4/10/2014
Brevetto EP2480677A1 - produzione semi-stabile di vettori lentivirali - Google Brevetti
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Produzione semi-stabile di vettori lentivirali
EP 2480677 A1
(testo da WO2012028680A1 )
ESTRATTO
La presente invenzione fornisce una nuova linea cellulare di confezionamento
semi-stabile e un metodo per produrre vettori lentivirali (LV), utilizzando la linea
cellulare di packaging semi-stabile. Nuovi metodi e linee cellulari di
confezionamento dell'invenzione sono generati utilizzando un sistema ibrido
Baculo-AAV per l'espressione stabile di proteine ​
lentivirali strutturali e
normative, tale sistema comprendente una backbone baculoviral contenente
una cassetta di integrazione fiancheggiato da ITR di AAV, in combinazione con
un rappresentante plasmide codificante proteina. Questo sistema permette di
ottenere una stabile integrazione delle HIV-1 proteine ​
strutturali e regolamentari
gag / pol e rev. Il sistema permette di ottenere una linea cellulare comprese le
proteine ​
virali strutturali e normative gag / pol e riv, da utilizzare per una
produzione semi-stabile LV.
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Discussioni su this Applicazione
EP2480677 A1
Richiesta
EP20110749849
1 ago 2012
1 set 2011
2 set 2010
Pubblicato also venire
CA2809447A1 , CN103080322A ,
US20130164840 , WO2012028680A1
Inventori
Chiara Bovolenta , Anna Stornaiuolo , Paolo
Rizzardi , Fulvio Mavilio
Candidato
Molmed SpA
Esporta CITAZIONE
BiBTeX , EndNote , RefMan
Citazioni da diverse Brevetti (1), Classificazioni (11), Eventi Legali (4)
Link esterni: Espacenet , Registro dei Brevetti Europei
RIVENDICAZIONI (il testo OCR potrebbe CONTENERE ERRORI)
Produzione semi-stabile di vettori lentivirali
Reclami
Campo dell'invenzione
I. Un sistema per l'espressione stabile di proteine ​
strutturali e regolamentari
La presente invenzione riguarda la produzione di vettori lentivirali (LV) per la
lentivirali costituiti da:
terapia genica. Più in particolare, l'invenzione si riferisce a linee cellulari stabili
i. Un vettore ibrido comprendente dorsale baculoviral contenente una
semi-imballaggio lentivirali e ai metodi di fabbricazione linee cellulari di
cassetta di integrazione fiancheggiato da ITR di AAV cui due cassette di
confezionamento utilizzando un virus ibrido Baculo adeno-associato (AAV)
espressione, in cui la prima cassetta di espressione codifica per lentivirale
vettore per l'integrazione stabile delle proteine ​
lentivirali strutturali e normative.
gag e pol geni e il secondo giro lentivirale e un marcatore di selezione e
Sfondo
ii. Un plasmide di espressione contenente il frame AAV Rep Open Reading
Dal momento che la prima volta LV fase I di sperimentazione clinica contro
(ORF) sotto il controllo di un promotore
l'AIDS nel 2001, 38 di fase l-II e due studi ll-lll fase sfruttando LV HIV-based
2 Un sistema secondo la rivendicazione 1 in cui i due cassette di
come veicoli di consegna del gene sono stati sottoposti a controllo di autorità;
espressione del vettore ibrido sono coda alla coda orientata e ognuno è
tre di loro sono ancora in fase di revisione. Il maggior numero di prove
guidato da un promotore costitutivo e un poli A
comprende malattie monogeniche, alcuni dei quali con grande incidenza, come
l'anemia β-talassemia di Cooley principali (4 studi). Cancro e malattie infettive,
soprattutto H IV-1 infezione, seguono. Comunemente, il numero di pazienti
3 Un sistema secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui il promotore è scelto da
CMV, CMV IE, PGK, SV40, eFlot, SFFV e RSV
arruolati in studi clinici l / ll fase è limitato, ma non che in fase III. Così linee
4 Un sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui il
cellulari di confezionamento stabile per 2 ° (LT -based) e 3 ° (base-SIN)
promotore è un promotore CMV IE 5 Un sistema secondo una qualsiasi
generazione di LV sono urgentemente necessari per far fronte LV grande
delle rivendicazioni precedenti in cui il marcatore di selezione viene
richiesta produzione su larga scala di studi di fase III spera raggiungibile in
selezionato da igromicina, kanamicina, neomicina, zeomycin gene della
futuro un numero maggiore. Produzione LV fondata su protocolli transitori è
resistenza
davvero poco pratico per la sicurezza globale applicazione undera, costo e
riproducibilità punto di vista.
6 Un sistema secondo la rivendicazione 5 in cui il marcatore di selezione è
igromicina gene di resistenza
Un numero crescente di evidenze indica che LV, i vettori virali integrazione più
recente sviluppo per la terapia genica, sono ampiamente applicabile per
7 Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui il
trasdurre cellule o terminalmente differenziate o in bicicletta, ideale per
marcatore di selezione viene clonato a valle di un sito interno ingresso
sostenere l'espressione del transgene a lungo termine e più sicuro di quanto
ribosoma (IRES)
inizialmente temuto. L'esperienza accumulata in Moloney virus della leucemia
murina (MoMLV) gamma-retrovirali vettori (YRV) negli ultimi due decenni hanno
guidato la rapida progressi sul sistema di distribuzione BT, il cui sviluppo origine
8 Sistema secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui la
proteina rep è Rep78
dalla necessità di superare l'incapacità dei retrovirus di trasdurre cellule non
9 Una linea cellulare di packaging lentivirali semi-stabile costituito da
immersione. In particolare, la generazione di vettori (SIN) trasferimento
cellule che esprimono stabilmente lentivirali pol gag e rev caratterizzata dal
autonomi inattivanti rende la prospettiva di un grande impiego di LV in studi
fatto che tali cellule contengono stabilmente integrato nel suo genoma
clinici umani più fattibili 1 disponibile l'espansione e l'ottimizzazione di un più
almeno una copia di una cassetta di integrazione affiancato da AAV ITR tra
efficiente processo di fabbricazione. Tuttavia, a differenza YRV, che può essere
cui due cassette di espressione, in cui il prima cassetta di espressione
prodotto da diverse linee cellulari umane e murine Confezioni disponibili in
codifica geni gag e pol lentivirali e il secondo giro lentivirali e un marcatore
commercio, LV sono attualmente ottenuti non solo per la ricerca-grado, ma
di selezione
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anche per GMP-grade, quasi esclusivamente mediante trasfezione transiente.
10 Una linea lentivirali semi-stabile cella di imballaggio secondo la
Questa tecnologia è costosa, difficile da standardizzare e scale-up e richiede
rivendicazione 9 in cui la cellula è una linea cellulare umana selezionata da
numerosi test di validazione a valle. Inoltre, il rischio di replica lentivirus
HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 o HeLa
competenti (RCL), eventualmente derivanti tramite ricombinazione tra sequenze
virali nel packaging e trasferimento costrutti vettoriali, è un evento raro, ma più
probabilmente durante transitori di produzione stabile.
Lo sviluppo di una linea cellulare di packaging stabile retrovirale-equivalente per
LV si è rivelato più lento e più difficile perché, come opposta alla gamma
retrovirus, l'espressione di proteine ​
lentivirali, come la env, proteasi, e alcune
proteine ​
accessorie è tossico per l'uomo cellule. Per superare questo problema
i geni accessori, presenti nelle primissime versioni di cellule packaging, sono
II. Una linea cellulare di packaging lentivirale semi-stabile, secondo una
qualsiasi delle rivendicazioni 9 o 10 in cui le due cassette di espressione
sono coda a coda orientata e ognuno è guidata da un promotore costitutivo
e un poli A
12 Una linea cellulare di confezionamento semi-stabile secondo una
qualsiasi delle rivendicazioni 9 o 11 in cui il promotore è scelto da CMV,
CMV IE, PGK, SV40, eFlot, SFFV e RSV
stati successivamente rimossi nelle ultime generazioni. SIV generazione prima
13 Una linea cellulare di confezionamento semi-stabile secondo la
e basati su HIV linee cellulari di confezionamento LV sono stati ottenuti sia da
rivendicazione 12, in cui il promotore è un promotore CMV IE.
scimmia Vero, o COS umano, HeLa e 293 cellule aderenti 2 "5 , progettato con
genomi lentivirus che trasportano alcune modifiche cruciali come la rimozione
14 Una linea cellulare di packaging semi-stabile, secondo una qualsiasi
del segnale di confezionamento. L' gpl20 env e la maggior parte dei geni
delle rivendicazioni da 9 a 13 in cui il marcatore di selezione è scelto tra
accessori erano di fatto mantenuto. La risultante titolo LV era molto basso 2 "5 ,
igromicina, kanamicina, neomicina, zeomycin gene della resistenza
e soprattutto la possibile applicazione di questi vettori è stata necessariamente
15 Una linea cellulare di confezionamento semi-stabile secondo la
limitata ai CD4 + cellule T anti-AIDS approcci di terapia genica. Più tardi, gpl20
rivendicazione 14, in cui il marcatore di selezione è igromicina gene di
env è stato sostituito con la glicoproteina derivato dal virus della stomatite
resistenza.
vescicolare (VSV-G) e tutti i geni accessori sono stati rimossi perché dimostrato
indispensabile per una produzione efficiente LV. Per evitare la tossicità anche
descritto per VSV-G, la sua espressione è stata condizionalmente indotta da
una varietà di diversi sistemi, come il Tet, ecdisone, Rev e la combinazione di
Tet e cumate 6 . Allo stesso modo, per ridurre l'effetto tossico della proteasi
16 Una linea cellulare di packaging semi-stabile, secondo una qualsiasi
delle rivendicazioni da 9 a 15 in cui marcatore di selezione viene clonato a
valle un sito di entrata del ribosoma interno (IRES).
