Corso Perfezionamento
Diagnostica Micobatteriologica Avanzata
Firenze 2009
Mycobacterium paratuberculosis ed
il Morbo di Crohn
R. Dei
Dipartimento Sanità Pubblica
Sezione Microbiologia
Università di Firenze
Mycobacterium paratuberculosis
Bastoncino alcol-acido resistente
Crescita molto lenta
Micobactina-dipendente
Colonie non pigmentate
pigmentate

ovini
Stevenson et al. JCM 2002;40:1798
Interesse in veterinaria
Paratubercolosi (Malattia di Johne)
M. avium complex
M.avium complex
M. avium subsp avium
M. avium subsp paratuberculosis
M. avium subsp silvaticum
M. avium subsp hominissuis
MAP
Rispetto a M.avium avium
MAP caratterizzato da
crescita più lenta
micobactina-dipendenza
host-range (ruminanti, altri mammiferi)
IS900
patogeno obbligato
analisi genomiche (DNA, 16SrRNA, ….)
indicano somiglianze di oltre il 90%
non distinguibili i profili HPLC
MAP - diagnostica
Ricerca del microrganismo
Risposta immunitaria
Metodi tradizionali
Metodi innovativi
Gold Standard  isolamento
MAP - isolamento/coltivazione
Decontaminazione
Terreni con micobactina/selettivi
Terreni tradizionali tempi lunghi
Herrold’s Egg Yolk Medium
Terreni innovativi accorciamento tempi
BACTEC
MIGIT
MAP - diagnostica indiretta
Ricerca di anticorpi
Antigene: estratti crudi, LAM, A36, PPA-3…
• Fissazione del complemento
• AGID
• ELISA
Ricerca produzione di -IFN
Cross-reattività tra antigeni micobatterici
MAP – diagnostica biomolecolare
IS900  1451 bp  proteina di 399 aa
Green et al. NAR 1990;17:9063
famiglie di elementi IS
sequenza specie-specifica presente in copie multiple nel
genoma di MAP
PCR, sonde
IS900-like in altri micobatteri distinguibili per profili di restrizione
Cousins et al., 1999. Englund et al., 2002.
Altri loci MAP specifici
ISMpa1, ISMav2, ISMap02, f57, …
Olsen et al., 2000. Strommenger et al., 2001. Stabel & Bannantine,
2005, Poupart et al., 1993. Bannantine et al., 2002.
Möbius P et al. Comparison of 13 single-round and nested
PCR assays targeting IS900, ISMav2, f57 and locus 255
for detection of Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis. VM 2008;12:324.
Crohn's disease is a chronic inflammatory process
primarily involving the intestinal tract. Although it may
involve any part of the digestive tract from the mouth
to the anus, it most commonly affects the last part of
the small intestine (ileum) and/or the large intestine
(colon and rectum).
Crohn B, Ginzburg L & Oppenhaimer G.
Reginal ileitis, a pathologic and clinical
entity. JAMA 1932; 99:1323
Dalziel TK. Chronic interstitial enteritis.
BMJ 1913;2:1068
Malattia di Crohn
Urbana
Insorge in età giovanile
Diarrea e perdita di peso
Manifestazioni varie
sottogruppi
Malattia di Crohn
Causa  stimolo flogosi cronica della mucosa
sconosciuta
multifattoriale
familiarità fattori genetici
clusters fattori ambientali
esposizione ad un fattore comune?
agente infettante?
Malattia di Crohn ipotesi infettiva
Indicazioni epidemiologiche di esposizione
ad una stessa sorgente di infezione
Aspetti istopatologici tipici di varie
enteropatie infettive
ulcere aftose della mucosa, ascessi
intramurali, fistole suppurative, granulomi,
interessamento linfonodale …
Somiglianze epidemiologico-cliniche con la
paratubercolosi
Chiodini CMR 1989;2:90
Trasmissibilità (Mitchell & Rees, 1970)
Malattia di Crohn e MAP
Van Patter, 1952
Chiodini et al. Possible role for Mycobacteria
in IBD. An unclassified Mycobacterium
species isolated from patients with Crohn’s
disease. DDS 1982;12:1073.
altri isolati con le stesse caratteristiche
patogeno per topo, non patogeno per cavia
patogeno per os per capra
• Mycobacterium paratuberculosis
Altri isolati indipendenti
Chiodini RJ. Crohn’s disease and the mycobacterioses: a
review and comparison of two disease entities. CMR
1989;2:90.
Medline MAP-MAP and Crohn’s disease
N Pubblicazioni
600
500
400
MAP
300
MAP&CD
200
100
0
al 1985
86-90
91-95
96-00
Anni Pubblicazione
01-05
06-08
Malattia di Crohn e MAP
Microscopia
AFB negatività  CWD
 Jeyanathan M et al. Visualization of Mycobacterium avium in
Crohn’s tissue by oil-immersion microscopy. MI 2007;9:1567
Isolamento
Metodiche biomolecolari
Risposta immunitaria
Criterio ex juvantibus
Collins MT et al. Diagnostic tests for Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis in patients with inflammatory bowel
disease and in controls. JCM 2000;38:4373-4381.
