 100 ml con tappo, con l'approssimazione
di 1 mg, 10 g di latte liquido ottenuto previa
solubilizzazione del liofilizzato, a cui viene
aggiunto un volume di 1,5 ml di soluzione di
ammoniaca al 25%. Successivamente vengono introdotti 10 ml di alcol etilico, il campione viene agitato senza tappo e poi si
aggiungono 25 ml di etere etilico. Il cilindro
viene infine tappato ed agitato per 1 min.
Tolto il tappo con precauzione, vengono aggiunti 25 ml di etere di petrolio e il campione
viene successivamente agitato per 30
secondi. La sospensione così ottenuta viene
lasciata a riposo finchè lo strato superiore
non diventa limpido e si separi nettamente
55
da quello inferiore. Tale strato viene trasferito in un pallone da vuoto. L'estrazione
viene ripetuta altre due volte sempre allo
stesso modo riducendo solo i volumi dei due
eteri a 15 ml e gli estratti vengono raccolti
nello stesso pallone. L'evaporazione dei solventi viene effettuata mediante Rotavapor,
come riportato precedentemente, e il
campione viene incubato a 40°C in stufa per
1 ora. L'estratto così ottenuto è successivamente solubilizzato in n-pentano e
transesterificato mediante l'utilizzo di 500 µl
KOH in MeOH (2 N) in modo da indurre la
formazione di esteri metilici che, oltre a
liberare gli acidi grassi dal legame col
glicerolo, li trasforma in una forma più
volatile, maggiormente adatta all'analisi
gascromatografica.
7.4 Analisi quantitativa mediante GC-FID
L'analisi è stata condotta con l'utilizzo del
gascromatografo SHIMADZU GC-2010.
Gli acidi grassi metilati vengono iniettati in
56
colonna capillare (ZEBRON ZB-WAX plus 30
m x 0,32 mm i.d., 0,2 µm film), separati come
tali ed identificati da un rivelatore a
ionizzazione di fiamma (FID).
Preliminarmente all'analisi gascromatografica, mediante una serie di prove sperimentali, è stato validato il metodo strumentale
che prevede oltre al settaggio dei parametri
di lavoro anche la costruzione di una curva di
calibrazione necessaria per la determinazione quantitativa dei singoli acidi grassi.
Nel caso specifico è stato utilizzato il metodo
della standardizzazione esterna ed in particolare sono stati utilizzati gli standards di 13
esteri metilici analizzati prima come singoli
standard, per l'identificazione dei picchi in
base ai tempi di ritenzione, e poi in miscela a
concentrazioni note.
Nello specifico sono state preparate quattro
mix a concentrazioni diverse per la costruzione di una curva a quattro punti, come
riportato in tabella 13, che mette in relazione
le aree dei picchi in funzione della concentrazione dello standard corrispondente.
Quantificazione delle varianti alleliche dei loci caseinici
per la caratterizzazione del latte della razza Girgentana
Tab. 13 - Concentrazioni dei differenti standard di
esteri metilici degli acidi grassi utilizzati per la
calibrazione
Dopo la messa a punto del metodo
cromatografico si è proceduto all'analisi dei
campioni. Gli esteri metilici ottenuti dopo la
transesterificazione vengono trasferiti in
vials e iniettati allo strumento per l'analisi
gascromatografica. I cromatogrammi così
ottenuti sono stati interpretati e i risultati
caricati su supporto informatico, in particolare su foglio elettronico, precedentemente
costruito, per il calcolo del contenuto in
grammi di singolo acido grasso in 100 g di
grasso estratto utilizzando la formula:
[C] =
Q RC
FAi 100
PC
dove QRC è la quantità di estere metilico di
acido grasso in g; PC è il peso del campione di
grasso in g; FAi è un fattore di conversione da
estere metilico a corrispondente acido
grasso.
Il dataset prodotto è stato analizzato
attraverso le procedure GLM per misure
ripetute del software SAS System versione
9.2.
L'obiettivo è stato quello di verificare
l'associazione tra i genotipi alle caseine più
abbondanti, nell'allevamento in cui si è
condotto il campionamento, e la composizione acidica del latte caprino in tre diverse
stagioni: ottobre, febbraio e giugno, periodi
questi che corrispondono rispettivamente a
inizio, metà e fine della lattazione.
