BKV:Analisi quantitativa
mediante RealTime PCR
Firenze 20 Novembre 2004
Web:www.genedia.it
La Reazione di PCR
5’
3’
5’
3’
DNA Templato
d.NTPs
Primers
DNA TAQ Polymerase
Aggiungere Master Mix
e Campione
Aggiungere al Tubo di reazione
Denaturazione
Annealing
La Reazione di PCR
3’
5’
5’
3’
Annealing
Taq
3’
5’
5’
3’
Taq
Inizio Estensione
Taq 5’
3’
Fine Estensione
Taq
3’
Repliche
La Reazione di PCR
3’
3’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
Ciclo 2
4 Copie
3’
3’
3’
3’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
Ciclo 3
8 Copie
3’
3’
Cicli
Quantità Relativa
(x)= numero iniziale di copie
1
2
3
4
5
6
7
8
9
2
4
8
16
32
64
128
256
512
11
12
13
14
15
16
17
18
19
2048
4096
8192
16384
32768
65536
131072
262144
524288
21
22
23
24
25
26
27
28
29
2097152
4194304
8388608
16777216
33554432
67108864
134217728
268435456
536870912
10
20
30
1024
1048576
N-1
Y = X (1+)
Y =
X =
 =
N =
1073741824 ….……..
Quantità Finale di DNA Amplificato
Quantità di DNA portato in PCR
Efficienza di Amplificazione
Numero dei Cicli
Curva di Amplificazione-PCR
• Incremento
• Incremento
Limitato
• Plateau
• Il plateau
Esponenziale
non è correlato
alla quantità iniziale di DNA
Teorico
Log. DNA Amplificato
Esponenziale
segue quello Lineare
Reale
Cicli #
Amplified DNA copy number
Curva di Amplificazione-PCR
Fase
Esponenziale
Fase Plateau
Cycle number
Qual è l’intervallo migliore per
ottenere informazioni di tipo
quantitativo?
• Durante la fase esponenziale:
- Non c’è nessun fattore limitante
- I prodotti di amplificazione si formano alla
stessa velocità
- Bisogna monitorare la reazione così come
avviene!
Cos’è la Real Time PCR?
E’ una tecnica per monitorare la reazione di
amplificazione così come avviene.
E’ una tecnica basata sulla Fluorescenza:
l’emissione della fluorescenza è direttamente
correlata alla quantità di DNA amplificato.
Perchè la Real Time PCR?
Per quantificare il DNA
(e per l’analisi e detezione di mutazioni)
96 repliche di una identica reazione
possono avere singole efficienze molto
diverse in prossimità della fine del
processo, ma..
..ma il Ciclo Soglia (Threshold Cycle,Ct) di
tali repliche mostra valori molto simili.
Che cos’è il Ciclo Soglia (CT)?
Il Ciclo Soglia (CT) è il ciclo della Reazione di Amplificazione
in corrispondenza del quale il segnale di fluorescenza
emesso dal campione supera il valore della threshold.
2
Threshold
Baseline
Sample
1.6
1.2
0.8
CT
0.4
0
0
10
20
21
30
40
Ciclo Soglia (CT)
 E’ strettamente correlato con la quantità iniziale di copie di
DNA.
 E’ lineare con il log del numero iniziale di copie fino a 6 o
più ordini di grandezza.
Qual è la
quantità
maggiore ?
Quella
Minore?
Ciclo Soglia (CT)
BKV c/ml
1.53E+06
1.53E+05
7.65E+04
3.82E+04
Ct
22.70
25.86
26.84
28.02
100 ml di urina estratta
Il Ciclo Soglia CT è un indicatore
del numero iniziale di copie.
Analisi quantitativa: calcolo efficienza di PCR
 = [10(-1/s)] - 1
dove  = efficienza
s = slope
se s = -3.3222
 = 1.00 (100%)
se s = -2.91
 = 1.21 (121%)
se s = -3.60
 = 0.9 (90%)
Per diluizioni seriali:
CT2-CT1= log (N1/N2)/log (1+ )
dove: N1/N2 = fattore di diluizione
CT1 e CT2 = rispettivi cicli soglia
se N1/N2 = 2
e  =1, CT2-CT1= 1
se N1/N2 = 10 e  =1, CT2-CT1= 3.322
Curva di calibrazione per BKV
Come possiamo mettere a
punto una tecnica di
Real Time PCR?
