I metodi
•
•
•
•
RFLP
SSCP/DGGE/TGGE
Ibridazione con sonde oligonucleotidche
Sequenziamento Preceduti da amplificazione
Eventuale clonaggio
• DNA microarrays
• Pyrosequencing
Restriction fragment lenght polymorphism
(RFLP)
RFLP
Prodotto della PCR delle sequenza di interesse
Purificazione e quantificazione
Digestione con l’enzima scelto (concentrazione, tempo, temperatura)
Elettroforesi in gel di agarosio
Digestione con più enzimi di restrizione
Confronto di amplificati di ceppi diversi
SSCP
Normale
Denaturazione
Singoli filamenti
Forme differenti
per la presenza di
mutazioni
Mutato
T
A
G
C
T
G
A
C
Gel
Mobilità differente
Mutazione
SSCP
• Sensibilità:
– 70-95% mutazioni (<200 pb)
– 50% mutazioni (>400 pb)

Parametri:
–
–
–
–
–
Temperatura
Concentrazione del tampone
Concentrazione di acrilamidde
Presenza di additivi
Marcatori
DGGE/TGGE
• Diversa migrazione elettroforetica del
singolo filamento
– In gradiente di denaturazione chimico
– In gradiente di temperatura
DGGE
– Purificazione del prodotto della
PCR
– Determinazione del profilo di
melting e del gradiente di
denaturazione
• Formula di Fodde e Losekoot
– % di denaturante=(3,2xTm)182,4
– Clamp
DGGE
DGGE
• Vantaggi
– Alta sensibilità
– Sonde radioattive: NO
– Possibilità di ottimizzare il sistema

Svantaggi
– Tempi per la messa a punto del sistema
– Clamp
– Possibilità di ottimizzare il sistema
– Dimensioni dei frammenti (max 500 pb)
– Localizzazione mutazione: NO
Sequenziamento
• Metodo di Maxam e Gilbert

Limiti del Metodo
– Scarsa riproducibilità
– Materiale radioattivo
– Sequenze brevi
Sequenziamento
• Metodo di Sanger

Limiti del Metodo
– Scarsa riproducibilità
– Materiale radioattivo
– Sequenze brevi
Marcatura
• Fluorocromo dell’infrarosso
• Fluorocromi : fluoresceina, Texas red, ecc.
Sequenziatori automatici
• Modulo elettroforetico
– Raggio laser
– Fotodiodi
– Piastra termostatica
• Modulo per l’alimentatore
• Computer
– Software
• Controllo del sistema
• Analisi ed elaborazione dati
Sequenziatori
ABI PRISM 310, 3100, 8000
• Tecnologia per il sequenziamento
automatico in elettroforesi capillare
• Terminatori fluorescenti a trasferimento
di energia
• Cycle Sequencing
Sequenziatori
CEQTM2000, 8000 (BECKMAN)
• Cycle Sequencing
• Marcatori: ddNTP marcati in fluorescenza
• Tecnologia dell’elettroforesi capillare
DNA microarrays
“formati”
NanoChip electtronico
Each
test
site
is
electronically
connected to the NanoChip system by a
platinum wire.
NanoChipTM Molecular Biology Workstation (Nanogen,
San Diego, CA, USA)
100 siti testo (pads) array (NanoChip cartridge)
NanoChip elettronico
Pad
(elettrodi)
Connessioni
elettroniche
Pyrosequencing: principio
(DNA)n +dNTP
(DNA)n+1+ PPi
polymerase
Analisi dei dati
• Allineamento delle
sequenze
• Confronto con sequenze
di riferimento (banche
dati)
• Elaborazione dei dati
– NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov/)
– EMBL (www.emblheidelberg.de)
– Blast, Fasta, Phylip,
Neighbor-Joining Method
……………
NA004
TS003
TX011
GH1
TA278
N22
AL9621
AL9629
TKM1
AL983
AL985
AL9814
PMV
DGA9424
TKB6
DGA9922
DGA9926
DGA9917
PT3
PO52810
PO52813
DGA971
DGA9717
TKB555
BA5727
BA5728
PP50710
PP50718