Mutazioni dinamiche
Vincenzo Nigro
Dipartimento di Patologia Generale
Seconda Università degli Studi di Napoli
Telethon Institute of Genetics and Medicine
(TIGEM)
Circa il 2% della popolazione ha un
IQ<70 (ritardo mentale)
il 15-20% di tutti I ritardi mentali sono
attribuibili a geni del cromosoma X
Il ritardo mentale legato al cromosoma X
(XLMR) è geneticamente eterogeneo
con 202 loci responsabili di forme che si
sovrappongono clinicamente
46 geni sono stati a tutt’oggi identificati
il locus che contribuisce alla frazione
maggiore causa la sindrome di MartinBell, oggi nota come
sindrome dell’X fragile
X fragile
ritardo mentale: IQ tra 20 e 70
•deficit di memoria a breve termine di
informazioni complesse
•ritardo nel linguaggio
•ridotte abilità visuo-spaziali
•ipersensibilità agli stimoli
•iperattività con deficit di attenzione
•comportamento autistico
•Macrocefalia con fronte, mento e
orecchie sporgenti
•Macroorchidismo (<30ml) dopo la
pubertà
•Anomalie connettivali: prolasso della
mitrale, lassità articolare, piede piatto
•Disfunzioni ipotalamiche?
Nel 1969 Lubs osservò una costrizione (marker X) sul braccio lungo
del cromosoma X in quattro maschi affetti e tre carriers obbligate
della stessa famiglia
Il sito fragile a Xq27.3
rottura o costrizione dei cromosomi
in metafase che insorge quando le
cellule sono esposte ad una
perturbazione della replicazione del
DNA
siti fragili sono su tutti i cromosomi
e prendono il nome della banda
cromosomica, es fra(X)(q27.3)
la nomenclatura HUGO chiama
questo sito FRAXA, cioè il primo
sito fragile identificato sul
cromosoma X
Segregazione, paradosso di Sherman
Il 20% dei maschi che portano l’allele mutato sono normali (NTM)
Il 30% delle carrier presenta ritardo mentale
perché non è affetto?
1
perché è affetta?
I
2
1
II
4
3
1
III
1
IV
2
3
4
5
Fragile X syndrome
Il gene FMR
Zhong et al. Am J Hum Genet 1995
200
CONTROLS
150
100
50
0
PREMUTATIONS
CpG island/5 ’UTR
FMR1 gene
Eag I
EcoRI
EcoRI
probe
2.4kb
2.8kb
Normal alleles :
(CGG) ~ 6 to 50
Stable in the family and
in the individual
Unstable in the population
(Polymorphism)
(CGG) 59 to ~ 200
Premutation :
Unstable in the family
Stable in the individual
(CGG) > 250
Methylation
Full mutation :
Unstable in the individual
(somatic mutations)
Repress FMR1
transcription
Premutazioni e mutazioni
• Le premutazioni si espandono quando sono trasmesse
dalla madre
• La donna con premutazioni ha un maggiore rischio di
menopausa precoce POF (premature ovarian failure)
• Il più corto allele descritto che in una sola generazione è
diventato mutazione piena è di 59 triplette
Espansione stabile (CGG)9-AGG-(CGG)9-AGG-(CGG)9
Ha almeno 2 A che interrompono la serie di 9 triplette
Espansione instabile (CGG)9-(CGG)9-(CGG)9- (CGG)9……
NON ha A che interrompono la serie
Il gene FMR1 (fragile X mental retardation 1) è all’interno di deserto
genico: quindi il fenotipo NON è da geni contigui
Mutazioni puntiformi o delezioni di FMR1 causano un fenotipo identico
alle espansioni e questo dimostra che il ruolo del gene non è importante
nelle prime fasi dello sviluppo, quando le triplette non sono ancora
metilate
cosa fa FMR1?
