PRELIMINARY STUDY ON LOCALISATION OF MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSP.
PARATUBERCULOSIS IN UDDER OF SEROPOSITIVE EWES
STUDIO PRELIMINARE DELLA LOCALIZZAZIONE DI MYCOBACTERIUM AVIUM SUBSP.
PARATUBERCULOSIS NELLA MAMMELLA DI PECORE SIEROPOSITIVE
S. Preziuso, M.L. Marenzoni*, A.R. Attili, C. Valente*, V. Cuteri
Dipartimento Scienze Veterinarie, Università di Camerino, Italy
*Dipartimento di Patologia Diagnostica e Clinica Veterinaria, Università di Perugia, Italy
Key words: Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, ewes, udder, PCR, immunohistochemistry
Abstract
In order to evaluate the presence of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in milk and mammary
apparatus of seropositive ewes, samples of mammary gland and supramammary lymph nodes were collected
from 20 Comisana breed sheep. Milk of 14 out of 20 ewes was available for sampling. Intestine and mesenteric
lymph nodes were also collected in order to confirm MAP infection. Frozen samples were used for
bacteriological examination and PCR (IS900), and samples embedded in paraffin were tested by Ziehl-Neelsen
staining and immunohistochemistry (PoAb anti-MAP).
The MAP infection was confirmed by the detection of mycobacteria in intestine and mesenteric lymph nodes of
the 20 ewes. Ziehl-Neelsen staining and immunohistochemistry detected the mycobacteria respectively in 4 and
10 samples of mammary gland and in 12 and 13 samples of supramammary lymph nodes. MAP DNA was
detected by PCR in 16 samples of mammary gland, 20 of supramammary lymph nodes and 6 of milk; bacterial
isolation and identification was obtained from 17 samples of mammary gland.
The results demonstrated a frequent localisation of MAP in mammary gland and mainly in mammary lymph
nodes. PCR has proved to be more sensitive than the other methods used and the results confirm the possibility
of MAP transmission with milk. These data arouse interest in further investigations on mycobacteria spread via
udder and on evaluation of the sanitary risks for human health.
Introduzione
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) è un batterio acido resistente, a diffusione cosmopolita e
responsabile della paratubercolosi dei ruminanti. La paratubercolosi, o morbo di Johne, è un’enterite
granulomatosa cronica trasmessa principalmente per via oro-fecale e caratterizzata da diarrea intermittente e
dimagramento progressivo.
MAP è stato identificato in campioni di intestino di pazienti affetti da morbo di Chron, suggerendo una
correlazione tra il microrganismo e tale malattia dell’uomo (Chiodini, 1989).
Diversi studi hanno dimostrato che MAP non si localizza esclusivamente nel tratto intestinale, infatti il
micobatterio è stato rinvenuto anche nel latte di animali infetti, facendo ipotizzare che il morbo di Chron possa
essere associato al consumo di latte contaminato, sebbene gli studi finora condotti non permettano di supportare
né di escludere tale evenienza (Lund et al., 2002).
Una delle probabili vie di trasmissione dell’infezione sembra essere quella verticale, intrauterina o
transmammaria, come suggerito anche da studi condotti nella specie ovina (Lambeth et al., 2004). MAP è stato
inoltre isolato dal latte di due donne affette da morbo di Chron (Naser et al., 2000), dimostrando come questa
modalità di escrezione del batterio sia possibile anche nella specie umana.
Sono stati condotti molti studi per identificare e valutare diverse metodologie diagnostiche capaci di rilevare
MAP nel latte di animali infetti, ma poco è noto riguardo la modalità con cui MAP raggiunga il latte. Lo scopo
di questo studio era quello di approfondire le conoscenze riguardo la presenza di MAP nel tessuto mammario e
nei linfonodi tributari di pecore affette da paratubercolosi.
Materiali e metodi
E’ stata condotta un’indagine sierologica su un gregge di 680 pecore di razza Comisana con casi di
paratubercolosi clinicamente sospetta utilizzando un test ELISA (Idexx Laboratories).
Sulla base dei risultati ottenuti sono state selezionate 20 pecore sieropositive in lattazione. Da queste pecore, al
momento dell’abbattimento, sono stati prelevati campioni di ileo, linfonodi mesenterici, mammella e linfonodi
mammari. Al momento del campionamento è stato inoltre possibile prelevare 10 ml di latte da 14 dei 20
soggetti; ogni campione è stato suddiviso in due aliquote per l’esame batteriologico e per l’estrazione del DNA.
I campioni, congelati fino al momento dell’uso, sono stati utilizzati per gli esami batteriologici, seguendo la
metodica descritta da Valente et al. (1997) e per l’estrazione del DNA e successiva amplificazione di un
frammento IS900 di MAP mediante PCR.