17 metodo A per la produzione di vettori lentivirali comprendenti:
virale durante la selezione clonale, l'espressione condizionale del gene gag-pol
dal Tet e la combinazione di doxiciclina e cumate farmaci sono stati descritti 6 .
In tutti questi sistemi gag-pol, rev e env geni sono stati integrati mediante
trasfezione transiente di DNA plasmidico, seguita dalla selezione di droga e la
clonazione delle cellule.
Uno del problema cruciale per la realizzazione di una linea cellulare di
i. Coltura una linea cellulare di confezionamento semi-stabile secondo una
qualsiasi delle rivendicazioni da 9 a 16 ii. Inserimento nel semi-stabile linea
di cellule packging un gene env
iii. Inserimento nel semi-stabile linea cellulare packging un vettore di
trasferimento
packaging veramente stabile è la scelta dei migliori veicoli di consegna gene
18 Metodo secondo la rivendicazione 17, in cui il gene env è scelto da
virale. La maggior parte dei ricercatori integrati i geni gag-pol, rev e env
VSV-G env, M LV 4070 env, RD114 env, proteina chimerica busta RD114-
mediante trasfezione transiente di DNA plasmidico, seguita dalla selezione di
TR, chimerica proteina dell'involucro RD114-pro, baculovirus GP64 env o
droga e clonazione delle cellule 2 "9 . Questa tecnologia è nota a soffrire nel
GALV env o derivati di ciò
corso del tempo dal silenziamento genico e la perdita del gene 10 , che può
compromettere sia la stabilità a lungo termine del clone di confezionamento.
19 Metodo secondo la rivendicazione 17 o 18 in cui gene env è il gene che
codifica per la proteina chimerica busta RD114-TR
Veicoli di consegna gene alternativa sono stati resi noti in particolare in STAR
11 e nei GPRG-TL-20, più recentemente sviluppate 12 linee cellulari di
confezionamento dove le gag, pol, e geni giri sono stati integrati nelle cellule HEK293T da vettori MLV-navetta. Due copie
del gene ricodificato gag-pol sono stati stabilmente integrati in STAR, mentre tale informazione è disponibile per GPRGTL-20 12 . Per quanto opposta a STAR, dove il gene env sono state trasfettate, in GPRG-TL-20 tutti i geni virali rimanenti
sono state introdotte da SIN-MLV. Esistono diversi sistemi che permettono l'integrazione stabile del genoma straniera
nelle cellule ospiti. Palombo et al., 1998 13 divulgare un ibrido vettore baculovirus-AAV per l'integrazione specifica in
cellule ospiti. Tale vettore sembra essere molto efficace se include gene rep nello stesso ibrido baculovirus-AVV vettoriale.
Non vi è alcuna menzione in questo riferimento del costrutto della presente invenzione figuriamoci il suggerimento di
utilizzare questo tipo di sistema per la produzione di LV.
Negli ultimi quasi due decenni, diversi tentativi di generare sono stati fatti BT stabile linee cellulari di confezionamento.
Nonostante la diversa tecnologia divulgato, ad oggi nessuna di queste linee cellulari di confezionamento è impiegata negli
studi clinici o angoli ancora il mercato. Pertanto vi è la necessità di nuovi sistemi per la produzione su larga scala di LV
che sono efficaci in termini di capacità produttiva e sicuri, conveniente e riproducibile.
Sommario dell'invenzione
La presente invenzione si riferisce al campo della produzione di LV. Diversi studi clinici di terapia genica sono in corso
utilizzando LV come veicoli di consegna del gene. In tutti questi studi di produzione LV è ancora basato su protocolli
transitori. La presente invenzione fornisce una nuova strategia per generare una linea cellulare di imballaggio a base di
HIV-l. Tale strategia si basa sull'impiego di un vettore ibrido comprendente dorsale baculoviral contenente una cassetta di
integrazione fiancheggiato da AAV ripetizioni terminali invertite (è), il cosiddetto sistema ibrido Baculo-AAV, in
combinazione con un plasmide codificante una proteina rep. Questo sistema permette di ottenere una integrazione stabile
di HIV-1 proteine ​
strutturali e regolamentari gag / pol e rev. Il sistema della presente invenzione comprende a) un vettore
ibrido Baculo-AAV caratterizzata dal fatto di contenere due cassette di espressione, una codifica lentivirali geni gag e pol e
l'altra riv lentivirale e un marcatore di selezione, e b) un plasmide che codifica per una proteina rep . Il sistema proposto
rappresenta un modo nuovo e vantaggioso per fornire proteine ​
dell'HIV strutturali e regolamentari, al fine di stabile ed
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efficace ingegnerizzare le cellule ospiti con le proteine ​
lentivirali strutturali. Usando questo sistema, è stato ottenuto un
primo intermedio includendo solo proteine ​
dell'HIV strutturali e normative gag / pol e rev, da utilizzare per una produzione
semi-stabile LV, o come punto di partenza per ottenere 2 nd e 3 rd linee cellulari di imballaggio generazione, tra cui
facoltativamente la proteina regolatrice (Tat) e la proteina dell'involucro di interesse, così come le linee di cellule
produttore tra cui anche il vettore di trasferimento.
Il primo intermedio porta due copie del ricombinante Baculo-AAV imballaggio costrutto esprimere gli HIV-1 gag-pol e rev
geni in una configurazione tri-cistronic. Tale intermedio è stato chiamato PK-7 e viene denominata PK-7 negli esempi.
Integrazione del genoma di imballaggi Baculo-AAV vettore è stato facilitato dalla espressione transiente della proteina
AAV ep78 noto per essere necessario per un ITR-mediata AAV integrazione vettoriale 14 . Tale primo intermedio ha
mostrato di avere una stabilità genetica sorprendente per 1 anno di coltura che ha dimostrato la produzione in continuo di
LV funzionale dopo trasfezione transiente degli elementi genetici rimanenti. Inoltre, nessun fenomeno di silenziamento
sono stati osservati in tali cellule. Inoltre, mappando esattamente il sito di integrazione dei due vettori AAV confezione
tandem integrati in un non-codificante intergenica regione trascrizionalmente attiva, abbiamo fornito un argomento di
sicurezza contro la possibile attivazione di geni pericolosi il cui mRNA può essere incorporato nella LV e, alla fine , nelle
cellule bersaglio ospitante.
Il sistema di imballaggio sviluppato basato sull'uso di un ibrido Baculo-AAV vettore per l'espressione stabile di lentivirali
gag-pol e il contagiri è stato chiamato "MolPack". Il sistema di espressione utilizzato nella presente invenzione consente
vantaggiosamente introduzione stabile e sicuro di strutturale (gag / pol) e normativo (riv) proteine ​
di HIV, in un solo
trasfezione e clonazione rotondo. La produzione di LV attualmente impiegato negli studi clinici si basa ancora sulla
trasfezione transiente di tutte le proteine ​
necessarie. Al contrario, l'intermedio ottenuto con il sistema di espressione della
presente invenzione è stabile, non mostra fenomeni di silenziamento, consente di sviluppare una produzione semi-stabile
di LV con forti vantaggi dal punto di vista economico. Infatti, la produzione semi-stabile richiede un numero ridotto di
costrutti da trasfettate per ottenere il prodotto finale. Inoltre, si è anche notevolmente trovato che, utilizzando la produzione
semi-stabile della presente invenzione, solo un terzo della quantità di DNA impiegata nella produzione di trasfezione
transiente è sufficiente per ottenere LV avente titolo paragonabile a quella dei prodotti transitoriamente LV . Inoltre, il
numero ridotto di costrutti essere transfettate riduce la possibilità di eventi di ricombinazione con formazione di RCL,
rendendo così la produzione di particelle lentivirali sicuro. Pertanto, il sistema di espressione, la linea cellulare stabile semi
imballaggio ed il metodo di produzione della presente invenzione sono molto vantaggiosa rispetto a strumenti e metodi
attualmente applicati in studi clinici. Dichiarazioni dell'invenzione
Secondo un primo aspetto dell'invenzione viene fornito un sistema per l'espressione stabile di proteine ​
strutturali e
regolamentari lentivirali costituiti da:
i. Un vettore ibrido comprendente dorsale baculoviral contenente una cassetta di integrazione fiancheggiato da ITR di AAV
cui due cassette di espressione, in cui la prima cassetta di espressione codifica per lentivirale gag e pol geni e il secondo
giro lentivirale e un marcatore di selezione e
ii. Un plasmide di espressione contenente la AAV rep Open Reading Frame (ORF) sotto il controllo di un promotore.