Quale chimica possiamo usare?
Intercalanti
•Russ Higuchi ha dimostrato il principio
chiave della Real Time PCR usando Bromuro
di Etidio
EtBr emette fluorescenza fino a 25 volte
quando si lega al dsDNA
•Il SYBR Green, un intercalante più sensibile,
fornisce un approccio maggiormente
interessante
SYBR Green emette fluorescenza fino a
200 volte quando si lega al dsDNA
Intercalanti
5’
3’
5’
3’
d.NTPs
Primers
Templato
Intercalanti
Thermal Stable
DNA Polymerase
Aggiungere la
Master Mix al
campione
Tubo di reazione
Taq
l
ID
Annealing
Denaturazione
Intercalanti
3’
5’
5’
3’
ID
3’
5’
ID
Taq
ID
Taq
l
ID
Estensione
3’
l
ID
ID
5’
ID
l
l
3’
Taq
ID
Annealing
ID
ID
Taq 5’
3’
Estensione Terminata
Si applica una eccitazione
(a 490 nm per SYBR Green)
l
Emissione (a 540 nm per SYBR Green)
Curva di Dissociazione
•Eseguire una Curva di Dissociazione alla fine
di un esperimento di Real Time PCR in cui si
utilizza SYBR green, consente di vedere se è
presente una sorgente non specifica di
fluorescenza nella PCR.
•Senza Curva di Dissociazione non si ha la
certezza che la fluorescenza osservata è
correlata realmente al frammento atteso.
Curva di Dissociazione
Che cosa è?
 La Curva di Dissociazione determina un
progressivo incremento della temperatura
finchè la doppia elica del DNA si apre
completamente
 Questa temperatura viene detta “Tm”
(temperatura di Melting) ed è caratteristica
per ogni frammento di DNA.
 Il Tm dipende infatti dal N° e dal tipo di basi
presenti
Curva di Dissociazione
Come si può determinare la temperatura di melt?
 Si sfrutta il fatto che il SYBR Green emette
fluorescenza maggiormente quando è legato
al dsDNA piuttosto che quando è legato al
ssDNA.
 Così, man mano che la temperatura aumenta i
filamenti del DNA si aprono, ed il segnale di
fluorescenza decade.
La riduzione della fluorescenza
all’aumentare della temperatura
Si può vedere
direttamente la
riduzione della
fluorescenza
all’aumentare della
temperatura
(in Real Time!)
Rivelazione di amplificati
non specifici
Amplificato
BKV
Aspecific
o
Qual è la temperatura migliore per acquisire
la fluorescenza nelle determinazioni
quantitative?
Set-up utilizzato per la determinazione
quantitativa di BKV
10 µl DNA estratto+ 40 µl Master MIX
Composizione Master Mix
H2O
qb a 40 µl
RealT.Buffer
15 µl
Primer BK1(25 µM)
1 µl
Primer BK2(25 µM)
1 µl
MgCl2(25 mM)
6 µl
Taq Gold (5 U/µl)
0.5 µl
UDG heat-lable (1U/µl)
1 µl
Set-up utilizzato per la
determinazione quantitativa di BKV
1 ciclo
20°C
10 min
94°C
6 min
2 cicli
94°C
1 min
55°C
1 min
72°C
1 min
40 cicli
94°C
30 sec
55°C
30 sec
72°C
30 sec
Curva di melt
da 55°C a 95°C (incremento 0.5°C)
Storage
72°C
82°C
10 sec
lettura
Disegno dei primers (BK1/BK2)
Lunghezza amplificato (compresi primers BK1 e BK2): 366 bp Lunghezza
BK1:36 bp Lunghezza BK2: 25 bp
Sequenza Virus BKV DN
1ttttgcaaaa
attgcaaaag
aatagggatt
tccccaaata
gttttgctag
gcctcagaaa 61
aagcctccac
acccttacta
cttgagagaa
agggtggagg
cagaggcggc
ctcggcctct 121
tatatattat
aaaaaaaaag
gccacaggga
ggagctgctt
acccatggaa
tgcagccaaa 181
ccatgacctc
aggaaggaaa
gtgcatgact
cacaggggaa
tgcagccaaa
ccatgacctc 241
aggaaggaaa
gtgcatgact
cacagggagg
agctgcttac
ccatggaatg
cagccaaacc 301
atgacctcag
gaaggaaagt
gcatgacaga
catgttttgc
gagcctagga
atcttggcct 361
tgtccccagt
taaactggac
aaaggccatg
gttctgcgcc
agctgtcacg
acaagcttca 421
etc………….
