Classification of cell death
Cell death
Physiological
Necrotic
apoptosis
Caspase-dependent
receptor-caspase 8
autophagic
other
Caspase-independent
mitochondria-caspase 9
Il segnalamento
apoptotico
Two lymphocytes
Healthy
Staurosporin-treated HeLa cells
Apoptosi
s Apoptosi
s
Apoptoti
c
Weinberg Fig 9.18 Different parts of the
apoptotic programme. Markers for the
process.
Fragmentation of DNA
Pyknotic
nuclear
fragments
Apoptotic
cell
Phagocytosis of apoptotic bodies
Fragmentation of Golgi bodies
Phosphorylation of Histone 2B
Apoptosi
•
•
Caratteristiche morfologiche associate a morte cellulare che
portano alla dissoluzione della cellula e alla fagocitosi.
Caratteristiche biochimiche associate a morte cellulare
– Frammentazione del DNA a livello internucleosomale con
formazione di frammenti di 200bp e multipli
– Alterazione della compartimentalizzazione di lipidi di
membrana con esposizione della fosfatidilserina e altre
proteine riconosciute dai fagociti
Apoptosi: frammentazione del DNA
Via estrinseca
o citoplasmatica
APOPTOSI
Famiglia
Bcl-2
Fas:fasL
recettori della morte
Via intrinseca
o mitocondriale
bid
rilascio di citocromo C
Via finale comune:
Attivazione di una cascata di proteasi (CASPASI)
Proteolisi di molecole regolatorie e strutturali
L’apoptosi può cominciare a seguito di diversi stimoli quali:
1. Deprivazione di fattori di crescita
2. Radiazioni UV e g
3. Chemioterapici
4. Recettori della morte (famiglia TNFR)
I RECETTORI DELLA MORTE
TNF-R1 (CD120a)
CD95 (APO-1:Fas)
DR3 (APO-3, LARD, TRAMP, WSL1)
TRAIL-R1 (APO-2, DR4)
TRAIL-R2 (DR5, KILLER, TRICK2)
DR6
possiedono un dominio
intracellulare definito “death
domain” (DD), essenziale per la
trasduzione del segnale apoptotico
MEMBRANA
CELLULARE
DD
Segnalamento apoptotico-Ruolo della Matrice Extracellulare
I ligandi dei recettori della morte sono trimeri di membrana che vengono
rilasciati da metalloproteinasi di matrice (MMPs)
LIGANDI:
TNFa
prodotto da monociti/macrofagi
TWEAK (APO-3L)
FasL
FasL-Fas system = linfociti T citotossici
Linfotossina (LTa, LTb) prodotti da linfociti attivati
LIGHT
TRAIL (APO-2L)
TNFa
MMP
MMP
TNFR
A seguito della trimerizzazione i recettori
della morte legano tramite i domini DD
delle “molecole adattatrici”:
FADD/Mort1
RIP
TRADD
Fas-Associated-Death-Domain protein
Receptor-Interacting-Protein
TNF-Associated-Death-Domain protein
FADD
TRADD
RIP
Legame di FASL al suo recettore
Induzione di trimerizzazione
Reclutamento di Fadd e di caspasi 8
(DISC: death-inducing signalling
Complex)
Attivazione di caspasi 8
Il segnalamento apoptotico -
Gli enzimi “Caspasi”
Le caspasi vengono divise in iniziatori e effettori. Le proteine adattatrici legano le