Preferibilmente le due cassette di espressione del vettore ibrido sono coda-coda oriented e ognuno è guidato da un
promotore costitutivo e poli A, preferibilmente il promotore è scelto da CMV, CMV IE, PGK, SV40, eFlot SFFV e SV più
preferibilmente il promotore è un promotore CMV IE.
Preferibilmente il marcatore di selezione viene selezionato da igromicina, kanamicina, neomicina, zeomycin gene di
resistenza, più preferibilmente il marcatore di selezione è igromicina gene di resistenza.
Più preferibilmente il marcatore di selezione viene clonato a valle di un sito interno ingresso ribosoma (IRES). Secondo un
altro aspetto dell'invenzione, è prevista una linea semi-stabile cella imballaggio lentivirale costituito da cellule che
esprimono stabilmente lentivirale gag e pol riv caratterizzata dal fatto che tali cellule contengono stabilmente integrato nel
suo genoma almeno una copia di una cassetta di integrazione fiancheggiato da ITR AAV tra cui due cassette di
espressione, in cui la prima cassetta di espressione codifica per gag lentivirali e geni pol ed il secondo giro lentivirali e un
marcatore di selezione.
Preferibilmente la cella è una linea cellulare umana preferibilmente scelto tra HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671,
HT1080 o HeLa, più preferibilmente la linea cellulare è HEK293-T.
Preferibilmente le due cassette di espressione sono coda-coda oriented e ognuno è guidato da un promotore costitutivo e
un poli A; preferibilmente il promotore è scelto da CMV, CMV IE, PGK,
SV40, eFlot, SFFV e RSV, più preferibilmente il promotore costitutivo è un promotore CMV IE.
Preferibilmente il marcatore di selezione viene selezionato da igromicina, kanamicina, neomicina, zeomycin gene della
resistenza; più preferibilmente il marcatore di selezione è igromicina gene di resistenza. Più preferibilmente il marcatore di
selezione viene clonato a valle un IRES.
Preferibilmente la proteina rep AAV è scelto da Rep78 o Rep68. Più preferibilmente proteina rep è Rep78.
Secondo un altro aspetto viene fornito un metodo per la produzione di vettori lentivirali comprendenti: i. Coltura di una
linea semi-stabile cellulare di packaging lentivirali costituito da cellule che esprimono stabilmente lentivirali gag, pol e rev
caratterizzata dal fatto che tali cellule contiene, stabilmente integrato nel suo genoma, almeno una copia di una cassetta di
integrazione affiancato da ITR di AAV tra cui due cassette di espressione, in cui la prima cassetta di espressione codifica
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gag lentivirale e geni pol ed il secondo giro lentivirale e un marcatore di selezione
ii. Inserimento nel semi-stabile linea cellulare di packaging un gene env
iii. Inserimento nel semi-stabile linea cellulare di packaging un vettore di trasferimento
Preferibilmente le due cassette di espressione sono coda-coda oriented e ognuno è guidato da un promotore costitutivo e
un poli A; preferibilmente il promotore è scelto da CMV, CMV IE, PGK, SV40, eFlot, SFFV e RSV, più preferibilmente il
promotore costitutivo è un promotore CMV IE.
Preferibilmente il marcatore di selezione viene selezionato da igromicina, kanamicina, neomicina, zeomycin gene della
resistenza; più preferibilmente il marcatore di selezione è igromicina gene di resistenza. Più preferibilmente il marcatore di
selezione viene clonato a valle un IRES. Proteina Envelope può essere inserito in cellule ospiti con AAV vettore, vettore
retrovirale, l'integrazione stabile plasmide o ricombinazione omologa. Preferibilmente il gene env è inserito mediante
trasfezione transiente con un plasmide.
Preferibilmente il gene env è scelto da VSV-G env, MLV 4070 env, D114 env, proteina chimerica busta RD114-TR,
proteina chimerica busta RD114pro, baculovirus GP64 env o GALV env o suoi derivati, più preferibilmente il gene env è il
gene che codifica l'RD114-TR.
Preferibilmente il vettore di trasferimento è inserito con un vettore lentivirale SIN.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
Una descrizione dettagliata delle caratteristiche preferite e le forme di realizzazione dell'invenzione verrà ora descritta a
titolo di esempio non limitativo.
L'invenzione può essere messo in pratica da una persona esperta ordinaria nell'arte che impiegherà, se non diversamente
indicato, le tecniche convenzionali di chimica, biologia molecolare, microbiologia, DNA ricombinante e immunologia. Tutte
queste tecniche sono indicate e illustrate nella letteratura pubblicata. Vedere, per esempio, J. Sambrook, EF Fritsch, e T.
Maniatis 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Libri 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press;
Ausubel, FM et al. (1995 e periodiche integrazioni; attuali protocolli di biologia molecolare, ch 9, 13, e 16, John Wiley &
Sons, New York, NY.); Attuali protocolli in immunologia, ch. 12, John Wiley & Sons, New York, NY); B. Roe, J. Crabtree, e
A. Kahn, 1996 Isolamento e sequenziamento del DNA: tecniche essenziali, John Wiley & Sons; J. M. Polak e James O'D.
McGee, 1990 ibridazione in situ: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Redattore), 1984
oligonucleotidi di sintesi: A Practical Approach, Irl Press; e, DMJ Lilley e JE Dahlberg, 1992 Metodi di Enzimologia:
Struttura del DNA Parte A: Sintesi e analisi fisica dei metodi di DNA in Enzimologia, Academic Press. Tutte queste
pubblicazioni sono incorporate per riferimento.
Sistema ibrido Baculo-AAV La presente invenzione fornisce una nuova strategia per generare una linea cellulare di
imballaggio a base di HIV-l. Ottimizzazione del sistema di produzione di LV è una delle criticità che deve essere risolto per
lo sviluppo della medicina terapia genica basati su tecnologia LV. Nonostante il crescente numero di studi clinici che
utilizzano questa tecnologia, LV sono stil uced l prod, in tali studi, utilizzando protocolli di trasfezione transiente. In questo
modo, la produzione di LV è ancora molto costoso e insoddisfacente per maggior numero di pazienti. Per questo motivo,
sono stati fatti molti sforzi per sviluppare linee cellulari stabili di imballaggio per LV. Una delle questioni cruciali per lo
sviluppo di una linea cellulare di packaging lentivirali stabile è scegliere il veicolo giusto per le cellule ospiti ingegneria. In
molti casi, le cellule ospiti sono stati progettati usando plasmidi, ma, in questi casi, sono anche stati osservati fenomeni di
instabilità genomica e silenziamento genico. Vettori retrovirali sono stati utilizzati per integrare stabilmente gag / pol e rev
geni negli altri due casi. Nessuno della linea cellulare di packaging stabile sviluppato finora è stato impiegato in clinica. La
strategia della presente invenzione si basa sull'impiego di un sistema per l'espressione stabile di lentivirali proteine ​
virali
strutturali e regolamentari costituiti da un vettore ibrido comprendente una backbone baculoviral contenente una cassetta
di integrazione fiancheggiato da ITR di AAV cui due cassette di espressione, in cui la prima espressione cassette codifica
geni gag e pol lentivirali e il secondo giro lentivirali e un marcatore di selezione; insieme ad un plasmide di espressione
contenente la rep di AAV ORF sotto il controllo di un promotore. La presenza di spina dorsale baculoviral permette di
ospitare una cassetta grande e complessa integrazione tra cui due cassette di espressione che codificano per diverse
proteine ​
differenti. La risultante di imballaggio Baculo-AAV vettoriale permette di ingegnerizzare le cellule ospiti con le
proteine ​
virali che sono necessarie per produrre in modo stabile ed efficace LV, attraverso un solo evento di infezione.
Integrazione del genoma di imballaggi Baculo-AAV vettore è stato ottenuto l'espressione transiente della proteina AAV
rep. Questo sistema ha consentito di ottenere l'integrazione di vettori AAV in una intergenica regione non codificante
trascrizionalmente attivo, escludendo quindi l'attivazione di geni pericolosi, la cui mRNA possono essere incorporati nella
LV e infine nelle cellule bersaglio ospitante.
Il sistema proposto rappresenta un modo nuovo e vantaggioso per progettare in modo stabile ed efficace della cellula
ospite con le proteine ​
lentivirali strutturali e normativi.
In una forma di realizzazione preferita, i due cassette di espressione compresi nel Baculo-AAV imballaggio costrutto sono
coda-coda oriented e ognuno è guidato da un promotore costitutivo e un poli A, preferibilmente il promotore è scelto tra
CMV, CMV IE, PGK , SV40, e Flot, SFFV, e RSV, più preferibilmente il promotore è un promotore CMV IE. Secondo un
aspetto preferito dell'invenzione, il marcatore di selezione incluso nella confezione vettore AAV è scelto tra igromicina,
kanamicina, neomicina, zeomycin gene della resistenza; preferibilmente il marcatore è igromicina gene di resistenza; più
preferibilmente, il marcatore di selezione viene clonato a valle un IRES.