Il DNA è stato estratto impiegando il kit “GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit” (Sigma-Aldrich)
ed il DNA isolato dalle mammelle, dai linfonodi mammari e dal latte è stato sottoposto ad amplificazione
mediante nested PCR come descritto da Englund et al. (1999). 25 l del mix di reazione contenevano 100 ng del
DNA genomico, 2,5 l di AccuPrime PCR buffer II, 0,5 l di AccuPrime Taq DNA Polymerase (Invitrogen) e
0,5
l di ogni primer 10
M. Nella prima reazione sono stati utilizzati i primer 5’TGATCTGGACAATGACGGTTACG-3’ e 5’-CGCGGCACGGCTCTTGTT-3’ per amplificare un segmento di
563 pb. Le condizioni di reazione erano: 2 min a 94 °C, 35 cicli di 30 sec a 94 °C, 30 sec a 60°C e 1 min a 68 °C.
1 µl del prodotto di reazione è stato utilizzato come stampo per la seconda reazione effettuata con i primer 5’AGCGTCTTTGGCGTCGGTCTTG-3’ e 5’-GCCGCGCTGCTGGAGTTG-3’. Le condizioni di reazione erano:
2 min a 94 °C, 35 cicli di 30 sec a 94 °C, 30 sec a 63°C e 1 min a 68 °C; i frammenti amplificati della grandezza
di 200 pb. sono stati visualizzati su gel di agarosio 1,5%.
Campioni di mammella e linfonodi mammari fissati in formalina ed inclusi in paraffina sono stati utilizzati per la
colorazione ematosilina-eosina (EE), per la colorazione Ziehl-Neelsen (ZN) e per l’ immunoistochimica (IIC).
L’immunoistochimica è stata effettuata mediante la tecnica avidina-biotina-perossidasi (Vector Laboratories)
utilizzando un anticorpo policlonale anti-MAP (Dako) alla diluizione 1:1000. Come substrato è stata utilizzata
diaminobenzidina e la colorazione di contrasto è stata ottenuta mediante immersione per 2 sec in ematossilina.
Per evitare false positività dovute alla presenza di perossidi o molecole di avidina e biotina nei tessuti, sono stati
effettuati passaggi preliminari rispettivamente per 1 ora in H2O2 al 3% e per 20 min ognuno in soluzioni di
avidina e di biotina (Vector Laboratories). Come controllo negativo sono stati utilizzati campioni prelevati da
una pecora non infetta, sieronegativa e negativa all’esame batteriologico per MAP.
Risultati
L’esame sierologico ha rilevato 29 ovini sieropositivi su 680 (4,3%), di cui 20 femmine in lattazione, 3 femmine
in asciutta e 6 maschi.
L’esame batteriologico e la PCR effettuati sui campioni di intestino hanno confermato l’infezione da MAP nelle
20 pecore esaminate.
L’esame istologico delle sezioni di mammella e linfonodi mammari non ha evidenziato alcuna lesione
microscopica.
La colorazione ZN ha permesso l’individuazione di bacilli acido resistenti in 4 dei 20 campioni (20%) di
mammella e in 12 dei 20 campioni (60%) di linfonodi mammari (tab. 1). E’ stata rinvenuta una modesta quantità
di microrganismi acido resistenti nel citoplasma di pochi macrofagi diffusi nel parenchima mammario (fig. 1) e
nei linfonodi mammari (fig. 2).
La reazione IIC ha individuato la presenza di MAP in 10 dei 20 campioni (50%) di mammella e in 13 dei 20
campioni (65%) di linfonodi mammari (tab. 1). Le cellule positive erano rappresentate da pochi macrofagi che
presentavano una omogenea colorazione marrone nel citoplasma e che erano sparsi nel tessuto mammario (fig.
3) e nei linfonodi mammari (fig. 4).
La PCR ha evidenziato la presenza del frammento IS900 di MAP in 16 dei 20 campioni (80%) di mammella, in
20 dei 20 (100%) campioni di linfonodi mammari e in 6 dei 14 campioni (43%) di latte (figg. 5 e 6; tab. 1).
L’esame batteriologico ha permesso l’isolamento e l’identificazione di MAP in 17 dei 20 campioni (85%) di
mammella (tab. 1).
Discussione e conclusioni
L’esame batteriologico e la PCR hanno permesso di evidenziare la presenza di MAP in un numero elevato di
campioni di mammella e linfonodi mammari, dimostrando una frequente localizzazione del micobatterio in
queste sedi.
In precedenza Sweeney et al. (1992) hanno isolato MAP in 22 degli 81 campioni (27%) di linfonodi mammari
prelevati da bovine infette ma asintomatiche, mentre scarsi sono i dati disponibili riguardo l’evidenziazione di
MAP nel tessuto mammario (Awad-Masalmeh et al., 1999).
