MORTE CELLULARE
• apoptosi
• necrosi
• senescenza
• autofagia
• catastrofe mitotica
NECROSI
• è una morte passiva, non fisiologica
• il danno primario è a livello della membrana plasmatica
• aumento del volume cellulare a causa della perdita di controllo del flusso
ionico (richiamo di H2O)
• formazione di microvescicole
• lesioni a carico degli organelli intracellulari
• alterazioni a livello cromatinico
• lisi cellulare per dissoluzione della membrana
• riversamento dei componenti intracellulari nello spazio extracellulare
• reazione antiinfiammatoria
CELLULA NECROTICA
APOPTOSI
Processo fisiologico di eliminazione delle
cellule danneggiate, invecchiate,
potenzialmente dannose per l’architettura
dell’intero tessuto-organo o cellule non
piùutili all’organismo
• termine adottato negli anni ‘70
• struttura e integrità della membrana vengono mantenute
• gli organelli mantengono la loro funzione
• alterazioni a carico del mitocondrio
• modificazioni nucleari caratteristiche
• modificazioni a livello della membrana plasmatica
• frammentazione della cellula in “corpi apoptotici”
CELLULA APOPTOTICA
QUANDO SI ATTIVA IL PROCESSO APOPTOTICO?
• quando l’organismo vuole eliminare cellule non desiderate attraverso
l’attivazione di una sequenza di eventi coordinati e programmati
• parte integrante dello sviluppo embrionale e fetale dell’organismo e
dell’omeostasi tissutale dell’adulto (evidente nella metamorfosi del girino
e nel feto)
• in cellule infettate da virus può interrompere la replicazione
virale
• usata anche nel sistema immunitario per rimuovere i linfociti
che non formano un recettore dell’antigene funzionale
• viene indotta in cellule soggette a un esteso danno al DNA
APOPTOSI
distruzione di cellule durante l’embriogenesi
controllo del numero di cellule
modellamento di strutture
involuzione ormono-dipendente nell’adulto
morte cellulare durante neoplasie
morte delle cellule immunitarie autoreattive
morte delle cellule danneggiate da diversi stimoli
STIMOLI APOPTOTICI
•
•
•
•
farmaci
radiazioni ionizzanti
mancanza di stimolazione ormonale
death receptors
DIFETTO DI APOPTOSI
• cellule tumorali
• malattie a base autoimmune
• infezioni virali
ECCESSO DI APOPTOSI
• sindrome dell’immunodeficienza acquisita
• malattie neurodegenerative
• sindromi mielodisplasiche
• ischemia
VIA ESTRINSECA
VIA INTRINSECA
VIA ESTRINSECA
I recettori di morte sono proteine transmembrana in grado di legare
citochine pro-apoptotiche, quali FasL, TNFa, TRAIL, e trasmettere il
segnale di morte cellulare mediante l’attivazione di pathways specifici
Si assemblano sotto forma di trimeri per favorire il riconoscimento del
ligando
CASPASI
Il termine deriva dal fatto che tali enzimi hanno una cisteina © nel loro
sito attivo e tagliano le proteine dopo residui di acido aspartico.
procaspasi
Iniziatrici
caspasi
8 e 10 estrinseco, 9 intrinseco
Effettrici
3, 6 e 7
Sono responsabili del taglio:
-della matrice nucleare
-delle proteine del citoscheletro
Questi tagli producono le classiche alterazioni strutturali, sia del
nucleo, sia del citoplasma, che si osservano nelle cellule apoptotiche
VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI
TEST PIU’ UTILIZZATI:
• valutazione mediante microscopia elettronica
VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI MEDIANTE MICROSCOPIA ELETTRONICA
VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI
TEST PIU’ UTILIZZATI:
• valutazione mediante microscopia elettronica
• tunel assay
TUNEL ASSAY
• La rottura del DNA durante l’apoptosi dà luogo a frammenti
di DNA con rotture del doppio filamento a basso o alto PM;
• questi frammenti possono essere identificati marcando
l’estremità 3’-OH libera per mezzo di un enzima, la TdT
che catalizza la polimerizzazione di nucleotidi alle estremità 3’;
• se si utilizzano dei nucleotidi marcati con fluorescenza questi
frammenti di DNA possono essere identificati in microscopia
e/o citofluorimetria.
IN PRATICA:
• si fissano le cellule in parafolmaldeide
• si permeabilizzano con una soluzione contenente Triton
• si marcano i frammenti di DNA con TdT e nucleotidi fluorescenti
• si analizzano le cellule in microscopia a fluorescenza o in citofluorimetria
VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI MEDIANTE TUNEL ASSAY
VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI
TEST PIU’ UTILIZZATI:
• valutazione mediante microscopia elettronica
• tunel assay
• comet assay
COMET ASSAY
• le cellule trattate vengono risospese in agarosio, depositate su
un vetrino e lisate
• i vetrini vengono posti in una cella elettroforetica orizzontale
e fatti correre per 20’ a 25 V
• i vetrini vengono poi incubati con bromuro di etidio e osservati
VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI
TEST PIU’ UTILIZZATI:
• valutazione mediante microscopia elettronica
• tunel assay
• comet assay
• DAPI/ colorazione con ioduro di propidio
IN PRATICA:
DAPI
si fissano le cellule su vetrino con etOH 96%
lavaggio in acqua
30 minuti di incubazione in una soluzione di DAPI
lavaggio in PBS
Microscopia-eccitazione UV
VALUTAZIONE DELL’APOPTOSI
TEST PIU’ UTILIZZATI:
• valutazione mediante microscopia elettronica
• tunel assay
• comet assay
• DAPI
• colorazione con ioduro di propidio
• frammentazione del DNA
FRAMMENTAZIONE DEL DNA
•
•
•
•
trattamento delle cellule con il composto in esame
estrazione del DNA
separazione dei frammenti su gel di agarosio
visualizzazione dopo colorazione con bromuro di etidio
OSSERVAZIONE dei NUCLEI APOPTOTICI
 staccare le cellule
 contare le cellule
 centrifugare a 1300 rpm per 10’
 risospendere le cellule in Hoechst (5 mg/ml in PBS) alla
concentrazione di 100 ml/ 106 cells
 incubare 15’ a 37°C
 centrifugare a 1900 rpm per 10’
 risospendere il pellet in PI (50 mg/ml in PBS) alla
concentrazione di 50 ml/ 106 cells
 deporre su vetrino e osservare al microscopio a fluorescenza
AUTOFAGIA
Il termine deriva dal greco e significa “mangiare sé stessi”
E’ un processo di auto-degradazione lisosoma-mediato
Esistono tre tipi di autofagia: macro-, micro-autofagia e autofagia
chaperone-mediata
Nella microautofagia porzioni di citosol vengono sequestrate e degradate
direttamente dai lisosomi
L’autofagia chaperone-mediata richiede il riconoscimento di proteine lisosomiali
da parte di (heat shock protein) Hsp70 e Hsp73
E’ il principale meccanismo di regolazione del turnover di elementi citosolici e
Organelli, ma è anche indotta rapidamente da stimoli quali la starvation e la
deprivazione di fattori di crescita
Metodi per evidenziare l’autofagia
• osservazione mediante microscopia elettronica
• colorazione con Arancio di Acridina e visualizzazione mediante
microscopio a fluorescenza e/o citofluorimetro
-
seminare le cellule
trattare
incubare 15’ con AO (1 mg/ml)
visualizzare