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Integrazione del genoma di imballaggi Baculo-AAV vettore è stato ottenuto mediante l'espressione transiente di proteine ​
AAV Rep per un'integrazione vettore AAV ITR-mediata. In una forma di realizzazione preferita proteina rep è scelto tra
Rep78 e Rep68, più preferibilmente la proteina è Rep78.
Usando questo sistema, è stato possibile ottenere cellule ingegnerizzate per esprimere stabilmente HIV-1 proteine ​
gag /
pol e riv, tali cellule sono chiamate cellule linea di confezionamento semi-stabile. In particolare, la presente invenzione
descrive e rivendicazioni tali cellule ingegnerizzate e loro uso per una produzione semi-stabile LV.
Semi-stabile linea cellulare di confezionamento semi-stabile linea cellulare di confezionamento della presente invenzione
è costituito da cellule ospiti portatori di almeno una copia del ricombinante Baculo-AAV imballaggio costrutto esprimere gli
HIV-1 gag-pol e rev geni. Integrazione del genoma di imballaggio Baculo-AAV vettore è stato ottenuto mediante
l'espressione transiente della proteina rep di AAV per ottenere ITR-mediata integrazione vettore AAV. Preferibilmente le
due cassette di espressione sono coda-coda oriented e ognuno è guidato da un promotore costitutivo e poli A,
preferibilmente il promotore è scelto da CMV, CMV IE, PGK, SV40, eFlot, SFFV e RSV. Più preferibilmente il promotore
costitutivo è un promotore CMV IE.
Secondo un aspetto preferito dell'invenzione il marcatore di selezione è scelto tra igromicina, kanamicina, neomicina,
zeomycin gene della resistenza; preferibilmente il marcatore di selezione è gene di resistenza igromicina, più
preferibilmente il marcatore di selezione viene clonato a valle un IRES.
Preferibilmente la proteina rep AAV è scelto tra Rep78 e Rep68. Più preferibilmente proteina rep è Rep78. Host linee
cellulari che possono essere progettati per ottenere la linea cellulare di confezionamento semi-stabile sono linee cellulari
umane selezionate da HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 o HeLa, più preferibilmente la linea cellulare è
HEK293-T. Tale linea cellulare di confezionamento semi-stabile è adatto per l'uscita di una potenzialmente grande varietà
di LV, con differenti env e diversi vettori di trasferimento in un sistema di produzione semi-stabile. Pertanto, esso
rappresenta un grande vantaggio per una produzione più efficace di LV, in quanto permette la riduzione dei costi, non
richiede usando l'GMP-grado plasmide codificante del DNA gag-pol e giri, e il rischio di formazione RCL secondaria ad
eventi di ricombinazione tra il plasmidi durante trasfezione transiente è ridotto. La linea cellulare di confezionamento semistabile è uno strumento versatile, ed è più sicuro ed economicamente più vantaggioso rispetto ad altri strumenti
attualmente impiegati in studi clinici per la produzione di LV.
Semi-stabile linea cellulare di confezionamento della presente invenzione ha mostrato di avere una stabilità genetica
sorprendente per 1 anno di coltura che ha dimostrato la produzione in continuo di LV funzionale dopo trasfezione
transiente degli elementi genetici rimanenti. Inoltre, nessun fenomeno di silenziamento sono state osservate infatti, sia
titolo e l'infettività di LV ottenuti utilizzando questo intermedio è rimasta inalterata dopo 1 anno. Tali dati sono stati
confermati sia in presenza o assenza di pressione selettiva. Sorprendentemente, dati comparabili riguardanti la stabilità
integrazione di una cassetta mediata AAV-ITR sono disponibili in letteratura. L'unica informazione correlato è che un
midollo osseo umano derivato, fibroblasti-l ike cel l linea (Detroit Rudd le 6 celle) infettate con il tipo selvatico AAV
sierotipo 2 (AVV-2) ha mantenuto sequenze virali in uno stato latente per almeno 47 e 118 passaggi. Come mostrato negli
esempi della linea cellulare di confezionamento semi-stabile della presente invenzione è sopravvissuto per almeno 102
passaggi. Pertanto, la presente invenzione fornisce un metodo per produrre LV comprendente:
i. La coltura di una linea cellulare di packaging semi-stabile come descritto sopra
ii. Inserimento nel semi-stabile linea cellulare di packaging un gene env
iii. Inserimento nel semi-stabile linea cellulare di packaging un vettore di trasferimento
Proteina Envelope può essere inserito in cellule ospiti con AAV vettore, vettore retrovirale, l'integrazione stabile plasmide o
ricombinazione omologa. Preferibilmente il gene env è inserito mediante trasfezione transiente con un plasmide.
Preferibilmente il gene env è scelto da VSV-G env, MLV 4070 env, D114 env, chimerica proteina dell'involucro RD114-TR,
proteina chimerica busta RD114pro, baculovirus GP64 env o GALV env o suoi derivati. Più preferibilmente la presente
invenzione fa uso della proteina chimerica busta RD114-TR env in cui la coda citoplasmatica di RD114 è stato sostituito
da quello della busta M LV. Preferibilmente il vettore di trasferimento è inserito con un SIN-LV.
Semi-stabile linea cellulare di confezionamento della presente invenzione sono in grado di produrre LV che in termini di
infettività sono "qualitativamente" uguali a quelli prodotti mediante trasfezione transiente. Un aspetto molto importante da
considerare per l'applicazione della produzione semi-stabile di LV è che la linea cellulare di packaging semi-stabile non ha
perso la capacità di essere facilmente transfectable. Infatti, PK-7 cellule trasfettate sono allo stesso livello della linea
cellulare parentale HEK293T. Questa funzione è abbastanza comunemente perso dopo la modificazione genetica e la
clonazione di cellule HEK293 con imballo costrutto. Al contrario, il sistema di espressione impiegato nella presente
invenzione per l'integrazione stabile di gag / pol e riv non causa alcun problema alla transfectability della linea cellulare di
confezionamento semi-stabile.
Inoltre, la linea cellulare di confezionamento semi-stabile e il suo utilizzo nel metodo di produzione per LV hanno vantaggi
importanti per i costi di produzione. In particolare, solo tre costrutti aggiuntivi, ad esempio plasmidi, (ogni tat codifica, env e
trasferimento vettoriali) sono necessari per la produzione di 2 ° generazione di LV, o due costrutti (ogni env codifica e
trasferimento vettoriali) per la produzione di 3 ° generazione di LV. Al contrario, i metodi GMP attualmente impiegati in
studi clinici richiedono l'uso di due costrutti aggiuntivi, codifica gag / pol e rev, rispettivamente, in aggiunta a quelli utilizzati
con la linea cellulare di confezionamento semi-stabile della presente invenzione.
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Inoltre, il numero ridotto di costrutti da trasfettate con i metodi e gli strumenti della presente invenzione, rappresenta anche
un ulteriore vantaggio per la sicurezza del LV come descritto sopra.
Inoltre, si è anche constatato in particolare che, utilizzando la produzione semi-stabile della presente invenzione, solo un
terzo della quantità totale di DNA impiegata nella produzione mediante trasfezione transiente è sufficiente per ottenere
lentivirus avente titolo paragonabile a quella di transitoriamente prodotta lentivirus. Pertanto, il sistema di espressione, la
linea cellulare di confezionamento semi-stabile e il metodo di produzione della presente invenzione sono molto
vantaggiosa rispetto a strumenti e metodi attualmente applicati nella clinica. Descrizione delle figure
Figura 1 Schemi di sviluppo RD-MolPack, (a) Rappresentazione schematica dei plasmidi di DNA utilizzati nello studio.
pPolh, poliedrina promotore; attBl, attachement Bl; ITR, terminal repeat invertito; CMV, promotore del citomegalovirus; In,
introne; RRE, rev elemento reattivo; Una sequenza polyA; IRES, sito ingresso ribosoma interno; SD, splice donatore; SA,
splice accettore; Ψ, segnale di imballaggio; WPRE, marmotta elemento normativo epatite post-trascrizionale; cPPT, tratto
polypurine centrale; hPGK, umano promotore posphoglycerate chinasi, (b) del fumetto di integrazione genomica Rep78mediata del vettore AAV-GPR. AAV Rep78 promuove l'escissione della cassetta AAV-GPR ITR-fiancheggiato e facilita la
sua integrazione in cromosomi umani, (c) Schema di flusso della produzione da linea cellulare di confezionamento semistabile. GOI, gene di interesse. Figura 2 Caratterizzazione dei cloni PK, (a) Southern blot dell'integrazione vettore AAVGPR. Per stabilire il numero di copie e l'integrità della cassetta, DNA genomico (10 mg) derivati ​
da cloni PK è stato
digerito con due diversi enzimi di restrizione, SomHI e snab \ rispettivamente, (b) analisi Western blot delle proteine ​
virali
prodotte da la cassetta GPR. Pannello sinistro, estratti cellulari (50 mg / corsia) ottenuta dai cloni PK sono stati ibridato a
un siero umano anti-HIV riconoscimento di HIV-1 proteine. La membrana è stata sequenziale ibridato con un anti-rev
specifica Ab. Pannello destro, 30 ng p24gag-equivalente di particelle virali come (VLP) prodotta da cloni PK sono stati
trattati in modo identico agli estratti cellulari, (c) mappatura schematica dell'integrazione GPR-cassette con la tecnica LMPCR che ha individuato il DNA break-point nel braccio lungo del cromosoma 2 alla posizione 2q32.1, (d) Co-localizzazione
della cassetta AAV-GPR e il gene umano in Hox4 cromosoma 2 ibridazione in situ di PK-7 cromosomi in metafase è stata
effettuata utilizzando un bavaglio -specifica (rosso) e una sonda Hox4-specifici (verde), rispettivamente (e)
Rappresentazione schematica del riarrangiamento dei due GPR integrato cassette in PK-7 clone e il loro orientamento
coda a testa.
