EMATOLOGIA VETERINARIA DI BASE
CON PARTICOLARE RIFERIMENTO AGLI EMOPARASSITI.
seminario organizzato nell'ambito del corso di “Diagnostica cito-istologica veterinaria”
a.a. 2004-2005
Udine, Martedì 13 settembre 2005
Tecniche ematologiche di
base
Stefano Comazzi, DVM, PhD, dipl ECVCP
DIPAV, Università di Milano
Organizzatore:
dr. Ernesto Pascotto
docente a contratto presso
Dipartimento di Scienze Animali
sez. di Biologia e Patologia Animale
facoltà di Medicina Veterinaria dell'Università di Udine
Relatore invitato:
dr. Stefano Comazzi
ricercatore presso
Dipartimento di Patologia Animale, Igiene
e Sanità Pubblica Veterinaria
facoltà di Medicina Veterinaria dell'Università di Milano.
Esame emocromocitometrico
• Valuta la componente cellulare del
sangue, (eritrociti, leucociti e piastrine) ed
è propedeutico a tutti gli altri esami di
laboratorio
• Dà indicazioni non solo sul numero delle
cellule ma anche sulle loro caratteristiche
morfologiche e sul loro contenuto cellulare
Programma
 Tecniche di base in ematologia, utilizzo di
metodiche automatizzate e tecniche manuali
Valutazione delle anemie e delle alterazioni
dell’eritrogramma
Valutazione delle alterazioni (quantitative e
morfologiche) del leucogramma
Principi di base sui cicli dei parassiti identificabili
nel sangue
Principali emoparassiti
Visione di vetrini di emoparassiti
Esame emocromocitometrico
• Si compone classicamente di parametri
per la valutazione dell’eritrogramma
(conta, ematocrito, emoglobina, costanti
eritrocitarie, RDW), del leucogramma
(conta e formula leucocitaria) e delle
piastrine (conta, piastrinocrito, MPV,
PDW)
Esame emocromocitometrico
• Si può eseguire con metodiche manuali
(camera di Burker) o, più spesso,
automatizzate mediante l’utilizzo di
contaglobuli automatizzati con tecniche ad
impedenza o laser
• Viene sempre integrato mediante la
valutazione microscopica delle cellule su
striscio colorato.
Esame emocromocitometrico
• Può essere utile in parassitologia per
evidenziare:
– Malattie emolitiche sostenute da protozoi (babesiosi,
malaria, tripanosomiasi) o micoplasmi (m.haemofelis)
– Massive infestazioni da parassiti ematofagi
(haemoncus, tricuridi, ectoparassiti)
– Parassiti in grado di indurre aplasia midollare
(Leishmania, Ehrlichiosi)
– Malattie parassitarie in sedi differenti in grado di dare
eosinofilia (verminosi polmonari, filariosi)
– Parassiti ematici (microfilarie, protozoi, micoplasmi,
riccketsie)
Prelievo di sangue: tecnica e uso
anticoagulanti
CAVALLO
Vena giugulare
16-19
BOVINO
Vena giugulare o coccigea
16-19
PICCOLI RUMINANTI
Vena giugulare
18-20
MAIALE
Vena cava anteriore
20
CANE
Cefalica, giugulare o safena
20-22
GATTO
Giugulare, cefalica o femorale
22-25
RATTO e TOPO
Plesso orbitale
microprovetta
An ticoa gu la n ti
S ANGUE INTERO
CON
ANTICOAGULANTE
E MOCROMOCITOME TRICO
PROVE DI COAGULAZIONE
S ODIO
CITRATO
E DTA
S ALI d i
E PARINA
An ticoa gu la n ti
EDTA (Na 2 , K3 )
Mecca n is m o d ’a zion e: ch ela n t e
ir r ever s ib ile d el Ca ++
In d ica zion i:
•e m o c ro m o c it o m e t ric o ,
•Ide ale pe r la m o rfo lo gia c e llu lare
Con t r oin d ica zion i:
c alc io , fe rro , ram e , ALP, am ilas i,
Na +/ K+, t e s t di c o agu laz io n e
An ticoa gu la n ti
S ALI di EPARINA
(Lit io, a m m on io, s od io, p ot a s s io)
Mecca n is m o d ’a zion e: a t t iva An t it r om b in a III,
in ib is ce fa t t or i d ella coa gu la zion e
In d ica zion i:
•e m o c ro m o c it o m e t ric o ,
•Plas m a pe r bio c h im ic a c lin ic a
Con t r oin d ica zion i:
Co n t a pias t rin ic a, m o rfo lo gia c e llu lare
t e s t di c o agu laz io n e , Na +/ K+
An ticoa gu la n ti
S ODIO
CITRATO
Mecca n is m o d ’a zion e: ch ela
r ever s ib ilm en t e il Ca ++
In d ica zion i:
• PLAS MA: TES T DI COAGULAZIONE