caspasi “iniziatrici” connettendo il recettore al “macchinario apoptotico effettore”
costituito da una sequenza di caspasi
Caspasi-10 - 8
DED = Death Effector
Domain
Caspasi-9 - 4 - 2 - 1
CARD = Caspase Recruitment
Domain
DEDD
TRADD
FADD
RIP
APAF = Apoptopic
Proteases Activating
Factors
Caspasi-7 - 6 - 3
Effettori Apoptotici
Caspasi-14 - 13 - 12 - 11 -5
Processamento di citochine
prima della secrezione
Tutte le caspasi sono sintetizzate come zimogeni, e necessitano di essere
attivate da taglio proteolitico. L’enzima attivo è un eterotetramero formato da 2
subunità catalitiche di circa 20 kDa e da 2 subunità di circa 10 kDa
Pro-Caspasi-8
Pro-Caspasi-8
FADD
FADD
Attivazione
autoproteolitica
Attivazione
autoproteolitica
Caspasi 8
Le caspasi iniziatrici attivano le esecutrici eventualmente portando
la cellula in apoptosi
TNF
TNFR
Pro-Caspasi-8
FADD
TRADD
TRAF
APOPTOSI
Pro-Caspasi
3/6/7
Caspasi-3/6/7
Caspasi-8
Le
IAP (inhibitor of apoptosis) costituiscono una
importante classe di regolatori dell’apoptosi
IAP-1 e IAP-2
XIAP
(X-chromosome-linked inhibitor apoptosis protein )
Survivin
ML-IAP
Bruce
Livin
cIAP-1 e -2 si legano ai TRAFs (TNF-receptor associated factors) 1 e 2
Survivin é implicata nel controllo del ciclo cellulare
XIAP inibisce le caspasi-3, -6 e -7
ML-IAP inibisce le caspasi-3, -7, -9
• Modulatori delle IAP
– Inibitori degli inibitori
– Smac/Diablo
La famiglia delle proteine Bcl-2 (B cell lymphoma gene 2)
Più di 30 regolatori dell’apoptosi, comprendono INIBITORI e PROMOTORI
Si localizzano sulla membrana mitocondriale esterna, del reticolo
endoplasmico e del nucleo
Promotori di apoptosi:
Bax
Bak
Bok
Bad
Bim/Bod
Bid
DIMERI
Proteine anti- e pro-apoptopiche Bik/Nbk/Blk
Bmk
formano eterodimeri regolatori.
Hrk/DP5
I livelli relativi di queste proteine
possono decidere se la cellula
Noxa
muore o sopravvive
Puma/Bbc3
Inibitori di apoptosi:
Bcl-2
Bcl-XL
Bcl-xs
A1
Boo
Mcl-1
Il segnalamento apoptotico – La famiglia delle proteine Bcl-2
Pro-Sopravvivenza
Bcl2
Bcl-XL
Bfl-1
Bcl-W
Mcl1
Famiglia
Bcl2
Pro-Apoptosi
Famiglia
Bax
(“formatori di canali/pori mitocondriali”)
Famiglia
BH3-only
Bax
Bak
Bok
Bid
(“sentinelle dell’apoptosi”)
Bad, Bim,
Bik, Bmf,
Hrk, Noxa,
Puma
Bad, Bim and Bid sono mantenute inattive in cellula e, se attivate da segnali
citotossici, si legano ad altre proteine apoptotiche
Cellula
sana
Deprivazione
di Mitogeni
Iniziazione
dell’apoptosi
Membrana
Mitocondriale
esterna
Transienti di [Ca2+]
Taxolo
Deprivazione di
mitogeni
Effetti pro-apoptotici del Calcio
14-3-3 sequestra BAD
Bad
Apaf-1
P
Chinasi
Akt/PKB
PKA
Apaf-1
SOPRAVVIVENZA
Fosfatasi
Calcineurina
Bad
Bad
MORTE
Le “BH3-only” nell’attivazione dell’apoptosi
Segnale apoptotico
BH3
only
BH3
only
Cyto C
Bid. Bad.
Bim. Bik.
Bmf. Hrk.
Noxa.
Puma.