Esperimenti Figura 3 Controllo relativi al Baculo-AAV-GPR ed eventuale integrazione Rep78, (a) Southern blot del
baculovirus ricombinante AAV-D NA. D NA è stato estratto da particelle baculovirus, digerito notte con Mlu \ enzima di
restrizione e, dopo blotting, sondato con la sonda specifica cassetta GPR 11-kb. Entry-GPR plasmide (1 pg) e baculovirus
DNA vuoto (100 ng) sono stati caricati come controllo positivo e negativo rispettivamente, (b) Rilevazione di integrazione
DNA plasmidico Rep78 residuo putativo in PK-7 cellule. Rep78 specifico PCR è stata eseguita utilizzando il PK-7 DNA
genomico come stampo campione e la CMV-Rep78 (1 pg) plasmide come controllo positivo.
Esempi Esempio I: Metodi generali
Plasmidi
Wild-tipo di HIV-1 gag, pol e rev geni sono stati asportato da Mlu \ / Nar \ e Mlu \ / \ Non digestioni dal pCG719-pKLgagpol
(qui di seguito denominato CMV-GPR per semplicità) (Figura la, schema 9) e pCG720 - pKrev (CMV-Ap) (Figura la,
schema 5) plasmidi, rispettivamente 25 . I geni virali sono stati inseriti nel Gateway ® pENTR ™ 4 navetta vettore
(Invitrogen, Co, Carlsbad, CA) in due cassette di espressione distinti coda-coda orientata, ogni cassetta guidata da un
promotore CMV IE e portando una sequenza polyA. La prima cassetta esprime i geni gag e pol mentre la seconda il gene
rev e la resistenza marcatore di selezione igromicina (igro) gene; igrometrico è stato clonato a valle un IRES per
consentire la traduzione bi-cistronic. Le due unità di espressione sono state introdotte nel Xba \ sito del plasmide
ricombinante pSUB201 trasporta un genoma di AAV infettiva 17 . La risultante 5 cassette 'ITR-CMV gagpol-polyA-Polvaigro-IRES-rev-CMV-ITR3' stato poi asportato e inserito nel Gateway ® pENTR ™ vettore 4 navetta (Invitrogen, Co,
Carlsbad, CA). Il ricombinante baculo- ibrido imballaggio vettore AAV (Baculo-AAV-G PR) (Figura la, schema 1) è stata
ottenuta mediante il sistema batteriofago lambda ricombinazione sito-specifica tra il 4 navetta entrata vettore pENTR ™,
contenente le due cassette, e il DNA BaculoDirect lineare (sistemi di espressione BaculoDirect ™ Baculovirus, Invitrogen,
Co.). Durante la ricombinazione omologa il gene poliedrina del DNA Baculo è pertanto sostituito con il doppio cassetto
GPR. Il plasmide di espressione pABCMV-Rep78 (CMV-AAV-Rep78) è stato ottenuto clonando il AAV-Rep78 ORF sotto il
promotore CMV IE del pABS.43 vettore di espressione come descritto in Recchia et al., 2004 18 (Figura la, schema 4 ). Il
plasmide pMD.G (CMV-VSV-G) 19 , codifica per la glicoproteina busta stomatite vescicolare (VSV-G) (Figura la, schema
6). Il 3 ° generazione trasferimento vettore, pCCLsin.PPT.hPGK.eGFP.WPRE.Amp (SIN- eGFP) 20 esprime il gene eGFP
sotto il promotore costitutivo hPGK (Figura la, schema 2). Il 2 ° generazione PAN-Chim3 trasferimento vettore che esprime
l'anti-HIV-1 Chim3 transgene è stata descritta nel Porcellini et al., 2009 e 2010 21 ' 22 (Figura la, schema 3). Il pCMVRD114-TR (CMV-RD114-TR) (Figura la, schema 7) plasmide codifica per il chimerico busta RD114-TR, fatta di domini
extracellulari e trans-membrana del RD fel ine retrovirus endogeno 114 busta un nd il coda citoplasmatica (TR) della AMLVenv 4070A. Il 2 generazione confezionamento pCMV-AR8.74 (CMV GPRT) costrutto (Figura la, schema 8) codifica i
virus HIV-1 gag, pol, rev e TAT geni 19 .
Cellule
Spodoptera frugiperda (Sf9) cellule di insetto (Invitrogen, Co.) sono state coltivate in sospensione TC-100 di media
(Invitrogen, Co.) supplementato con 10% FCS (EuroClone Ltd, UK) e una combinazione di penicillina-streptomicina e
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glutammina (PSG ) a 27 ° C in assenza di C0 2 . 293T embrione umano rene (HEK293T), le cellule e il suo clone derivato
(PK-7) sono state propagate in Dulbecco Modified Eagle Medium (DM EM) supplementato con 10% FCS e PSG. CEM
A3.01 e SupTl T cellule linfoblastoidi sono state coltivate in RPMI 1640 supplementato con 10% FCS e PSG. CD34 +
cellule staminali emopoietiche (HSC) e leucociti neonatali sono stati purificati da sangue del cordone ombelicale (UCB)
centrifugazione su un gradiente di Ficoll-Hypaque (Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norvegia). Dopo la
separazione gradiente, CD34 + HSC sono stati isolati dalla raccolta UCB mononucleate anello cella selezione positiva
utilizzando CD34 microsfere Kit e MiniMACS separatore Colonne (Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA). CD34 + cellule purezza
(> 92%) è stato istituito da FACS analisi (FACSCalibur BD Bioscience, San Jose, CA) e il software FlowJo (Albero Stella,
Inc., Ashland, OR), utilizzando l'anti-CD34-PE Ab (BD Pharmingen ™, San Diego, CA). CD34 + cellule sono state prestimolate per 24 ore nel 20% siero di Iscove Modified Dulbecco Medium (DM IM) contenente fattore di cellule staminali
umane (h-SCF) 100 ng / ml (R & D Systems, Minneapolis, MN), h-Flt3L 100 ng / ml (Peprotech, Rocky Hill, NJ), h-IL-6 20
ng / ml (R & D Systems) e trombopoietina umana (h-TPO) 20 ng / ml (Peprotech) e mantenuto nello stesso terreno
durante la trasduzione. Leucociti neonatali sono state stimolate per 48 ore con il CD3 solubile anti-umano (30 ng / ml)
(ORTHOCLONE OKT3, Janssen-Cilag, UK) e ricombinante umano IL-2 (rhlL- 2) 50 U / ml (Chirone, Emeryville, CA) in
RPMI e poi mantenuto in RPMI supplementato con 10% FCS, PSG, e rhlL-2.
Produzione Baculovirus e infezioni Baculo-GPR di cellule HEK293T Baculovirus, portando l'ibrido Baculo-AAV-GPR
genoma del DNA ricombinante, è stato prodotto seguendo il metodo BaculoDirect utilizzando il Gateway ® sistema DNA
Baculovirus adattato (Invitrogen, Co.). Ricombinante Baculovirus titolo è stata valutata mediante test placca e corrisponde
alla 1 χ 10 11 pfu / ml dopo tre passaggi di amplificazione virale nelle cellule Sf9. PK-7 clone è stato ottenuto trasfettando
1,5 x 10 s HEK293T cellule con 4 mg di AAV-Rep78 plasmide di espressione e 24 ore dopo infettati con il ricombinante
Baculo-AAV-GPR ad una MOI di 1.000. Ls Cel sono stati ma inta INED senza igromicina per 4 giorni e poi 5 χ 10 5 cellule
sono state seminate in 22 piatti 10 cm in presenza di igromicina (100 mg / ml) a concentrazioni diluite serialmente. I 22
piatti sono stati sottoposti a screening per la produzione p24gag da ELISA. Solo un piatto, in cui le cellule sono state
seminate a 3,7 10 4 cellule / piatto, rilasciato p24gag sufficiente nel surnatante. Il piatto conteneva 40 colonie che sono
stati tutti raccolti-up e di screening. Tre di loro, segnando positivo per la produzione p24gag, sono stati ulteriormente
caratterizzati.
Vettori lentivirali (LV) produzione e titolazione LV pseudo-digitato prodotte dalle cellule HEK293T sono stati ottenuti tramite
co-trasfezione transiente dei seguenti plasmidi: la confezione costruisce CMV-G PR (3 ° generazione) [o CMV-GPRT (2 ° generazione)], il VSV-G o RD114-TR costrutti busta, e la 3 ° generazione SIN-eGFP 24 o il 2 ° generazione PAN-Chim3
trasferimento vettore 21 . Il rapporto di confezione: busta: trasferimento vettore era 6,5: 3,5: 10 mg di DNA se non
diversamente indicato. LV da PK-7 clone sono stati generati da co-trasfezione plasmide-env esprimere e il vettore di
trasferimento. Trasfezioni transitorie sono state eseguite sia con il Ca norma ++ metodo -fosfato o il sistema Fugene ™ 6
seguendo le istruzioni del produttore (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN), ottenendo risultati simili.
