STUDIO ELETTROFORETICO DI UNA VARIANTE αS2 CASEINA NEL LATTE OVINO
ELECTROPHORETIC STUDY OF AN αS2 CASEIN VARIANT IN SHEEP MILK.
Di Luccia1 A., Bramante2 G., Caroli3 A., Pieragostini2 E.
1 Dipartimento Produzione Animale- Bari, Italy.
2 Dipartimento PROGESA - Bari, Italy .
3 Dipartimento SBA - Bari, Italy.
Abstract.
The importance of milk protein genetic polymorphism is well known, mainly for the effects on milk
technological quality. Several studies were developed in cattle and goat, while the ovine milk protein
polymorphism has been less extensively investigated. A first screening was performed by isoelectrofocusing in
Gentile di Puglia sheep. Variations in the αs2-casein fraction were found, namely three different phenotypes
supposedly controlled by two codominant alleles (A and B), based on the presence of HW equilibrium. The BB
phenotypes exhibiting a more basic couple of the main αs2 bands with respect to the AA phenotype, a titration
curve was carried out aiming to check a lost of negative charge  due to an acid (aspartic or glutamic acid) to
neutral amino acid substitution  or a gain of positive charge by neutral to basic amino acid (arginine or histidine
or lysine) substitution. The results suggest that αs2-A differs from αs2-B because of the replacement of a neutral
amino acid by a basic one which seems to be hystidine on the basis of the comparison between the theoretical
curves calculated for the ovine αs2-casein and obtained by adding an His to the deduced amino acid sequence of
the αs2-cn mRNA.
Key words: sheep milk, casein fractions, casein polymorphism, CSN1S2 variants, electrophoresis.
Introduzione
In un precedente lavoro(Chessa et al., 2002), analizzando il latte della razza ovina Gentile di Puglia, abbiamo
messo in evidenza la presenza di polimorfismo a carico della frazione αs2-caseina (CSN1S2) ed in particolare
sono stati evidenziati tre fenotipi che, sulla base della verifica dell’equilibrio di Hardy-Weinberg, sembrano il
risultato della presenza di due alleli codominanti (A e B) al locus CSN1S2. È stata registrata una frequenza del
28% per la variante B che allo stato di omozigosi presenta un fenotipo IEF con una coppia di bande più basiche
di quelle esibite dall'omozigote AA. Questo diverso comportamento elettroforetico può derivare dalla perdita di
una carica negativa a seguito di una sostituzione di un amminoacido acido con un aminoacido neutro o viceversa
dal guadagno di una carica positiva come conseguenza della sostiuzione di un aminoacido neutro con uno
basico.
Allo scopo di rispondere a questo primo interrogativo, in attesa delle analisi strutturali che consentano di
delucidare la sequenza proteica della variante, in questo lavoro è stato effettuato uno studio elettroforetico
mediante curve di titolazione delle caseine intere contenenti le due varianti CSN1S2 A e B allo stato omozigote
ed eterozigote.
Materiali e Metodi
La focalizzazione isoelettrica della caseina intera ovina, con i tre genotipi s2 caseina, è stata eseguita secondo la
procedura di Erhardt et al. (1998) modificata da Chessa et al. (2002).
Le curve di titolazione sono state svolte secondo la procedura di Righetti et al. (1979). Il campione di caseina
intera ovina è stato disciolto in urea 8 M e 5% di 2-mercaptoetanolo ad una concentrazione finale del 2% (p/v).
La curva di titolazione teorica è stata calcolata mediante l’equazione di Moore (1985):
Q=Σ
negative charges
1+10 -(pH-pKa)
+ Σ
positive charges
1+10 +(pH-pKa)
Risultati e Discussione
In figura 1 è mostrata la focalizzazione isoelettrica dei
campioni di caseina intera ovina relativi ai fenotipi αs2 AA,
AB and BB. Il fenotipo BB mostra due componenti principali
più basici dell’αs2-Cn rispetto al fenotipo AA. Come già detto
in premessa, questo fenomeno può essere dovuto ad una
perdita di carica negativa per effetto di una sostituzione di un
amminoacido acido (acido aspartico o glutamico ) con uno
neutro, o a un guadagno di carica positiva per effetto della
sostituzione di un amminoacido neutro con uno basico
(arginina o istidina o lisina).
I risultati dell'elettroforesi bidimensionale effettuata allo
scopo di ottenere le curve di titolazione da cui valutare quale
delle due possibili sostituzioni sia avvenuta, sono
rappresentati in figura 2. Detta figura mostra la curva di
titolazione della caseina intera ovina contenente l’eterozigote
AB dell’αs2-Cn. Nella porzione del gel con pH al di sotto del
punto isoelettrico si osservano tre curve, una più veloce e una
più intensa per effetto della comigrazione delle curve β e αs1
caseina a pH acido mentre le altre due, che rappresentano la
frazione αs2, mostrano una differente mobilità. La più lenta
delle due esibisce un punto isoelettrico più basico che la
identifica come αs2-Cn B. Le due curve αs2-Cn A e B si
uniscono intorno a pH 7 muovendosi come una singola curva
nella porzione alcalina del gel.
Fig.1. Focalizzazione isoelettrica
dei campioni di caseina intera
ovina relativi ai fenotipi αs2
AA, AB e BB.
+
Fig.2. Curve di titolazione di caseina intera di un soggetto αs2 AB.
−
αs
Punto isoelettrico delle frazioni caseiniche
β1+β
β2
β+α
αs1
αs2 A
αs2 B
Punto di unione delle curve αs2
3.0
6.0
Valori approssimativi di pH
9.0
+
Questo fenomeno si spiega considerando che l’His ha un pKa = 6 e che dopo tale valore di pH la carica positiva
dell’His viene titolata (cioè neutralizata). Infatti, dalla determinazione delle curve teoriche mediante l’equazione
di Moore (1985), aggiungendo un residuo di His alla sequenza amino acidica dedotta dall’mRNA dell’αs2 -Cn
(Boisnard & Petrissant, 1985), si ottengono due curve simili come mostrato in figura 3.
L’analisi bidimensionale delle curve di titolazione suggerisce che l’αs2 A differisce dalla B per una sostituzione
di un residuo amminoacidico neutro con uno basico. Questa ipotesi è consistente con il differente
comportamento elettroforetico dei due fenotipi della frazione caseinica ovina αs2 mostrato in figura 1.
Figura 3. Rappresentazione delle curve di titolazione teoriche ottenute dalla sostituzione di un
residuo di His (curva H) con un amminoacido neutro (curva N).
Bibliografia
Chessa S., Falcone M.G., Dario C., Caroli A., Pieragostini E. Milk protein variability in "Gentile di Puglia
sheep": A screening by isoelectrofocusing. Proc. X Convegno Fe.Me.S.P.Rum. 22-24 settembre 2002 Tunisi
(Tunisia), 66-67.
Erhardt G., Juszczak J., Panicke L., Krick-saleck H. (1998) - Genetic polymorphism of milk proteins in Polish
Red Cattle: a new genetic variant of β-lactoglobulin. J. Anim. Breed. Genet. 115: 63-71.
Boisnard M, Petrissant G (1985) Complete sequence of ovine alpha s2-casein messenger RNA. Biochimie
67(9):1043-1051.
Righetti PG, Krishnamoorthy F, Lapoumeroulie C, Labie D. (1979) Titration curves of polypeptide chains by
combined isoelectric focusing-electrophoresis in 8M urea. J. Chromatogr. 177(2): 219-225.
Moore D.S.(1985) Amino acid and peptide net charges: a simple calcunational procedure. Biochemical
Education, 13: 10-11.