L'interazione genotipo-stagione di campionamento ha mostrato delle interessanti
associazioni statisticamente valide tra la κcaseina e la concentrazione di alcuni acidi
grassi, il C18, il C 18:1, il C18:3 ed il C20.
Questi acidi grassi svolgono un effetto
positivo sulla salute dell'uomo, protettivo sul
57
sistema cardiovascolare, in quanto questi
acidi riducono i livelli ematici di colesterolo e
dei trigliceridi.
58
8
ATTIVITÀ
DI TRASFERIMENTO
APPLICATIVO
DELL’INNOVAZIONE
E COLLAUDO DEI
RISULTATI
DELLA RICERCA
Attività di trasferimento applicativo dell’innovazione
e collaudo dei risultati della ricerca
Il trasferimento applicativo del progetto
“Riqualificazione delle imprese del settore
lattiero caseario, tramite applicazioni biomolecolari e bioinformatiche di tracciabilità
e rintracciabilità dei prodotti per la sicurezza
alimentare e di una filiera tipica per la razza
caprina tipica Girgentana” è consistito nella
sperimentazione e validazione, con le
aziende prescelte di produzione e trasformazione del settore lattiero-caseario, di un
sistema innovativo per garantire la tracciabilità e la rintracciabilità di processo lungo
l'intera filiera. Di seguito si illustrano le
caratteristiche e le sezioni del portale
www.disolagirgentana.it dedicato alla razza
caprina Girgentana e volto a garantire il trasferimento dell’innovazione agli operatori
della filiera.
8.1 Architettura funzionale
categorie dei seguenti attori: Università,
Allevatori, Caseificatori.
In particolare il modulo “Università” funge
da hub dell'intero sistema e raccoglie tutti i
dati prodotti dagli altri moduli al fine di
disporre di un database per le necessarie
elaborazioni scientifiche e gestionali,
nonché per la definizione delle modalità di
selezione dei dati da pubblicare nel portale.
Tale modulo dispone di funzionalità di
connessione ad output di applicazioni biochimiche e genetiche a monte, e ad applicazioni scientifiche di calcolo a valle; nonché,
ove possibile, di interoperabilità nello
scambio dati.
8.2 Architettura tecnologica
Come descritto in precedenza, il sistema
gestionale prevede una parte di back office
ed una di front office.
Il sistema finale si compone di quattro
moduli principali, un portale pubblico ed un
modulo specifico per ciascuna delle 3
61
8.3 Analisi funzionale
In questa sezione vengono riportate in
dettaglio le funzionalità del sistema.
Modulo “Università”
L'Università degli Studi di Palermo è l'attore
principale per il suo ruolo di promotore e di
coordinatore del progetto, nonché per
l'eterogeneità delle esigenze informative. In
conformità agli obiettivi del progetto, il
sistema informativo a supporto delle attività
è composto da diverse macroaree:
anagrafica (allevatori, razza e individui;
caseificatori, strumenti di produzione);
analisi bio-genetiche;
analisi dati gestionali;
rintracciabilità;
area pubblica;
Per ognuna di queste macro-aree, il sistema
presenta un modulo specifico, pur mantenendo l'assetto di un portale integrato, con
la predisposizione della possibilità di
visualizzazione di alcuni dati in un'area pub62
blica dello stesso. Di seguito le informazioni
disponibili in ogni macro-area.
Allevatori: nome, ubicazione, note generali.
Razze: dati genetici e caratteri fenotipici.
ID animali: razza, matricola, data di nascita,
sesso.
Caseificatori: nome, ubicazione, note generali.
Strumenti di produzione: tipi di impianti
Gestione dati scientifici
Collegamento ai dati anagrafici;
dati relativi ai genotipi per singolo capo:
loci caseinici (CSN1S1, CSN1S2, CSN2 e
CSN3);
marcatori microsatelliti;
import dati biochimichi;
export dati genetici e biochimici verso
applicazioni per il calcolo analitico;
consolidamento dei dati.