Foto gel amplicone (366 bp)
POS
POS
POS
MVIII
POS
POS
NEG BIANCO
Conclusioni (riproducibilità)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
media
ds
data
22/10/02
23/10/02
25/11/02
02/03/03
14/03/03
17/03/03
29/05/03
18/07/03
09/10/03
29/09/03
12/01/03
23/01/04
04/01/04
05/12/04
09/07/04
28/10/04
Slope
-3.104
-3.347
-3.662
-3.04
-3.355
-3.318
-3.341
-3.617
-3.799
-3.399
-3.125
-3.105
-3.266
-3.582
-3.072
-3.311
efficienza PCR(%)
99%
98.90%
87.50%
113.30%
98.60%
100.20%
99.20%
89%
83.30%
96.90%
108.90%
109.90%
102.40%
90.20%
111.60%
100.50%
Coeff. correlazione
0.980
1.000
0.998
0.992
0.993
1.000
0.999
0.994
0.999
0.993
0.985
0.995
0.990
0.973
0.999
0.995
-3.34019
0.228
99.36%
0.088
0.993
0.008
Conclusioni (linearità)
E05
E07
D04
D07
D06
C11
D02
C10
G02
D05
C08
F02
D03
C09
E02
C07
C05
C06
F07
F11
C03
F09
C04
B02
B03
C02
B05
F06
B06
B07
E06
F08
F04
E03
G05
G03
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Standard
Standard
Unknown
Standard
Unknown
Standard
Standard
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
Unknown
E08
Unknown
3.87E+09
29924S
30000U
299965U
29918U
30022U
30018U
15.34
15.53
15.95
16.12
16.31
16.89
17.28
17.38
17.6
17.7
17.71
18.19
18.32
19
20.25
20.84
22.07
22.34
22.49
23.38
23.97
25.34
25.47
26.58
27.77
28.86
29.26
29.87
30.71
31.66
34.5
35.13
35.7
35.78
37.26
37.33
29997S
38.09
5.19E+02
29923U
29996U
1:10 RISOSPENSIONE A
1:10 RISOSPENSIONE D
1:10 RISOSPENSIONE C
1:2 RISOSPENSIONE B
1:2 RISOSPENSIONE C
1:2 RISOSPENSIONE A
30016U
1:10 RISOSPENSIONE B
1:10 RISOSPENSIONE A
29959U
1:2 RISOSPENSIONE D
1:10 RISOSPENSIONE B
29915U
1:2 RISOSPENSIONE B
1:10 SURNATANTE B
1:2 RISOSPENSIONE A
29994U
30012U
1:2 SURNATANTE B
30004U
1:10 SURNATANTE A
1:2 SURNATANTE A
29977U
3.40E+09
2.53E+09
2.24E+09
1.98E+09
1.32E+09
1.00E+09
9.36E+08
8.06E+08
7.52E+08
7.43E+08
5.34E+08
4.86E+08
3.04E+08
1.27E+08
8.42E+07
3.58E+07
2.97E+07
2.69E+07
1.44E+07
9.56E+06
3.70E+06
3.38E+06
1.53E+06
7.65E+05
3.20E+05
1.91E+05
1.59E+05
9.56E+04
4.78E+04
6.32E+03
4.08E+03
2.74E+03
2.59E+03
9.23E+02
8.83E+02