Premesse e riepilogo
Lezione 1
By NA
Scopo del corso
Lo scopo di questo corso non e’ quello di imparare la clinica delle
malattie, ma capire come si sceglie un test diagnostico
nei casi di malattie che coinvolgono il materiale ereditario.
Quindi dovrete rinfrescarvi la Genetica fatta finora.
In questo corso parleremo di diagnostica e quindi
necessariamente dovremo parlare di malattie, ma ora come
sempre le malattie ci servono come modelli per capire le
strategie.
By NA
Cosa significa ricerca delle mutazioni.
Vi ricordo che mutazione significa semplicemente variazione
di una sequenza confrontata con una sequenza di
riferimento. Da questo ne consegue che mutazione non vuol
dire che ci sia un effetto patologico. Vi ricordo la
definizione di polimorfismo:variazione presente nella
popolazione con una frequenza superiore a 1%. Per
definizione un polimorfismo e’ innocuo, almeno finche’ non si
dimostra il contrario. E’ comunque vero che generalmente
quando si parla di mutazione si intende una variazione
patogenetica e il polimorfimo viene chiamato anche variante
allelica, tuttavia non e’ completamente corretto e noi
specificheremo sempre mutazione patogenetica o non
patogenetica
By NA
Mutazioni
Il genoma umano, come tutti i genomi e’ plastico: la sopravvivenza di una specie
dipende dalla sua variabilita’ e dalla capacita’ di evolvere. Il genoma umano e’ il
risultato di eventi di poliploidizzazione che hanno modificato drasticamente il
numero cromosomico. Le mutazioni cromosomiche di solito alterano il fenotipo
riducendo la fitness, e sono pertanto rare a livello costituzionale, ma frequenti a
livello somatico nei tumori. A livello molecolare si distinguono diversi tipi di
mutazione che ormai dovreste conoscere percio’ vi risparmio il loro elenco.
La variazione di una sequenza in una popolazione naturale non comporta
necessariamente l’insorgenza di un fenotipo anomalo. Quando si parla di alleli di
un locus questi sono il risultato di una mutazione che per caso, per effetto della
deriva genetica si sono fissati nella popolazione
Eterozigosi media per il DNA genomico umano: ~0,0037 (0,37%). Cio’
significa che in due alleli circa 1:250-1:1000 basi sono diverse
By NA
Mutazioni
 Va ricordato che le mutazioni avvengono a caso percio’ sia il DNA
codificante che il non codificante sono egualmente suscettibili. Le
conseguenze sono ovviamente diverse. Le conseguenze nella parte
codificante (che costituisce circa il 3% del genoma umano) sono legate al
tipo di mutazione e anche questo lo sapete.
Il tasso di mutazione del DNA codificante risulta piu’ basso rispetto
al non codificante in quanto la pressione selettiva agisce eliminando
dalla popolazione gli alleli negativi e rendendo di fatto assenti nella
popolazione quelle mutazioni che alterino pesantemente la funzione
del prodotto genico (per es. le “frameshift” piu’ frequenti nel non
codificante).
Le mutazioni del DNA non codificante hanno effetto se avvengono nelle
sequenze regolatrici o nelle sequenze introniche deputate allo splicing.
Anche in questo caso l’effetto dipende dal mantenimento della funzione.
By NA
Mutazioni
 Sostituzione silente: non determina alcun cambiamento nel prodotto:
l’amminoacido resta lo stesso. Dal momento che modifica la sequenza puo’
originare un RFLP. In qualche caso puo’ dare origine ad un sito di splicing
criptico e quindi essere tutt’altro che neutre come la semplice sequenza
potrebbe far pensare.
Sostituzione non senso: si origina un codone di stop. Dal momento che la
pressione selettiva e’ forte su un prodotto troncato prematuramente, sono
rare.

Sostituzione di senso errato:si origina un codone per un altro amminoacido
 conservativa : il nuovo amminoacido ha caratteristiche chimiche simili al vecchio.
Pertanto l’effetto sul prodotto puo’ essere minimo e puo’ essere definito polimorfismo
sia a livello di DNA che di prodotto.
 non conservativa: il nuovo ammnoacido e’ completamente diverso dal vecchio.
Puo’ avere effetti deleteri.
By NA
Mutazioni
Il tasso e il tipo di sostituzioni percio’ e’
estremamente variabile fra i diversi geni.