Analisi dati gestionali
Import dati di produzione da aziende.
Report configurabili per analisi multidimensionali sui dati disponibili: rese massime,
Attività di trasferimento applicativo dell’innovazione
e collaudo dei risultati della ricerca
rese medie, rese per tipo di caglio, per
singolo allevatore, etc.
Rintracciabilità
Sistema di interrogazione che dal n° lotto
risale a tutti i dati produttivi ad esso inerenti.
Area pubblica
Portale pubblico con le seguenti sezioni:
Home - presentazione progetto;
aziende partecipanti - breve scheda
descrittiva e link al sito;
schede tecniche: capra Girgentana, latte,
formaggi;
form per la rintracciabilità.
Modulo “Allevatori”
Il modulo applicativo dedicato agli allevatori
è caratterizzato da estrema semplicità d'uso
in relazione al contesto di lavoro.
In relazione alle esigenze di progetto nonché
a quelle gestionali, il modulo applicativo
consente sia una pesata “totale” sia una
pesata “singola”. L'organizzazione operativa
dell'attività di mungitura, che determina la
configurazione funzionale del modulo in
oggetto che gira su un tablet di tipo
“rugged”, è stata così strutturata: ogni
animale è dotato di un tag di tipo RFID; al
momento della lattazione, l'animale viene
condotto nell'apposito cancello; il tablet
acceso inizializza in automatico l'ID del lotto
di produzione in relazione alla data ed
all'eventuale ripetizione delle attività nel
corso della stessa giornata; un ID “tipo”
potrà assumere, quindi, la seguente forma:
0124022012xyzxyz, dove i primi due numeri
indicano il progressivo di mungitura per la
stessa giornata, mentre i successivi otto
numeri indicano la data nel formato
ggmmaaaa; gli ultimi caratteri indicano il
codice dell'allevatore in conformità alle
tabelle regionali.
L'operatore sceglie se trattasi di mungitura a
pesata totale o singola; il tablet, dotato di
lettore RFID rivelerà il singolo individuo;
l'operatore, se ritiene l'animale in “lattazione” potrà procedere alla mungitura ed
63
alla relativa annotazione della quantità
ottenuta (in caso di pesata singola) o passare
all'animale successivo. In caso di pesata
singola, alla fine delle operazioni, su input
dell'operatore, il sistema calcolerà automaticamente il peso totale; in caso di pesata
totale, sarà l'operatore a dover scegliere
l'opzione “fine” e, quindi, immettere il peso
totale rilevato.
Il sistema comporrà una distinta di mungitura che potrà essere stampata ed allegata
al latte e/o inviata con relativo file (sia pdf
che xml) all'Università, anche in un
momento successivo.
Ognuna di dette fasi si articola in specifiche
attività sequenziali.
Per la prima fase, acquisizione latte, il documento di riferimento è quello in Appendice
1, i cui dati sono trasversali all'intero ciclo di
lavorazione.
Il modulo “Caseificatori” è stato sviluppato,
in prima istanza, in architettura desktop per
un utilizzo su tablet. Per gli scopi finali del
progetto, a seguito del completamento della
sperimentazione effettiva, se ne potrà
valutare la fattibilità e la convenienza del
porting verso architetture client-server in
modalità web based.
Modulo “Caseificatori”
Il processo produttivo delle aziende di
caseificazione, nell'ambito di quelle partecipanti al progetto, può essere articolato in
quattro fasi principali:
acquisizione latte;
trasformazione;
conservazione;
vendita.
8.4 Acquisizione latte
64
Rilevazione dati lotto latte
Codice dell'allevatore di provenienza;
id razza (collegamento a tabella
allevatore);
data di mungitura;
rilevazione peso.
Attività di trasferimento applicativo dell’innovazione
e collaudo dei risultati della ricerca
Prelievo campioni per analisi di laboratorio
Grasso, proteine, lattosio, urea, cellule
somatiche, carica batterica (i valori relativi a
questi dati potranno essere inseriti in un
momento successivo, dopo la ricezione delle
risultanze analitiche).