Ra p p or t o 1 :9 con s a n gu e
S ANGUE INTERO
S ENZA
ANTICOAGULANTE
Pr ovet t e vu ot e o
con gel
s ep a r a t or e
Cen t r ifu ga zion e
S IERO
BIOCHIMICA CLINICA
E LE TTROFORE S I PROTE INE
VALUTAZIONE ERITROGRAMMA
Metodiche automatizzate: sistemi ad impedenza
Elettrodo interno
Elettrodo esterno
Capillare
Sistema di misurazione impedenza
Orifizio per
aspirazione
Soluzione elettrolitica
Conta eritrociti, ematocrito, emoglobina, MCV,
MCH, MCHC, RDW
VALUTAZIONE DEL LEUCOGRAMMA
Metodiche automatizzate: sistemi ad impedenza
Elettrodo interno
Elettrodo esterno
Capillare
Sistema di misurazione impedenza
Orifizio per
aspirazione
Soluzione elettrolitica
Conta di cellule nucleate
CONTA NUMERO PIASTRINE
Metodiche automatizzate: sistemi ad impedenza
piastrine
Elettrodo interno
Elettrodo esterno
Capillare
Sistema di misurazione
impedenza
Orifizio per
aspirazione
Aggregati piastrinici
Soluzione elettrolitica
Aggregati piastrinici
Conta piastrinica, MPV, PCT, RDW
S TRIS CIO E MATICO
Pos s ib ilm en t e s en za
a n t icoa gu la n t e
Fis s a t o velocem en t e
a ll’a r ia
Color a t o
Ris cia cqu a t o
Mon t a t o con vet r in o
cop r iogget t o
c o lo raz io n e t ipo Ro m an o ws k y
(eos in a e b lu d i m et ilen e)
(es . Wr igh t , Ma y Gr ü n wa ld -Giem s a ,
Ha em a color )
Allestimento dello striscio di
sangue:
Angolo = 30-40 gradi
Goccia di sangue
Colorazioni ematologiche
Metodo di Wright: May Grunwald-Giemsa (secondo Ferrata-Storti)
1) fissare il vetrino all’aria
2) colorare con May Grunwald puro per 1 min
3) versare sui vetrini una quantità di acqua uguale a quella di colorante
e lasciare per 3 min
4) rovesciare via il liquido e mettere Giemsa (1:20 in acqua) per 12 min
5) sciacquare in acqua e asciugare all’aria
Metodi modificati
1) fissare vetrino all’aria
2) Colorare con May Grunwald puro per 6 min
3) Sciacquare in acqua
4) Colorare in Giemsa diluito 1:20 in acqua per 40 min
5) Sciacquare in acqua e asciugare all’aria
Metodi rapidi:
Hemacolor, Diff-Quick, Dip-Quick, ecc
AL MICROS COPIO
•Tu t t e le a r ee d ello s t r is cio (cen t r a li e
p er ifer ich e)
•in gr a n d im en t o p iù p iccolo p er
os s er va r e:
qu a lit à d ello s t r is cio
la d is t r ib u zion e d elle cellu le
•a u m en t a r e gr a d u a lm en t e, fin o a l
1 0 0 0 X (a d im m er s ion e):
os s er va r e la m or fologia d i
t u t t e le cla s s i cellu la r i
legger e la for m u la
leu cocit a r ia
Valutazione della formula
leucocitaria
• La formula leucocitaria è la conta in
percentuale delle singole classi di leucociti
ematici
• Si effettua contando almeno 100 leucociti
• Le singole percentuali, moltiplicate per il
numero di leucociti/mmc danno il numero
assoluto di ogni singola classe di leucociti
per mmc
FORMULA LE UCOCITARIA
cellule/l
%
valori normali
valori normali
neutrofili
84 %
35 - 75
10,5
2,5 - 12,5
eosinofili
2%
2 - 12
0,25
0 - 1,5
linfociti
13 %
20 - 55
1,63
1,5 - 7,0
monociti
2%
1-4
0,13
0 - 0,85
STIMA PIASTRINICA
Stima piastrinica adeguata
(cane 8-29 plt per campo 100X
gatto 10-29 plt per campo 100X)
Stima piastrinica non adeguata
bassa
elevata
CONTA STIMATA DI PIASTRINE
Diametro 0.18
0.22 mm (FN 18)
0.20
22)
20)
plt x 23600
15800
19100
14xx23.600
911
15.800==212.400
19.100
221.200
210.100
Ingrandimento 100x
AGGREGATI PIASTRINICI
AGGRE GATI PIAS TRINICI
Altre tecniche ematologiche:
colorazione reticolociti
• I reticolociti sono eritrociti immaturi che mantengono
residui di RER, colorabile ed evidenziabile con
particolari tecniche
• Nel cane e nel gatto (no in cavallo e raramente in
ruminanti) un aumento della % di reticolociti è
indicazione di rigenerazione midollare
• In parassitologia possono essere utili per
confermare malattie emolitiche (babesiosi), ma…
attenzione!