MAP nel latte
Animali sintomatici e asintomatici
Taylor et al. VR 1981;109:532. Sweeney et al. JCM 1992;30:166
Uomo
campioni da 2 CD e 5 controlli
crema e pellet in 12B* BACTEC e MIGT addizionati con
OADC, M J, PANTA
positivi i 2 pellet CD (MIGT dopo 12 sett)
Naser SA et al. AJG 2000;95:1094
MAP nel sangue
MAP nel sangue di animali
Uomo
Buffy coat da 28 CD, 9 UC e 15 controlli
MAP DNA
Isolamento
46% CD, 44% UC, 20% controlli
50% CD, 22% UC, 0% controlli
Naser et al. Lancet 2004;364;1039
Buffy coat da 27 CD, 34 UC e 80 controlli
MAP DNA
41% CD, 41% UC, 43% controlli
Elguezabal N et al. 8 ICP, 2005
MAP e Malattia di Crohn
Infezione molto diffusa tra gli animali
alimentare
respiratoria
Infezione diffusa anche tra gli uomini
esposizione agli animali
MAP diffuso nell’ambiente  acque
MAP nel latte, latticini, carne
resiste pastorizzazione
prodotti in commercio
MAP - Amebe
Rowe MT et al. 8 ICP, 2005
MAP sopravvive per almeno 24g a 25oC in A.castellani
e A.polyphaga
MAP intracellulare > resistenza al cloro
Mura M et al. AEM 2006;72:854
MAP sopravvive e si replica in A.polyphaga
Feller M et al. Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis and Crohn’s disease: a systematic
review and meta-analysis. Lancet ID 2007;7:607.
Malattia di Crohn e MAP
risposta al trattamento
Primi trials negativi o inconclusivi
antitubercolari
anti MAC più promettenti
 Trattamento antibiotico manterrebbe la
remissione da trattamento con corticosteroidi
 Trattamento con immunomodulatori
effetto antiMAP in vitro
Greenstein RJ et al. On the action of cyclosporine A, rapamycin and tacrolimus
on M. avium including subspecies paratuberculosis. PLoS 2008;3:e2496
Malattia di Crohn e MAP
risposta al trattamento
Selby et al. Two-year antibiotic combination therapy
with clarithromycin rifabutin and clofazimine for Crohn’s
disease. Gastroenterology 2007;132,2319.
Efficacia CLR 750mg/d RFB 450md/d CFZ 50mg/d
x 2 anni nel mantenere la remissione clinica
seguente al trattamento con corticosteroidi
213 pazienti (CDAI200)  prednisolone e CLRRFB-CFZ o placebo per 16 sett
Se in remissione (CDAI150)  prosegue
trattamento antibiotico
valutazione a 12, 24, 36 m
RESULTS: At week 16, there were significantly more
subjects in remission in the antibiotic arm (66%) than the
placebo arm (50%; P=.02). Of 122 subjects entering the
maintenance phase, 39% taking antibiotics experienced at
least 1 relapse between weeks 16 and 52, compared with
56% taking placebo (P=.054). At week 104, the figures
were 26% and 43%, respectively (P=.14). During the
following year, 59% of the antibiotic group and 50% of the
placebo group relapsed (P=.54).
CONCLUSIONS: Using combination antibiotic therapy with
clarithromycin, rifabutin, and clofazimine for up to 2 years,
we did not find evidence of a sustained benefit. This
finding does not support a significant role for
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in the
pathogenesis of Crohn's disease in the majority of
patients. Short-term improvement was seen when this
combination was added to corticosteroids, most likely
because of nonspecific antibacterial effects
Malattia di Crohn e MAP
risposta al trattamento
Peyrin-Biroulet L et al. Antimycobacterial therapy in
Crohn’s disease: game over? Gastroenterology 2007;
132:2594
Non valutata la presenza di MAP
Utilizzate dosi subterapeutiche
Non valutata risposta in relazione ai tratti
genetici di suscettibilità (NOD2, IL-23R)
Non valutata risposta in relazione all’impiego di
immunomodulatori
MAP e Malattia di Crohn
Juste RA et al. On the prevalence of Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis DNA in the blood of
healthy individuals and patients with inflammatory bowel
disease. PLoS 2008;3:e2537
MAP positivi
47/100 controlli e 40/246 (16%) IBD
17% dei 143 IBD trattati con mesalazina
6% dei 16 IBD trattati con sulfasalazina
Nessuno dei 20 IBD trattati con trattati con
metotrexato, CPX, Tacrolimus
 Effetto dell’impiego dei farmaci anti IBD
NOD2/CARD15
Gene nel cromosoma 16
sensori per riconoscimento patogeni e regolazione della
risposta infiammatoria ed apoptotica
Mutazioni
popolazione caucasica 15-20%
predisposizione a CD e alla Sindrome di Blau
30-50% dei soggetti CD
Girardin et al. Lessons from Nod2 studies: towards a link between
Crohn’s disease and bacterial sensing. Trend Immunol
2003;24:652.
Sindrome di Blau
Blau EB. Familial granulomatous arthritis,
uveitis and rash. JP 1985;107:689.
Dow CT. PCR evidence of MAP in Blau syndrome patient tissues.
8 ICP, 2005.