La colorazione ZN e l’IIC hanno permesso l’evidenziazione di MAP in un numero più ridotto di casi rispetto alla
nested PCR, e questo potrebbe essere dovuto alla presenza di una bassa carica batterica nei tessuti. L’IIC ha
individuato un numero maggiore di cellule e di campioni positivi rispetto alla colorazione ZN probabilmente
grazie all’amplificazione chimica del segnale ottenuta dall’utilizzo del complesso molecolare avidina-biotinaperossidasi. L’IIC si è dimostrata meno sensibile della PCR e dell’esame batteriologico, ma ha permesso di
visualizzare la localizzazione di MAP nel contesto del tessuto e di riconoscere come macrofagi tutte le cellule
risultate infette.
La PCR ha permesso di rilevare il frammento IS900 di MAP solamente in 6 campioni su 14 (43%), in quanto, in
alcuni casi, la quantità di latte disponibile per l’estrazione del DNA era modesta.
Le modalità con cui gli agenti patogeni possono raggiungere il latte sono rappresentati principalmente da
contaminazione fecale, infezione mammaria o disseminazione linfo-ematogena mediante macrofagi infetti. In
questo studio non sono state rilevate alcune lesioni mammarie, e la localizzazione di MAP nei linfonodi
mammari appare molto frequente, facendo pensare che la patogenesi linfogena sia quella più probabile.
Il lavoro ha permesso di rilevare MAP, mediante PCR ed esame batteriologico, nella maggior parte dei campioni
di mammella e linfonodi mammari analizzati, confermando l’efficacia diagnostica di queste tecniche e
sottolineando come il rischio di escrezione di MAP con il latte possa essere frequente. I meccanismi con cui tale
escrezione avvenga rimangono in parte da chiarire, e la loro conoscenza sarebbe di fondamentale importanza per
una valutazione più accurata del rischio di trasmissione di MAP sia all’uomo che agli animali.
Riferimenti Bibliografici
1. Awad-Masalmeh M, Zimpernik I, Baumgartner W, Hinterdorfer F, Flatscher J. (1999) Detection of
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (M. p.) by the polymerase chain reaction (PCR) and
culture experiments in animals in Austria. Berl Munch Tierarztl Wochenschr, 112: 211-215
2. Chiodini RJ (1989) Crohn’s disease and mycobacteriosis: a review and comparison of two disease entities.
Clinical Microbiol Rev, 2: 90 –117.
3. Englund S, Ballagi-Pordany A, Bolske G, Johansson KE (1999) Single PCR and nested PCR with a mimic
molecule for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Diagn Microbiol Infect Dis,
33(3):163-171.
4. Lambeth C, Reddacliff LA, Windsor P, Abbott KA, McGregor H, Whittington RJ (2004) Intrauterine and
transmammary transmission of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in sheep. Australian
Veterinary Journal, 82(8):504-508.
5. Lund BM, Gould GW, Rampling AM (2002) Pasteurization of milk and the heat resistance of
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: a critical review of the data. International Journal of Food
Microbiology, 77: 135-145.
6. Naser SA, Schwartz D, Shafran I (2000) Isolation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis from
breast milk of Chron’s disease patients. AJG, 95(4): 1094-1095.
7. Sweeney RW, Whitlock RH, Rosenberg AE (1992) Mycobacterium paratuberculosis cultured from milk and
supramammary lymph nodes of infected asymptomatic cows. Journal of Clinical Microbiology, 30(1): 166171.
8. Valente C, Cuteri V, Quondam Giandomenico R, Gialletti L, Franciosini MP (1997) Use of an experimental
chicks model for paratuberculosis enteritis (Johne's disease). Vet Res, 28: 239-246.
Pecora
ZN
IHC
PCR
es. batteriologico
n.
MM
LNMM
MM
LNMM
MM
LNMM
latte
MM
1
+
+
+
+
+
n.d.
+
2
+
+
3
+
+
+
+
+
+
+
4
+
5
+
+
+
+
+
+
6
+
+
+
+
+
+
+
+
7
+
+
+
+
+
n.d.
+
8
+
+
+
+
n.d.
+
9
+
+
+
10
+
+
+
+
+
+
+
11
+
+
+
+
+
+
+
12
+
n.d.
+
13
+
+
+
14
+
+
+
+
+
+
+
+
15
+
+
+
16
+
+
+
+
+
n.d.
+
17
+
+
+
+
+
18
+
19
+
+
+
+
n.d.
+
20
+
+
+
+
+
Tab. 1: risultati della colorazione ZN, della reazione IIC, della PCR e dell’esame batteriologico su
campioni di mammella (MM), linfonodi mammari (LNMM) e latte di pecore sieropositive per
paratubercolosi; (n.d.) campione non disponibile
Fig. 1: mammella, cellule positive alla
colorazione ZN (barra 50 µm)
Fig. 2: linfonodo mammario, cellule positive
alla colorazione ZN (barra 75 µm)
Fig. 3: mammella, cellule positive alla
reazione IIC per MAP (barra 40 µm)
Fig. 4: linfonodo mammario, cellule positive
alla reazione IIC per MAP (barra 25 µm)
Fig. 5: PCR mammella
Fig. 6: PCR latte