RETICOLOCITI
E r it r ocit i im m a t u r i, NON n u clea t i con RNA cit op la s m a t ico evid en zia b ile
Color a zion i Rom a n ows k y:
p olicr om a t ofili (POLICROMAS IA)
Color a zion i b lu b r illa n t e d i cr es ile,
n u ovo b lu d i m et ilen e: r et icolocit i
a ggr ega t i e p u n t a t i
ca n e
ga t t o
Altre tecniche ematologiche:
striscio del buffy coat
• Il buffy coat è un sottile strato che si forma, dopo
centrifugazione del sangue, nell’interfaccia tra
plasma e impaccato di GR e contenente la
maggior parte dei leucociti e delle piastrine, che
• Si evidenzia come uno strato biancastro tanto
più spesso quanti più leucociti ci sono e
maggiormente visibile utilizzando capillari da
microematocrito
• In parassitologia l’allestimento e l’esame
microscopico di strisci di BC è utile per
evidenziare parassiti dei leucociti, degli eritrociti
o liberi (microfilarie)
BUFFY COAT in ca p illa r e d a m icr oem a t ocr it o
E r it r ocit i p iù “legger i” (b a b es ia )
+ “giova n i”
+ fr equ en t i h em ob a r t on ella
+ “vecch i”
S TRIS CIO BUFFY COAT (leu cocit i N.C., p a r a s s it i)
E s a m in a r e N° m a ggior e d i leu cocit i
Pa r a s s it i in t r a cellu la r i in leu cocit i
(E h r lich ia ) er it r ocit i (Ba b es ia ) o lib er i
(m icr ofila r ie)
ARTEFATTI ED ERRORI PREANALITICI
Con s er va zion e/ Tr a s p or to
S TABILITA’ DE L CAMPIONE
Id ea le: p r oces s a zion e p r im a p os s ib ile
S ANGUE INTERO
Con cen t r a zion e
eritrociti, leu cociti:
a lcu n e or e (2 5 C°)
2 4 h (4 C°)
p ia s trin e :
5 h (2 5 C°)
2 4 h (4 C°)
Mor fologia
E VITARE :
•Ca lor e ecces s ivo
•Con gela m en t o
•Da n n i m ecca n ici
er it r ocit i, p ia s t r in e:
m a ggior s t a b ilit à
leu cocit i:
s t ris c iare s u bit o
(s en za a n t icoa gu la n t e)
lis i cellu la r e,
va cu olizza zion i,
ca r iolis i, ca r ior es s i
ARTEFATTI: CONSERVAZIONE
ARTEFATTI: CAMPIONI MAL CONSERVATI
Picnosi (PMN)
Cellule
rotte
ALTRI ARTEFATTI
Scaglia di cheratina
(da mani operatore)
Granulo di polvere
sovrapposto
Precipitato di colorante
Errori preanalitici comuni
• errato anticoagulante:
EDTA per calcemia
Sodio eparina per Na/K
plasma per elettroforesi
coagulazione non in Na citrato
• errato rapporto sangue/anticoagulante
• campione mal miscelato
campione “shakerato”
campione non miscelato subito
• campione mal conservato temperatura ambiente
sangue intero congelato
• errato prelievo
aghi troppo piccoli
eccessiva pressione negativa (gatto)
• campione non centrifugato es. glucosio, lattati, coagulazione
IL CAMPIONE IDE ALE
L’id en t ifica zion e cor r et t a
in for m a zion i n eces s a r ie p er es egu ir e i t es t
il p a zien t e a d igiu n o (p er p r ove m et a b olich e)
qu a n t it à s u fficien t e
r a p p or t o s a n gu e/ a n t icoa gu la n t e è cor r et t o
a n t icoa gu la n t e id on eo a gli es a m i r ich ies t i
 n on coa gu la t o (p er es a m e em ocr om ocit om et r ico e t es t d i coa gu la zion e)
n on em olit ico (s a lvo s os p et t o d i em olis i in vivo)
con t en u t o in con t en it or e id on eo/ in t egr o
con s er va t o a t em p er a t u r a cor r et t a
n on s ot t op os t o a r ip et u t i con gela m en t i/ s con gela m en t i
IL RE FE RTO IDE ALE