Alcune proteine come le ubiquitine hanno un
livello di conservazione totale nella scala zoologica
dall’uomo al lievito. La loro sequenza a livello di DNA
indica che le sostituzioni ci sono, ma sono
praticamente tutte sinonime.
All’estremo opposto ci sono geni pochissimo
conservati se non in brevi domini nell’evoluzione come
SRY. SRY ha una funzione chiave in tuttii mammiferi,
ma questa e’ demandata all’ HMG box, che corrisponde
a 78 aa. I segmenti N- e C- terminali sono
estremamente variabili, indicando che per la funzione
del gene questi segmenti non sono critici
By NA
Mutazioni dinamiche
Mutazioni dovute all’espansione di trinucleotidi localizzati nelle regioni
codificanti o non-codificanti di alcuni geni, si originano per errori nella
replica del DNA.
Non tutte le espansioni sono instabili. Se l’aumento di lunghezza non e’
eccessivo, e’ una mutazione patogena ma stabile nella trasmissione. Si
comportano cioe’ come le mutazioni “canoniche”, e seguono le leggi di
Mendel
Gene HOXD13 : l’espansione determina la formazione di lunghi tratti di
polialananina, e provoca sinpolidattilia. E’ rimasta stabile per 7 generazioni
 Quando una sequenza trinucleotidica
cambia le proprie
dimensioni da una generazione all’altra si parla di mutazioni
dinamiche
By NA
Mutazioni che alterano i meccanismi
epigenetici: Imprinting
Principio dell’equivalenza dei gameti: l’espressione di un gene non dipende dal
sesso del genitore che lo trasmette.
Esclusione allelica: in alcuni tipi cellulari viene espresso uno solo dei due
alleli, anche se entrambi sono in grado di esprimersi. Si ha una emizigosi
funzionale:linfociti B e immunoglobuline, geni dei recettori olfattivi nei
neuroni ....
By NA
Ricordiamo cosa non e’ e cosa e’ l’imprinting
L’eredita’ mitocondriale non segue il principio dell’equivalenza dei gameti, ma in
questo caso non si parla di imprinting: i gameti sono effettivamente non equivalenti
in termini di contenuto genico perche’ il gamete maschile non contribuisce alla
dotazione di mitocondri dell’embrione.
 L’eredita’ legata al sesso non segue
il principio dell’equivalenza dei gameti, ma
di nuovo i gameti sono effettivamente non equivalenti perche’ i cromosomi sessuali
non sono del tutto omologhi. L’espressione di un fenotipo dovuto a un locus
localizzato sui cromosomi sessuali dipende dal sesso della progenie.
Imprinting genomico: espressione differenziata di un
gene perfettamente funzionale legata all’origine
parentale, indipendente dal sesso della progenie, che
puo’ essere limitata nello spazio e nel tempo.
By NA
Mutazioni cromosomiche
Sono una categoria di mutazioni rara nel costituzionale, e il
piu’ delle volte sono patogenetiche. Possono provocare patologie
gravi a livello dell’individuo e quindi non vengono ereditate.
Oppure ridurre la fitness per la presenza di gameti sbilanciati,
ma possono venir trasmesse alla generazione successiva per la
loro tollerabilita’ in eterozigosi. Sono frequenti nei tumori,
dove possono indurre la tumorigenesi a causa della creazione di
geni ibridi, o perche’ portono alla sovraespressione di geni
By NA
Modifiche nella configurazione della cromatina
Il cambiamento di configurazione, legato ad un effetto di posizione
per un riarrangiamento, puo’ portare alla manifestazione di fenotipi
patologici:
Aniridia: silenziamento del gene PAX6
Distrofia Facioscapolomerale: una delezione di 3-4Kb elimina dalla
regione compresa fra due geni: FRG1 e FRG2, delle sequenze ripetute
denominate D4Z4. La perdita di queste sequenze porta questi due geni
normalmente localizzati in due domini diversi, a mappare nello stesso
dominio. L’assenza delle ripetizioni che interagiscono con proteine regolatrici
per modificare l’espressione di questi geni, comporterebbe un over
espressione, con conseguente fenotipo patologico
By NA
RIEPILOGO TECNICHE
By NA
SNP
•SNPs nella regione codificante di un gene, alterando la struttura di una
proteina, possono essere la causa di disordini monogenici ereditati in maniera
dominante
sono routinariamente usati a scopo diagnostico
• SNPs che alterano la struttura primaria di una proteina coinvolta nel
metabolismo di un farmaco
bersagli dell’analisi farmacogenetica
• SNPs nelle regioni non-codificanti del genoma, quindi senza impatto sul
fenotipo dell’individuo
By NA
markers usati in genetica di popolazione e negli studi di evoluzione
ASO (Allele
Specific
Oligonucleotide)
By NA
SSCP : Single Strand Conformational
Polymorphism
Omozigote Wild-type
PCR
Denaturazione
Eterozigote
A
T
A
T
C
G
A
T
C
G
C
G
A
C
G
C
G
C
G
Reverse
G
OmozigoteMutante
T
A
A
T
1
2
T
3
Reverse
T
A
Caricamento su gel
C
Omo WT
etero
Omo mut
Forward
Forward
VARIAZIONI ANCHE DI 1 SOLA BASE
PROVOCANO UNA DIFFERENZA NELLA
CORSA SU GEL
By NA
DGGE elettroforesi su gel in gradiente
denaturante
Si amplifica il DNA con primer alla cui estremita 5’ a monte e’ stata aggiunta una
coda di G. questa coda generera’ un allungamento della sequenza amplificata con
una serie di CG (40basi) che tenderanno a stabilizzare la molecola e aumentano la
capacita’ discriminante della corsa elettroforetica.