Lavorazione
Annotazione parametri di termizzazione
(temperatura e tempi) e raffreddamento
(tempi);
rilevazione peso prodotto ottenuto (prima della conservazione) e quantità
forme;
creazione ID del lotto di produzione;
pesatura siero;
lavorazione ricotta;
rilevazione quantità ricotta ottenuta.
8.5 Trasformazione
8.6 Conservazione (per singolo lotto)
Inserimento in cisterna
Rilevazione parametri qualitativi, PH e SH;
inserimento in cisterna e misurazione della
quantità.
Pianificazione prodotti principali
Selezione scheda di lavorazione prodotto
rilevazione tipo innesto;
rilevazione tipo caglio;
rilevazione tipo muffe;
rilevazione strumenti.
Calendarizzazione controlli;
annotazione in sede di controllo;
rilevazione rese finali.
8.7 Vendita
Raccordo ID lotto/etichettatura.
65
Rilevazione dati vendita
66
9
DEFINIZIONE
E STESURA
DI DISCIPLINARI
DI PRODUZIONE
DI PRODOTTI TIPICI
“DISOLAGIRGENTANA”
Definizione e stesura di disciplinari di produzione
di prodotti tipici “disolaGirgentana”
I parametri presi in considerazione durante
le fasi di realizzazione delle diverse tipologie
di formaggi sono indicativi e rappresentano
un punto di riferimento per il casaro che
attraverso la propria esperienza potrà
mantenere la produzione entro range
accettabili e comunque non eccessivamente
disformi da quelli collaudati nel progetto.
I disciplinari di produzione che sono stati
definiti hanno tenuto conto delle specifiche
condizioni dell'allevamento delle capre
Girgentane in Sicilia, caratterizzati da ridotta
consistenza numerica e poche strutture di
trasformazione.
Il rilievo costante dei parametri sensibili di
caseificazione (attraverso una specifica
scheda di rilievo) è utile nel ricercare le
condizioni di ripetibilità e di riduzione della
variabilità. Una scelta tecnologica importante ha riguardato l'eventuale pastorizzazione/termizzazione del latte.
L'organizzazione della struttura di trasformazione presente a Campobello di Licata
prevedeva l'acquisto del latte di capra
Girgentana da diversi produttori dell'area
agrigentina con cadenza periodica, fatto che
spesso incide sulla qualità del latte dal punto
di vista microbiologico (valori elevati ci CBT
SCC).
I parametri di caseificazione sensibili
considerati sono i seguenti:
Latte crudo o termizzato.
Tipologia di fermenti e T di inoculazione.
Caglio e T di coagulazione.
Tempo di presa e di rassodamento.
Rottura del coagulo.
Formatura.
Stufatura (rivoltamenti, T e acidificazione).
Curve di acidificazione nelle prime 24 ore
Salatura.
Stagionatura (T e UR dei locali).
Dalla analisi delle schede di rilievo si evince
come i parametri relativi alla produzione dal
latte fino alla salatura sono di facile
misurazione e ripetibilità. Infatti si sono
utilizzati strumenti semplici di rilevazione/misurazione quali pHmetro, termo69
metro e acidimetro per l'SH° 50. Si sono
rilevati i tempi di lavorazione di tutte le
singole fasi. Problematiche si sono riscontrate nella misurazione dei parametri relativi
ai locali di stagionatura (T e UR) a causa della
mancanza di strumenti di rilevamento elettronico e di tracciabilità nelle 24 ore e perché
non sempre tali condizioni risultavano
ottimali per l'idonea stagionatura di alcuni
formaggi. L'assenza di idonee condizioni di T
e UR nei locali di stagionatura non consente
lo sviluppo di particolari muffe e il mantenimento di una struttura del formaggio
morbida.
In conclusione, le attività svolte hanno
comportato una condivisione e un confronto
con gli operatori delle strutture di trasformazione coinvolte. La variabilità delle
tipologie di formaggi è stata stimata in un
range limitato e gli stessi hanno avuto una
buona accoglienza nei diversi gruppi di
assaggiatori.
I formaggi collaudati possono rappresentare
un modello di riferimento per tutte quelle
70
strutture di trasformazione che possono nascere nei prossimi anni.