Surnatanti sono stati raccolti 48 ore dopo la trasfezione e filtrati attraverso un filtro da 0,45-μιτι. Titolo è stato calcolato
sulla SupTl, CEM A3.01, cellule ematiche mononucleate periferiche primarie attivati ​
(PBMC) e il sangue del cordone
ombelicale CD34 derivato + HSC a seconda del tipo di esperimenti. In breve, SupTl e cellule primarie mononucleate
attivate sono state trasdotte da due cicli di spinoculation (1.240 g per 1 ora) in presenza di polibrene (8 mcg / ml) (SigmaAldrich, St Louis, MO), separati da una fase di riposo durante la notte; CD34 + cellule staminali emopoietiche sono state
trasdotte per 24 ore su piastre retronectin rivestite (Takara Bio, Otsu, Giappone) senza polibrene. Efficienza di trasduzione
è stata monitorata mediante citometria di flusso analisi (FACS Calibur BD Bioscience, San Jose, CA) di espressione eGFP
(SIN-eGFP). o espressione ALNFGR (ΡΔΝ- Chim3), come descritto nel Porcellini al., 2009 e 2010 et 21,22 , utilizzando il
software FlowJo (Albero Stella, Inc., Ashland, OR) solo i valori di trasduzione che vanno dal 5 al 20% di cellule positive
sono stati utilizzati per calcolare il titolo di ciascun preparato LV secondo la seguente formula: TU = [numero di cellule
GFP / 100)] / vol sup (in ml). Analisi Southern blot
DNA genomico (gDNA) è stato isolato dal kit QIAamp Mini (QIAGEN GmbH, Germania) secondo le istruzioni del
produttore. Baculovirus DNA è stato estratto da particelle virali di micro kit DNA QIAamp (QIAGEN). Dopo la digestione
durante la notte con la restrizione indicata enzimi 10 mg di gDNA è stato eseguito su 0,8% gel di agarosio, cancellato
tramite bonifico capillare Southern su membrane di nylon (Duralon, Stratagene, TX, USA) e poi ibridati a 1 10 s dpm / ml di
32 P Random primer recanti l'etichetta di 600-bp CMV o 11-kb cassette GPR. Analisi analitica di PCR
Analisi di PC per lo screening di residui integrazione del plasmide AAV-Rep78 in PK-7 cellule è stata effettuata su 300 ng
di gDNAs genomiche utilizzando il set di primer: AAV-Rep78 forward: 5'-CGG GCT GCT GGC CCA CCA GG-3 ' ; AAVRep78 inverso: 5'-ATG CCG GGG TTT TAC GAG ATT GTG-3 'e le seguenti condizioni di PCR: 98 ° C per 7 minuti, 30
cicli di 94 ° C per 30 secondi, 66 ° C per 30 secondi, e 72 ° C per 1,5 minuti.
Per stabilire l'orientamento dei due cassette GPR, amplificazione PCR è stata effettuata su 300 gDNAs ng utilizzando il
set di primer: rev avanti: 5'-CTT GAG GAG GTC TTC GTC GC-3 '; beta-globina inverso: 5'-CCC TGT TAC TTC CCT TCC
TCC -3 '; rev avanti nidificato: 5'-TGT CTC CGC TTC TTC CTG CC-3 '; della beta-globina inverso nidificato: 5'-TTA ACC
ATA GAA AAG AAG GGG-3 'e le seguenti condizioni: 94 ° C per 2 minuti, 35 cicli di 94 ° C per 30 secondi, 52 ° C per 30
secondi, e 72 ° C per 1,5 minuti. p24gag ELISA
Produzione fisica LV è stata misurata in surnatanti dalla Alliance HIV-1 p24 kit ELISA antigene (Perkin Elmer Life and
Analytical Sciences, Inc. Waltham, MA) seguendo le istruzioni del produttore, con il presupposto che 1 pg p24gag
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corrisponde Lx 10 4 particelle fisiche .
Western blot
Whole-cell ed estratti nucleari derivati ​
da PK-7 cellule e proteine ​
virali derivate da isolato VLP cell-free o LV sono state
preparate come descritto in precedenza 21,22 . Le proteine ​
erano di dimensioni-frazionata mediante SDS-PAGE, e
electroblotted di Hybond ECL membrane di nitrocellulosa (GE Healthcare, Life Sciences, UK Ltd, UK). Le membrane sono
state bloccate nel 5% basso contenuto di grassi del latte secco, e poi incubate con l'appropriato Ab primario. Il siero antiHIV, ottenuto da un malato di Aids, è stata utilizzata a 1: 2.000 diluizione; l'HIV-1 rev MoAb (Ap-6, sc-69730 S. Cruz
Biotechnology, Inc., S. Cruz, CA) a 1: 200 diluizione. Ab legame è stato visualizzato dal sistema di chemiluminescenza
potenziata ECL (ECL, Amersham) seguendo le istruzioni della fabbrica. LV DNA copia numero quantificazione mediante
real-time TaqMan PCR
Il numero di copie del vettore integrato GPR è stato istituito con TaqMan PCR quantitativa utilizzando un ABI Prism 7900
VELOCE strumento (Applied Biosystems, Foster City, CA) e analizzati dal software SDS 2.3 (Applied Biosystems). DNA
genomico (gDNA) è stato amplificato con i seguenti primer e sonda derivati ​
dal gene gag: forward: 5'-ACA TCA AGC AGC
CAT GCA AAT-3 '; inverso: 5'-ATC TGG CCT GGT GCA ATA GG-3 '; Sonda: FAM 5'-CAT CAA TGA GGA AGC TGC
AGA ATG GGA TAG A-3 'TAM RA. Condizioni di PCR erano le seguenti: 2 minuti a 50 ° C e 5 minuti a 95 ° C, seguiti da
40 cicli di 15 secondi a 95 ° C e 15 secondi a 60 ° C, con un incremento di 0,1 ° C / ciclo.
Legatura-mediata (LM) -PCR DNA genomico è stato estratto da PK-7 cellule di QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) secondo
le istruzioni del produttore e digerito con BglW e BamH \ a 37 ° C durante la notte. Legatura di un adattatore 76-bp
oligonucleotide linker compatibile con estremità coesive il 5'-GATC-3 'è stato eseguito in condizioni standard. LM-PCR è
stata effettuata utilizzando la seguente coppia di primers annidati: l'ITR avanti: 16s: 5'-GTA GCA TGG CGG GTT AAT CA3 ', e 17s / lungo nidificato: 5'-TTA ACT ACA AGG AAC CCC TAG TGA TGG-3 '; Il linker inversa primer: Linker-1: 5'-GTA
ATA CGA CTC ACT ATA GGG C- 3 'e Linker-2 nidificato: 5'-AGG GCT CCG CTT AAG GGA C-3'. Le sequenze del linker
corrispondevano a 5'-GAT CGT CCC TTA AGC GGA GCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA CCA GGG AAT TCG CCT
CGG GAT ATC ACT CAG CAT AAT G-3 '. Due rou nds di LM-PCR sono state effettuate utilizzando DNA polimerasi
AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), ciascuno comprendente 30 cicli (95 ° C per 30 secondi, 52 ° C per 30 secondi, 72 °
C per 2 minuti). Ampliconi della PCR sono stati clonati utilizzando il TOPO ® kit di clonazione (Invitrogen, Co.) e colonie
plasmidi che trasportano inserti di circa 100-200 bp sono stati selezionati per il sequenziamento. Omologie di sequenza
sono stati identificati dalla ricerca BLAST, NCBI.
Ibridazione in situ fluorescente (FISH)
Cromosomi di metafase stati ottenuti trattando PK-7 cellule con colchicina (10 mcg / ml) (Sigma # C9754) per 2 ore a 37 °
C. Dopo salina tampone fosfato (PBS) il lavaggio, le cellule sono state mantenute in soluzione ipotonica (75 mM KCI) per
6 minuti a temperatura ambiente (RT), fissate con 4 lavaggi di metanolo / acido acetico (3: 1) e poi si sviluppa su una
superficie pulita vetrino. Campioni citogenetiche sono state denaturate in soluzione di formammide 70% per 2 minuti a 72
° C, disidratate dal freddo del 70%, 85%, e 95% di etanolo lavaggi consecutivi e poi essiccato all'aria. Le sonde specifiche
sono state preparate come segue: il DNA plasmide 13- kb contenente la cassetta GPR è stato etichettato con il Random
prima mano DNA Labeling Kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) con SpectrumOrange -dUTP (Vysis, Inc.,
Downers Grove, IL ), mentre il DNA cosmide controllo 30 kb contenente il gene umano hox4 è stato etichettato con il
FISHSr / g ji ™ kit Nucleic Acid Labeling (Kreatech Biotecnologia, Amsterdam, Paesi Bassi). L'ibridazione è stata
effettuata incubando 5 ng / μΙ di ogni sonda in 250 μΙ del 50% formammide, 2 χ SSC, e il 10% di destrano solfato e 50 ng /
μΙ di umana C 0 T-1 tampone di ibridazione DNA (Invitrogen). I campioni sono stati rivestiti con sonde denaturato per 10
minuti a 75 ° C, coperto con Parafilm ® M, e incubate a 37 ° C in una camera umida. I campioni sono stati lavati una volta
in 0,4 χ SSC, pH = 7 a 72 ° C per 2 minuti, una volta in 4 χ SSC, pH = 7 contenente 0,0025% di Tween-20 per 30 secondi
a temperatura ambiente e due volte in PBS 1 χ per 1 minuto a RT. I vetrini sono stati di contrasto con 0,02 mg / mL di
49,6-2-diamidino fenilindolo (DAPI) (Sigma). Visualizzazione e immagini fotografiche sono state scattate con un
microscopio in posizione verticale Nikon SOI (Nikon Instruments SpA, Italia) con il verde (FITC) e arancio dello spettro
(spettro arancione) illuminazione del filtro. Le immagini sono state elaborate con il software Genikon (Nikon).
