Biotecnologie in Ortopedia e Traumatologia :
dalle attuali evidenze cliniche alle nuove
frontiere
Basi biologiche
dell’uso delle MSCs
Dr Eugenio Boux Dr Alberto Siclari
P.O. Di Biella ASLBI
Mesenchymal stem cell MSC
CELLULE STAMINALI
• Indifferenziate
• Capaci di autorigenerarsi ( selfrenewal)
• Capaci di differenziarsi in tipi cellulari
specifici
• Capaci di ripopolare un dato tessuto in
vivo
CELLULE STAMINALI
EMBRIONALI
ADULTE
• TOTIPOTENTI: capaci di dar luogo a tipi
cellulari embrionali e non.
• PLURIPOTENTI: capaci di dar luogo a tutti i tipi
cellulari derivati dai tre foglietti embrionali
(cellule isolate da un embrione a sei settimane,
cellule isolate da feto a termine, da placenta, da
sangue cordonale e da tessuti adulti).
• MULTIPOTENTI: capaci di dar luogo a cellule
appartenenti a diversi lineages (cellule staminali
dei tessuti adulti, hematopoietic stem cells).
• OLIGOPOTENTI: capaci di dar luogo a un
ristretto subset di lineage cellulari (neural stem
cells, hair bulge stem cells).
• UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un
unico tipo cellulare (spermatogonial stem cells).
CELLULE STAMINALI ADULTE
Cellule NON DIFFERENZIATE di organi
o
tessuti adulti,
capaci di AUTORIGENERARSI e di
DIFFERENZIARSI nei tipi cellulari del
tessuto o organo preso in considerazione
Le cellule mesenchimali staminali
• Sono conosciute anche come:
•
•
•
•
colony forming fibroblastic cells
stromal fibroblasts
marrow stromal stem cells
mesenchymal progenitor cells
•
•
•
•
•
• Le cellule mesenchimali sono cellule nonemopoietiche stromali che hanno la
capacità di differenziarsi in diverse linee .
Condroblasti
Osteoblasti
Adipociti
Cellule neurali
Miociti
• E’ possibile guidare le MSCs in uno
specifico tipo anche in laboratorio
usando adatti fattori di crescita o
specifiche sostanze
• ( ad esempio il blu di toluidina le
differenzia in condroblasti )
MF Pittinger et al.Multilineage potential of adult human MSCs Science 1999; 284
:143-7
Dennis J.E. Origin and differentiation of human and murine stroma.
(2002) Stem Cells; 20:205-214
CARATTERIZZAZIONE
IMMUNOFENOTIPICA DELLE MSC
Nome marcatore
Tipo cellulare
Funzione
CD45
Leucociti
Non espresso sulle MSC.
Proteina di superficie dei
progenitori dei leucociti.
Glicoforina
Eritrociti
Non espresso sulle MSC.
CD14
Monociti e macrofagi
Non espresso sulle MSC.
Recettore del lipopolisaccaride
CD50
Cellule staminali
ematopoietiche (HSC)
Non espresso sulle MSC.
ICAM 3
CD34
HSC, cellule satelliti,
progenitori endoteliali
Non espresso sulle MSC.
Sialomucina
CD44
Cellule mesenchimali
Molecola di adesione e recettore
dell’acido ialuronico e
dell’osteopontina
ScaI
HSC, MSC
Stem cell antigen
CD29
MSC
VLA-β chain
Sono cellule mobili?
Le MSCs hanno la capacità di muoversi e
rispondono alla chemiotassi .
WR Otto Tomorrow’s skeleton staff MSC and the repair of bone and
cartilage Cell Prolif 2004 ; 37: 97-110
Dopo le microfratture si ritrovano
nell’articolazione
J. Kramer et al. “In vivo matrix-guided human mesenchymal stem cells”
Cellular and molecular life sciences 2006,vol 63 n°5 pp. 616-626
Le funzioni delle MSCs
• Supportare l’ematopoiesi
• Attrarre le HSC (hematopoietic stem
cells) circolanti nel midollo (homing)
• Immunosoppressione
• Riserva di cellule
• Produzione di sostanze bioattive
( magazzino!)
supportare l’ematopoiesi
Le MSC
supportano
l’ematopoiesi
attraverso
interazioni
cellula- cellula.
attrarre le HSC nel midollo
(homing)
effetto immunosoppressivo
Le MSC hanno un ruolo importante nella
maturazione dei linfociti T, B e NK e
delle cellule dendritiche.
Riserva di cellule
• Costituiscono una popolazione
residente nel midollo osseo capace di
differenziare in cellule del tessuto
adiposo, del tessuto cartilagineo, del
tessuto osseo e nello stroma che
supporta l’ematopoiesi.
Differenziamento osteogenico
Acido ascorbico
Desametasone
Β Glicerofosfato
MSCs
Osteoblasti
Differenziamento condrogenico
Acido ascorbico
Insulina
hTGFβ1
Poli- lisina
MSCs
Condrociti
Sostenze bio-attive
• Sostanze anti-apoptosi / citoprotettive
• Antifibrotiche
• Angiogenetiche
• Mitotiche
• ?????
Dove sono le MSCs ?
•
Tessuto adiposo
Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH: Multilineage
cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001, 7:211-228.