La scarsa produzione di formaggi caprini in
Sicilia e l'esempio dei formaggi caprini
francesi confermano le enormi potenzialità
dei formaggi prodotti con latte di sola
Girgentana per conquistare nuove fette di
mercato.
Infatti sono ascrivibili ai formaggi prodotti da
latte di sola Girgentana le seguenti caratteristiche e peculiarità:
alto valore dietetico legato alla digeribilità dei grassi;
valore antiallergico, (caseine e βlattoglobulina);
aroma delicato per la minore concentrazione (di tipo genetico) di acidi
capronico e caprilico.
Pertanto, i formaggi certificati disolaGirgentana potranno contribuire a rendere
economicamente vantaggioso l'allevamento
e costituire la base per il rilancio della razza
Girgentana.
Definizione e stesura di disciplinari di produzione
di prodotti tipici “disolaGirgentana”
Di seguito si riportano i disciplinari di produzione dei prodotti lattiero-caseari disolaGirgentana.
Fig. 9.1 - Disciplinari di produzione dei prodotti “disolaGirgentana”
71
9.1 Fiorita di Capra Girgentana
Formaggio ottenuto da latte disolaGirgentana.
La forma è cilindrica o quadrata con un peso
di circa 400 grammi e presenta una caratteristica muffa bianca sulla parte esterna,
dovuta all'inoculo di Penicillium Candidum.
Per aspetti igienico-sanitari, il latte, proveniente da tanti piccoli produttori, viene sottoposto a pastorizzazione e successiva rivitalizzazione, con l'introduzione di fermenti
termofili. Si utilizza un caglio liquido di vitello
che si introduce a circa 38 °C. Dopo 30
minuti, completata la coagulazione, si procede alla rottura con lira o spino in maniera
soffice e delicata, fino a rompere la cagliata
in maniera uniforme alle dimensioni di una
noce. La cagliata viene messa nelle fuscelle
che passano in fase di stufatura per consentire lo sgrondo e l'attivazione dei processi
di acidificazione. Iniziano in questa fase i
rivoltamenti delle forme. Segue la fase di
salamoia per un paio di ore, per poi andare in
72
sala di stagionatura per circa 30 giorni a
temperatura e umidità controllata.
Si utilizza come formaggio da tavola; ottimo
per aperitivi, soprattutto se accompagnato
da miele e vini bianchi.
9.2 Semistagionato di capra Girgentana
Formaggio ottenuto da latte disolaGirgentana.
La forma è cilindrica con un peso variabile da
1 a 3 Kg. Per aspetti igienico-sanitari, il latte
viene sottoposto a pastorizzazione e successiva rivitalizzazione, con l'introduzione di
fermenti termofili. Si utilizza un caglio in
pasta di agnello che si aggiunge a circa 38 °C.
Completata la coaugulazione, si procede alla
rottura della cagliata in maniera uniforme a
livello di chicco di riso. La cagliata viene
messa nelle fuscelle che passano a stufare a
temperatura di circa 40 °C. Si iniziano i
rivoltamenti dopo i quali segue la fase di
salamoia per un tempo di 6-7 ore/Kg. Viene
effettuata almeno una cappatura con olio di
Definizione e stesura di disciplinari di produzione
di prodotti tipici “disolaGirgentana”
oliva. Il formaggio può essere consumato
dopo 30 giorni per le fome piccole, e dopo 60
giorni per le altre forme. Le forme di
formaggio vengono poste a maturare in celle
di stagionatura a temperatura e umidità
controllata. Si utilizza come formaggio da
tavola; si può accompagnare con rossi
strutturati.
9.3 Fresco di capra Girgentana
Formaggio ottenuto da latte disolaGirgentana.