Molti stimoli apoptotici sono in grado di avviare l’apoptosi attraverso una via
mitocondriale
Mitocondrio
Rilascio del citocromo c dallo
spazio intermembrane e rilascio di
Apaf-1 (Apoptopic Proteases
Activating Factor) che smaschera
il dominio CARD di Apaf-1
Cyto-C
Radiazioni, stress
DEX, staurosporina
deprivazione mitogeni
Ceramide
p53
Bcl-2
APAF-1
card
Cyto-C
APAF-1
card
Procaspasi-9
ATP
Cyto-C
caspasi-9
card
APAF-1
APOPTOSOMA
Apoptosi tramite recettori della morte e mitocondrio - modello 1
TNF
TNFR
Il citocromo c è rilasciato anche a seguito di
attivazione dei recettori della morte a causa
dell’attivazione di Bid da parte di caspasi 8
Neutralizzazione
Bax
di Bax o Bak tBid
Pro-Caspasi-8
FADD
TRADD
Bcl-2
Bcl-xL
TRAF
tBid Bax
Bax
Bak
Bid
tBid
Bcl-2
Bcl-xL
tBid Bak
Cyt C
tBid Bax
tBid Bak
tBid Bax
tBid Bax
tBid Bak
tBid Bak
Cyt C
Apoptosi tramite recettori della morte e mitocondrio - modello 2 – il PTP
Il cit c è rilasciato anche attraverso il PTP. Dal
mitocondrio vengono rilasciati anche
TNF
Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 e AIF
TNFR
Pro-Caspasi-8
FADD
TRADD
TRAF
Bak
Bax
Bid
Bcl-2
Bcl-xL
tBid
Omi/HtrA2 = serina-proteasi
Smac/DIABLO = second mitochondriaderived activator of caspases/direct IAPbinding protein with low pI
AIF = Apoptosis Inducing Factor
(attivatore di endonucleasi)
tBid Bax
AIF
tBid Bak
Cyt C
Cyt C
Omi/HtrA2
Smac/Diablo
Omi/HtrA2
VDAC ANT
VDAC ANT
PTP
Smac/Diablo
AIF
canale anionico voltaggio-dipendente
traslocatore di adenin nucleotide
sopravvivenza
apoptosi
Smac/DIABLO = second
mitochondria-derived activator
of caspases/direct IAP-binding
protein with low pI
Smac/Diablo
Omi/HtrA2
Omi/HtrA2 = serina-proteasi
ROS indica i metaboliti parzialmente ridotti dell’O2.
Alcuni di loro tipo O2•- (anione superossido) e OH•(radicale idrossilico o ossidrile), possono essere
definiti come veri radicali liberi. Altri ROS, tipo H2O2,
sono più propriamente pro-ossidanti.
O2•-, •OH- e H2O2 sono i ROS più rilevanti in
condizioni fisiologiche e patologiche
Mitocondri
Circa il 1-5% degli elettroni che “fluiscono” nella catena
respiratoria possono essere dirottati a realizzare O2•- a
livello del complesso I (NADH/ubiquinone ossidoriduttasi)
e complesso III (ubiquinol/citocromo c ossidoriduttasi).
O2•- viene poi convertito da SOD mitocondriale in H2O2,
che si riversa nel citoplasma.
NADPH ossidasi
NOX è costitutivamente attivo e produce livelli molto
bassi di ROS; in risposta a vari fattori cellulari l’attività di
NOX aumenta e aumenta la produzione dei ROS
Lo stress ossidativo attiva numerose e
importanti vie di trasduzione dei segnali
ROS producono effetti diversi in base alla severità
del danno, al tipo di cellula e alla durata
dell’esposizione. In genere, basse dosi di ROS, in
particolare perossido d’idrogeno, sono mitogenici e
promuovono la proliferazione cellulare; dosi
intermedie provocano un temporaneo o
permanente blocco della crescita
ROS modulano la funzione di molti enzimi (box)
e fattori di trascrizione (ovali) tramite molti
segnalamenti intracellulari. Questi segnali
cambiano l’espressione genica influenzando la
sopravvivenza ela morte
HSF1, heat shock transcription factor 1