•
•
•
•
•
•
•
•
Periostio
De Bari C, Dell'Accio F, Luyten FP: Human periosteum-derived cells maintain phenotypic
stability and chondrogenic potential throughout expansion regardless of donor age. Arthritis
Rheum 2001, 44:85-95.
Membrana sinoviale
De Bari C, Dell'Accio F, Tylzanowski P, Luyten FP: Multipotent mesenchymal stem cells from
adult human synovial membrane. Arthritis Rheum 2001, 44:1928-1942.
Muscoli
Bosch P, Musgrave DS, Lee JY, Cummins J, Shuler T, Ghivizzani TC, Evans T, Robbins TD,
Huard J: Osteoprogenitor cells within skeletal muscle. J Orthop Res 2000, 18:933-944. ,
Derma
Young HE, Steele TA, Bray RA, Hudson J, Floyd JA, Hawkins K, Thomas K, Austin T, Edwards C, Cuzzourt J,
Duenzl M, Lucas PA, Black AC: Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the
connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal, adult, and geriatric donors. Anat Rec
2001, 264:51-62.
• Midollo osseo
•
Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig
S, Marshak DR: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999, 284:143-147.
• Le prime evidenze validanti l’esistenza di una
popolazione staminale mesenchimale nel
midollo risalgono al 1970. Friedstein mise in
coltura campioni di midollo osseo umano e dopo
4 ore allontanò le cellule non aderenti.
• Si erano formati piccoli foci di cellule
aderenti composti da 3-4 cellule; queste
cellule erano dormienti per circa 4 giorni e poi
cominciavano a proliferare. Dopo alcuni
passaggi in coltura queste cellule tendevano a
diventare più omogenee e dalla forma
affusolata.
MSC dal sangue periferico
• La possibilità di isolare MSC dal sangue periferico
(PB-MSC) è ancora molto dibattuta.
• La frequenza delle MSCs nel sangue è molto bassa,
tuttavia, sotto la stimolazione di citochine, ormoni e
fattori di crescita, che vengono secreti nel sangue
in diverse condizioni patologiche, il numero di
queste cellule aumenta.
•
• Non è chiaro la loro origine né la loro funzione in
vivo; è noto che le MSC possono ritornare dagli
organi periferici al midollo ma non è chiaro se
possano persistere nel sangue e costituire una
popolazione staminale residente.
Aspirato midollare
• Il midollo osseo contiene tre tipi
principali di cellule :
endoteliali
0,1 %
ematopoietiche 99,5%
MSC
0,4%.
Concentrazione dell’aspirato
midollare
• centrifugazione
• filtrazione selettiva
• concentrare la componente cellulare e
portare il volume a 6-10 cc con un
numero di cellule fino a 9 volte
superiore rispetto all’aspirato midollare
• ......ma da dove partiamo prima della
concentrazione ?
Il numero delle cellule
• Il fattore piu’
importante !
• Quante sono le MSC presenti
nel bacino del nostro
paziente?
Variabili
• 1) Variabilità individuale
Evento valutabile solo a posteriori
dopo il
prelievo
• 2) Sede del prelievo in uno stesso
individuo
Bacino
Variabili
• 3) Traumi recenti nella sede del prelievo
•
“ consumo “ delle cellule
4) Malattie endocrine
carenza estrogeni
5) Tabacco
L’uso di tabacco influenza sicuramente la vitalità
delle cellule mesenchimali e quindi il rischio di
ottenere meno cellule deve essere tenuto presente .
Non esistono al momento studi che mettano in
rapporto il numero di sigarette fumate e il numero
di MSCs
Variabili
• 6) Farmaci che influiscono sulla fisiologia del midollo osseo.
Chemioterapici
7) Tumori in fase attiva
In particolari per le neoplasie che elettivamente
metastatizzano alle ossa. E´ noto come le cellule stromali
mesenchimali tumorali (TDMC) che crescono accanto e
frammiste alle CT in molte neoplasie possano essere
parzialmente responsabili del loro sviluppo. L´interazione
reciproca tra CT e lo stroma mesenchimale circostante è
stata dimostrata nei tumori primari e nelle loro sedi
metastatiche ed in particolare nelle ossa. Le TDMC
forniscono un ambiente ottimale per la proliferazione delle
TC grazie al reciproco scambio di molecole solubili e della
matrice extracellulare, anche coinvolgendo cellule
endoteliali e cellule della risposta immune. Il rischio di
reclutare TDMC controindica questa procedura
Variabili
•
•
•
•
8) Abuso di alcool
9) Età e sesso
Sono le variabili piu’ studiate .
E’ stata analizzata la popolazione di cellule
mononucleate e dei progenitori degli
osteoblasti presenti nel midollo osseo di
individui di età differenti, suddivisi in
maschi e femmine per studiare se il sesso
e l’età possano influenzare la
concentrazione cellulare.
Variabili
Numero delle MSC s
maschi : decresce da 38 106
(30 aa) a 25.5 106 cells/ ml ( 70 aa)
femmine : decresce da 56 106
(30 aa) a 19.5 106 cells/ml (70 aa).
Muschler GF, Nitto H, Boehm C, Easley K. Age- and gender-related changes in the
cellularity of human bone marrow and the prevalence of osteoblastic progenitors. J
Orthop Res. 2001 Jan;19(1):117-25
E la funzione varia?
La partita è finita ........
Grazie a tutti !!