Si basa sulla selettivita’ del gel che deve essere in grado di creare un gradiente
di denaturazione molto stringente: L’INIZIO della denaturazione con formamide o
urea dipende dalla sequenza la variazione anche di una singola base puo’
modificare la risposta all’agente denaturante per cui una sequenza comincia a
denaturarsi prima o dopo quella di riferimento.
il limite della tecnica e’ la messa a punto delle condizioni sperimentali che
richiedono una accurata conoscenza della sequenza da testare.
La presenza della sequenza di riferimento in banca dati facilita la messa a punto
con questa tecnica e possibile individuare il 99% delle variazioni
By NA
DGGE elettroforesi su gel in gradiente
denaturante
GGGG
GGGG
GGGG
CCCC
GGGG
CCCC
Gel denaturante
GGGG
CCCC
GGGG
CCCC
By NA
Denaturazione crescente
Fig 7.7
DGGE schema II
By NA
DGGE gel
By NA
DGGE CFTR
By NA
DGGE esone 12 CFTR
By NA
DGGE -Thalassemia
Figure 1 shows ß-thalassemia samples
run on a parallel DGGE gel. The three
heterozygous samples in lanes 1–3 were
resolved into two heteroduplex and two
homoduplex bands. The heteroduplex
bands (upper bands) migrated slower
than the corresponding homoduplex
bands (lower bands). The wild-type
sample in lane 4 was resolved as one
band, and it migrated to the same
distance as the wild-type band in the
mutant samples. The ability to resolve
the heteroduplex fragments and the
mutant homoduplex fragment in the
mutant samples makes it possible to
distinguish between samples that are
mutant or wild type. From the results,
it was possible to detect single base
substitutions in the mutant samples from
the wild-type sample using parallel
DGGE.
By NA
DGGE Poliposi del colon
By NA
MLPA®Multiplex
By NA
Ligation Probe Amplification
MLPA®Multiplex
Each peak is the
amplification product of
a specific probe.
Samples are compared
to a control sample.
A difference in relative
peak height or peak
area indicates a copy
number change of the
probe target sequence
By NA
Ligation Probe Amplification
MLPA®Multiplex
Ligation Probe Amplification
Mismatch
Mismatch at the probe ligation site 
No ligation, no amplification product
Normal
By NA
Perfect match
Ligation of the two probe oligonucleotides
 Amplification product
MS-MLPA
M
M
Methylated Target
Denaturation and
Multiplex probe
hybridization
Ligation and
Digestion with
methylation
sensitive
endonucleases
Unmethylated Target
M
M
Only undigested (methylated) and ligated probes are exponentially amplified
By NA
MS-MLPA
12500
Control Undigested
ME028 PW / Angelman kit
10000
7500
5000
2500
Dye Signal
0
100
150
200
250
300
350
400
450
S ize ( n t)
40000
Control Hha1 digested
35000
Arrows indicate probes for imprinted
sequences (1 copy methylated)
30000
25000
20000
15000
10000
5000
Dye Sign
By NA
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
By NA
By NA
By NA
Il materiale didattico e’ presente in rete :
http://www.biologia.uniba.it/DIGEMI/Didattica.html
sono presenti anche i file PDF degli articoli necessari
per la preparazione
By NA