La forma è cilindrica o quadrata, con un peso
variabile da 400 grammi a 1 kg e dalla pasta
compatta. Per aspetti igienico-sanitari, il
latte viene sottoposto a pastorizzazione e
successiva rivitalizzazione, con l'introduzione di fermenti termofili. Il caglio utilizzato
è quello in pasta di agnello e/o di vitello a
seconda dell'intensità dell'aroma che si
vuole ottenere. In questo caso si è deciso di
utilizzare il caglio in pasta di vitello che si
aggiunge a circa 38 °C. Completata la
coaugulazione, si procede alla rottura della
cagliata in maniera uniforme a livello di
chicco di riso. La cagliata viene messa nelle
fuscelle che passano a stufare a temperatura
di circa 40 °C. Al fine di ampliare la gamma
dei prodotti offerti, in fase di formatura, si
possono aggiungere prodotti aromatizzanti
quali olive e peperoncino. Si iniziano i
rivoltamenti per poi procedere alla salatura
in salamoia. Il formaggio va al consumo dopo
pochi giorni dalla produzione.
Si utilizza come formaggio da tavola; ottimo
per aperitivi e antipasti, accompagnato con
salumi.
9.4 Robiola di capra Girgentana
Formaggio ottenuto da latte disolaGirgentana caratterizzato da un gusto
delicato e acidulo. La realizzazione è particolare e del tutto diversa rispetto ai formaggi
a coagulazione presamica. Per aspetti
igienico-sanitari, il latte viene sottoposto a
pastorizzazione e successiva rivitalizzazione,
73
con l'introduzione di fermenti mesofili. Si
utilizza solo 1 ml di caglio liquido di vitello
per 100 litri di latte, in quanto viene sfruttato
il principio della coagulazione acida.
La coaugulazione, in questo caso, avviene
lentamente in circa 10-16 ore a seconda
della temperatura ambientale. Il coaugulo
viene raccolto e disposto su dei teli ad
asciugare per 24-48 ore a temperatura di 4
°C. Il coagulo lasciato ad asciugare nel telo
verrà impastato a mezzo di impastatrice o
passa ricotta, con aggiunta di panna fresca
(gr 50/kg 1 di coagulo) e sale (gr 1/kg di
coagulo); successivamente viene posto nelle
apposite vaschette.
L'elevata umidità predispone il prodotto ad
una vita breve di pochi giorni. Il prodotto va
conservato in frigo alla temperatura di 4°C.
Data la soffice consistenza, si presta in maniera ottimale ad essere spalmato.
74
9.5 Il marchio “disolaGirgentana”
Al fine di incrementare il valore del paniere
di prodotti “disolaGirgentana” e, dunque, la
competitività del settore, è stato realizzato il
marchio “disolaGirgentana” che identifica,
in modo univoco, i prodotti, differenziandoli
al contempo da quelli concorrenti.
I valori cui si è deciso di puntare per la
definizione del marchio sono essenzialmente riconducibili all'unicità e alla rintracciabilità delle produzioni, come chiaramente
espresso dall'immagine stilizzata della Capra
Girgentana e dal logo “disolaGirgentana”,
nonché alla sostenibilità dei prodotti, richiamata dai colori che evocano la natura e il
rispetto per l'ambiente.
In altri termini, si è voluto valorizzare il legame “prodotto-territorio”, tramite il richiamo esplicito alla Capra Girgentana,
risorsa genetica specifica del territorio, che
costituisce l'essenza stessa del prodotto.
Il marchio è diretto principalmente a un
consumatore qualificato, critico e respon-
Definizione e stesura di disciplinari di produzione
di prodotti tipici “disolaGirgentana”
sabile, particolarmente sensibile alla qualità,
rintracciabilità e tracciabilità, che può
diventare anche leader d'opinione e trasmettere informazioni sul prodotto, avviando
una viralità spontanea.
Fig. 9.2 - Prodotti lattiero-caseari “disolaGirgentana”
marchio “disolaGirgentana” costituisce
dunque un'ulteriore innovazione trasferita
agli operatori del settore. Esso, nel lungo
periodo, se utilizzato nell'ambito di adeguate politiche di marketing, consentirà ai
produttori di sviluppare una solida immagine di marca nel mercato di riferimento,
di diventare interlocutori privilegiati del
retail, e di uscire dunque da una logica di
mercato day by day.
Fig. 9.3 - Il marchio “disolaGirgentana”
Essendo il segno tangibile della tracciabilità,
della rintracciabilità e, in ultima analisi, della
sicurezza e della qualità dei prodotti, il
75
BIBLIOGRAFIA
Bibliografia
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