Esempio II: Generazione del primo intermedio PK-7 clone
Per ottenere la linea RD-MolPack cellulare di packaging per la produzione in continuo di una 2 ° - o 3 ° - generazione di
LV, diversi cloni intermedi HEK293T-derivati ​
sono stati ottenuti. Il primo è stato chiamato PK-7 ed è stata ottenuta con
integrazione stabile del virus HIV-1 gag, pol, e geni rev mediante l'ricombinante ibrido Baculo-vettore AAV (rhBaculo-AAVGPR) (Figura la, schema 1). Questo sistema di consegna sfrutta l'attività dell'integrasi di proteine ​
AAV-Rep78, fornito
transitoriamente, di accise e integrare le cassette di integrazione AAV ITR-fiancheggiati in cromosomi umani (Figura lb). Il
rh- Baculo-AAV vettore è stato generato da ricombinazione omologa tra il DNA lineare BaculoDirect e il Gateway ®
pENTR ™ plasmide 4 voce contenente le cassette GPR ITR-fiancheggiati (Figura la, schema 1). Dopo 3 cicli (P3) di
baculovirus ricombinante di amplificazione in cellule di insetto Sf9, il titolo e le potenziali eventi di ricombinazione del DNA
ibrido Baculo-AAV sono stati controllati dalla placca test e virale genomico Southern blot del DNA, rispettivamente. Il titolo
in p3 corrispondeva a 6 χ 10 10 pfu / ml, e analisi Southern blot ha rivelato una singola banda tagliente, dimostrando eventi
di ricombinazione durante il processo di amplificazione del virus (Figura 3). Successivamente, la dose e il tempo di AAVRep78 plasmide trasfezione e di infezione rh-Baculo-AAV e le condizioni di clonazione delle cellule HEK293T infette sono
stati accuratamente definiti (Figura lc). In realtà, la scelta di queste impostazioni sperimentali si è rivelata fondamentale.
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Così dopo aver testato una vasta gamma di condizioni, alla fine si è stabilito che una singola dose di AAV-Rep78 plasmide
DNA trasfettate 24 ore prima dell'infezione rh-Baculo-AAV presso il MOI del 1000 corrispondeva al disegno migliore
sperimentale. Inoltre, è stato osservato che semina un totale di 5 χ 10 5 cellule distribuita in 22 piatti di 90 mm-Petri, ogni
piatto seminate a diversa concentrazione e aggiungendo Hygromycin 100 mcg / ml dopo 4 giorni dalla semina era la
condizione migliore per raccogliere l' maggior numero di cloni cellulari. Solo tre dei 360 cloni contati, PK-7, PK-17 e PK-18,
espresso p24gag sopra i 100 pg / ml risolta soglia. Analisi Southern blot di cloni ha rivelato che ogni clone contiene due
copie del vettore di dimensione corretta-zione (Figura 2a). Per escludere possibile integrazione di residuo AAV-Rep78
plasmide DNA, Rep78 PCR specifica su PK-7 gDNA sono stati effettuati rilevare alcun segnale positivo (Figura 3b). L'HIV1 pattern di espressione proteica derivata dalla cassetta GPR è stata monitorata mediante Western blot dei tre cloni PK e
la loro corrispondenza virale particelle simili (VLP) rilasciati nel mezzo. Tutte le proteine ​
virali sono stati opportunamente
elaborati, corretti in dimensioni e in diritto, proporzione relativa (Figura 2b). Il futuro PK lavoro clone è stato selezionato
calcolando sulle cellule SupTl la potenza del LV prodotte dai tre cloni dopo essere co-trasfettate con il plasmide VSV-G e il
3 ° generazione trasferimento vettore SIN-eGFP (Tabella 1). Di nota, anche se il titolo di controllo HEK293T LV prodotta
mediante trasfezione transiente è stata 5 volte superiore a quello del PK-7 e PK-18 LV, la sua infettività era quasi identica
a quella del PK LV, suggerendo che i cloni PK generano LV che sotto un punto di vista "qualità" sono paragonabili a quelli
prodotti con metodi convenzionali (Tabella 1). Sebbene la potenza di PK-7 e PK-18 LV è stato sc m il ar, P K-7 clone è
stato selezionato per l'ulteriore manipolazione genetica perché i suoi valori di produzione morfologia, crescita, vitalità e
p24gag ottenuto migliori di quelle di PK-18 clone ( Tabella 1).
Tabella 1 Potenza di VSV-G pseudotyped
LV prodotta da cloni PK
Clones titolo (TU / ml) una
rl 7 lj Ί .Ί y x 1 U
PK-17 5.4 x 10 6
PK-17 636
PK- 1 o R SiSSSSSS
HEK-293T 1694
L'infettività (TU / ng p24Gag)
PK-7 2,7 x 10 4
PK-17 8,4 x 10 3
PK- 1 R u
HEK-293T 3,4 x 10 4
Titolo è stato calcolato sulle cellule SupTl tre giorni
dopo la trasduzione. Le cellule sono state trasfettate con
egli VSV-G e plasmidi SIN-eGFP.
'Il grassetto indica il clone selezionato.
Accanto, l'integrazione della cassetta GPR ITR-fiancheggiato è stato caratterizzato in modo approfondito in PK-7 clone by
LM-PCR quantitativa, TaqMan PCR (Figura 2c) e tecniche di FISH (Figura 2d). Per mappare esattamente il sito di
integrazione, studi LM-PCR sono state effettuate, che spotl ighted il kpoint Brea al cromosoma 2, 2q32.1 (Figura 2c).
Questo risultato è stato confermato mediante ibridazione in situ con la sonda specifica GPR che ha rivelato un singolo
punto nel cromosoma 2 in base alla lunghezza del braccio e della posizione del centromero (figura 2d). A conferma di
questa assegnazione posizione, la sonda HOX4 è stato utilizzato, che è noto per mappare nel cromosoma 2q31.2. Come
le cellule HEK293T sono triploidi, HOX4 stato giustamente rilevato in tutti e tre i cromosomi 2 (Figura 2d). Infine, è stato
confermato da TaqMan PCR quantitativa che due copie sono state integrate e nested PCR con una progettazione
adeguata del primer (Figura 2e) che le due copie erano in tandem orientamento, la coda a testa. Orientamento Tail-a-testa
è la configurazione naturale osservato anche per l'integrazione di tipo selvaggio AAV e la maggior parte concatamers
vettoriali rAAV nel genoma della cellula ospite 16 . Le analisi della sequenza del ampliconi comprende la giunzione codatesta rivelato che un frammento di 910 bp comprendente 303-bp del 3 'promotore CMV del primo cassetto con entrambe
lo s del primo e del secondo cassetto e l'intero 5' promotore CMV del secondo cassetto sono stati persi (Figura 2e, scatola
rossa). La maggior parte degli eventi di ricombinazione vettore-cellulare avviene infatti all'interno delle sequenze ITR del
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vettore. Questo riarrangiamento ha provocato nei PK-7 cellule della mancanza di trascrizione del gene gag-pol del
secondo cassetto e probabilmente la mancanza di trascrizione dei giri e igro geni della prima cassetta. Tuttavia, si segnala
che la regione 285-bp sinistra del promotore CMV soppresso (figura 2e, triangolo grigio al centro del sistema) contiene
ancora il TATA box che potrebbe essere sufficiente a guidare la trascrizione dei geni rev e igro. In conclusione, PK-7
contiene due cassette integrati, che trascrivono insieme un gene gag-pol e uno o due geni rev e hygro.
Per dimostrare la stabilità di PK-7 clone nel tempo, le cellule sono state coltivate in presenza o assenza di igromicina per
350 giorni corrispondente a ca 420 raddoppi cellulari, e misurati produzione p24gag su una base per cellula (Tabella 2).
La produzione media in presenza di igromicina corrisponde a / l 15,34 ± 8.47SD ng p24gag χ 10 s cellule, che, in assenza
di antibiotico è 6,70 ± 3.51SD ng p24gag / lx 10 s cellule (Tabella 2).
Questa differenza probabilmente deriva dal fatto che Hygromycin pressione farmaco mantiene su un "a" indica la
trascrizione del gene di resistenza hygro e quindi la cromatina pure. Questo potrebbe favorire il più alto trascrizione dei
geni gag-pol. Per valutare se il VLP generati da PK-7 clone erano funzionali anche dopo centinaia di raddoppi, PK-7
cellule sono state co-trasfettate a p60 e PL02 con VSV-G busta e trasferimento SIN-eGFP vettoriale e calcolate la potenza
LV sulle cellule SupTl . Sorprendentemente, il titolo e l'infettività di LV prodotti sia in presenza che in assenza del farmaco
selezione persisteva a livello normale ancora dopo tale tempo prolungato (Tabella 2). Questi dati dimostrano nessuna
instabilità genetica della cassetta GPR indipendentemente dalla presenza o assenza di pressione farmaco e ci ha
permesso di evitare l'uso di igromicina nella caratterizzazione futuro. Senza dati comparabili riguardanti la stabilità
integrazione di una cassetta mediata AAV-ITR sono disponibili in letteratura. L'unica informazione correlato è che un
midollo osseo umano deriva, linea cellulare di fibroblasti-like (di Ruddle Detroit 6 celle) infettate con il tipo selvatico AAV
sierotipo 2 (AVV-2) ha mantenuto sequenze virali in uno stato latente per almeno 47 passaggi e 118 passaggi 22,23 . In
particolare, PK-7 cellule sopravvissute per almeno 102 passaggi. Tabella 2 Stabilità di P -7 clone nel tempo
Hygromycin No Hygromycin
Passage p24Gag ng / 10 6a p24Gag ng / 10 6a
r <£
P6 '' '' '' '' '' '■' 7
P10
P16 5.00 4.80
P24 7.20 6.50
:::::::::::::::::::::::::::l:::l
P40 18.00 10.00
P44
P48
P52
P56 1 1.00 6.70
P64 22.00 18.70
P68
P72 16.50 4.90
P76
P80
P88
P98 16.70 1 .36
P102
MeaniSD 15,34 ± 8,47 6,70 ± 3,51
Titolo (TU / ml) b
P60 WMM m mmmmm mm
P102 2.7 x 1.3 x 10 ° 10 '
p24Gag (ng / ml) b
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rotolo
PI 02 80 13
L'infettività (TU / ng p24Gag) b
P60
PI 02
"Livello p24Gag espresso in ng / 1 10 ° cellule
'Valori Potenza di VSV-G pseudotyped LV prodotte dopo
trasfezione di PK-7 cellule con SIN-eGFP e VSV-G plasmidi e
testato su cellule SupT1 3 giorni dopo la trasduzione
Esempio I II: l'uso di PK-7 clone per la produzione di semi-stabile LV
Per stabilire meglio se la produzione LV semi-stabile da PK-7 clone era nel complesso paragonabile a quello della
produzione LV transitorio da cellule EK293T H, entrambi i tipi di cellule sono state trasfettate con la stessa quantità di
plasmidi necessari e misurata la percentuale di trasfezione e la potenza dei rispettivi LV su differenti cellule bersaglio
(Tabella 3). In questa condizione, la media della percentuale di trasfezione di 11 esperimenti con le cellule H EK293T era
90.54 ± 3.6 SEM e quella di 12 esperimenti con PK-7 cellule è stata 91 ± 5.3SEM, indicando che PK-7 cel ls mantengono
la loro alta capacità di trasfezione livello. Quindi, il titolo LV è stato calcolato in cellule SupTl, come il nostro CD34 tipo
cella di riferimento, il sangue del cordone derivato di serie + HSC, e anti-CD3 / I L-2 mononucleate di sangue del cordone
cellule attivate (indicato come T linfa, nella tabella 3) ( Tabella 3). Tabella 3 Potenza di VSV-G pseudotyped 3 e 2
generazione LV prodotto
da PK-7 clone calcolati su diversi tipi di cellule bersaglio
SupTl CD34 + I linfatico.
Vector Produttore Titer (TU / ml)
PK-7 5.7 10 '2,4 x 10' 2,3 x 10 '
HEK-293T b 5.6 x 1 0 7 3,0 x 10 b 1 .3 x 1 0 b
p24Gag (ng / ml)
PK-7 5 1 11 l! il
HEK-293T 350 350 279
m infettività (TU / ng p24Gag)
PK-7 1 .2 x 10 s 5,3 x 10 2 1 .0 χ 10 4
HEK-293T 1 .6 x 1 0 4 8,6 x 10 2 4,6 x 1 0 3
SupTl CD34 + CEM A3.01
Titolo (TU / ml)
PK-7 a 2,2 x 10 6 1 .4 x 10 "3,7 χ 10 6
HEK-293T "5,8 x 1 0 6 1 .6 x 10 4 8.8 x 1 0 6
p24Gag (ng / ml)
E Έ PK-7 27 27 27
o
HEK-293T 1 14 1 14 1 14
Q <. L'infettività (TU / ng p24Gag)
PK-7 8.1 x 10 4 5.1 x 10 1
HEK-293T 5.0 x 1 0 4 1 .4 x 10 2 7.7 x 1 0 4
un pseudotyped VSV-G LV sono state prodotte aftertransfection di PK-7 cellule sia con il
SIN-eGFP o il PAN-Chim3 e VSV-G plasmidi busta.
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b VSV-G pseudotyped LV sono stati prodotti aftertransfection di HEK-293T
cellule con CMV-GPR, SIN-eGFP (o PAN-Chim3) e VSV-G plasmidi busta.
LV sono stati testati sulle cellule bersaglio dopo 3-5 giorni di trasduzione.
In particolare, l'infettività di 3 ° generazione LV, SI N-eGFP, generato da PK-7 cellule era ca 1-log inferiore e quasi uguale
a quella del controllo LV quando il titolo è stato calcolato in SupTl e CD34 + cellule, rispettivamente, considerando che la
metà-log maggiore sui linfociti T attivati. L'infettività del 2 ° generazione LV, PAN-Chim3, generato da PK-7 cellule era
quasi uguale a quella del controllo LV quando il titolo è stato calcolato sia su cellule SupTl o CD34 + cellule CEM o A3.01.
Collettivamente, questi risultati indicano che PK-7 clone produce LV "qualitativamente" uguali a quelli prodotti dalle cellule
HEK293T transitoriamente sono co-trasfettate. Una questione molto importante da considerare per l'applicazione di PK-7
in produzione semi-stabile di LV è che PK-7 clone non ha perso la capacità di essere facilmente transfectable. Questa
funzione è abbastanza comunemente perso dopo la modificazione genetica e la clonazione di cellule 293 con imballo
costrutto.
Esperimenti di titolazione sono state effettuate per stabilire la dose totale di DNA del plasmide busta e trasferimento
vettore da utilizzare per la produzione LV ottimale dal PK-7 cellule. In particolare, si è stabilito che anche meno di un terzo
della quantità totale di DNA (0,3 mg) è stato sufficiente a generare LV con titolo paragonabile a quella di LV prodotto con
la quantità standard di DNA (1 mg) sia SupTl e CEM A3 .01 linee cellulari. Pertanto utilizzando PK-7 per la produzione di
semi-stabile di LV invece di cellule HEK293T taglierà drasticamente il costo elevato del DNA plasmidico GMP-grado.
Tabella 4 Riduzione della quantità totale di DNA plasmidico (su piccola scala)
DNA plasmidico 0,3 mg 0,6 mg 1 mg
SupT1 CEM A3.01 SupT1 CEM A3.01 SupT1 CEM A3.01
Titer
1 .2 x 10 4.9 x 10 1 .1 x 10 3.5 x 10 1 .0 x 10 4.1 x 10 6 (TU / ml) "
p24Gag
111 111 105 105 85 85 (ng / ml)
Infettività
1 .0 x 10 ' 4,4 x 10 4 1 .0 x 10 3.3 x 10 ' 1 .1 x 10 ' 4,8 x 10 4 (TU / p24Gag)
'Titolo di LV prodotti dopo trasfezione di PK-7 cellule con ΡΔΝ-eGFP vettoriale e busta VSV-G.
Riferimenti
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CITAZIONI DIVERSE DA BREVETTI
Riferimento
1
*
Vedere riferimenti di WO2012028680A1
* Citato da ONU esaminatore
CLASSIFICAZIONI
Classificazione Internazionale
C12N7 / 02 , C12N15 / 866 , C12N15 / 867
Classificazione cooperativa
C12N2800 / 50 , C12N2750 / 14143 , C12N2710 / 14144 , C12N2800 / 40 , C12N2740 / 16052 , C12N15 / 86
Classificazione Europea
C12N15 / 864A , C12N15 / 867P
EVENTI LEGALI
Dati
Codice
Evento
Descrizione
29 ago 2012
17q
Prima relazione d'esame
Data effettiva: 20120731
1 ago 2012
17P
Richiesta di esame
archiviato
Data effettiva: 20120425
1 ago 2012
AK
Stati contraenti designati:
Stato designato (s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI
LT LU LV MT NL MC MK NO PL PT RO SE SI SK RS SM TR
Codice Tipo di documento ref: A1
1 ago 2012
AX
Estensione o convalida del
brevetto europeo a
Paesi interessati: BAME
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