• FMRP una RNA-binding protein selettiva associata con i
poliribosomi ed espressa nei neuroni
• nelle spine dendritiche regola la traduzione degli mRNA, funzione
cruciale per la plasticità sinaptica e la maturazione neuronale
• interagisce con gli mRNA e con il pathway dei miRNA
• Nell’X fragile le spine dendritiche sono immature e lunghe
Cerebral Cortex, Vol. 10, No. 10, 10381044, October 2000
Spine dendritiche nel neocortex lunghe
ed immature anche nel topo KO
Malattie da triplette ripetute
Disease
Fragile X syndrome
Fragile XE syndrome
Friedreich ataxia
Myotonic dystrophy 1
Myotonic dystrophy 2
Spinobulbar muscular
atrophy
Huntington disease
Dentatorubralpallidoluysian
atrophy
SCA type 1
SCA type 2
SCA type 3
(Machado-Joseph disease)
SCA type 6
SCA type 7
SCA type 8
SCA type 12
Gene Locus/Protein
Repeat
Location
Xq27.3/FMR-1 protein
Xq28/FMR-2 protein
9q13-9q21.1/frataxin
19q13/myotonic dystrophy
protein kinase
3q21
Xq13-Xq21/androgen receptor
CGG
GCC
GAA
CTG
Noncoding
Noncoding
Noncoding
Noncoding
CCTG
CAG
Noncoding
Coding
4p16.3/huntington
12p13.31/atrophin-1
CAG
CAG
Coding
Coding
6p23/ataxin-1
12q24/ataxin-2
14q32.1/ataxin-3
CAG
CAG
CAG
Coding
Coding
Coding
19p13/a-1A (voltage-ependent
calcium channel subunit)
3p12-3p13/ataxin-7
13q12/none identified
5q31-5q33
CAG
Coding
CAG
CTG
CAG
Coding
?
Noncoding
Malattie da triplette ripetute non codificanti
Sindrome del
X fragile
mutazione
completa
CGG
Atassia di
Friedreich
220 00- > 2 0 000
CGG
GAA
CGG
GAA
60-200
CGG
5' UTR
CTG
CTG
60-80
CTG
GAA
6-52
GAA
esone
GAA
CTG
CTG
GAA
CGG
CGG
CTG
CTG
GAA
CGG
normale
220000- > 2 000000
GAA
CGG
CGG
2 0 00- >>990000
GAA
CGG
pre-mutazione
GAA
Distrofia
miotonica
CTG
7-22
introne
esone
introne
esone
5-37
CTG
CTG
3' UTR
anticipazione nella distrofia miotonica
Malattie da triplette ripetute di
poliglutammina
Atassia
Atrofia
spinocerebellare dentatorubraledi tipo 1
pallidoluysiana
Corea di
Huntington
CAG
ammalato
121
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
normale
CAG
CAG
CAG
81
CAG
CAG
CAG
Malattia di
Machado-Joseph
CAG
CAG
CAG
34
6
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
41
CAG
39
6
CAG
CAG
CAG
CAG
79
CAG
CAG
CAG
36
CAG
88
CAG
49
CAG
25
7
CAG
CAG
CAG
CAG
68
36
13
ORF
5' UTR
CAG
normale
CAG
CAG
CAG
CAG
15
29
35
CAG
CAG
40
Atassia
spinocerebellare
di tipo 2
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
59
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
11
34
CAG
CAG
ammalato
CAG
CAG
4
16
21
27
62
Atrofia
muscolare
spinobulbare
Atassia
spinocerebellare
di tipo 6
3' UTR
• la Huntingtina con poliglutammina
forma aggregati nei neuroni
causandone la morte
• all'inizio sintomi psichiatrici quali
depressione, irritabilità, difficoltà a
prendere decisioni, poi presenta
movimenti incontrollati simili a una
danza e demenza
• pur con una grande variabilità
individuale, la malattia avanza
inesorabilmente fino alla morte
• tentativi terapeutici sono in corso con
la cistamina che inibisce la
transglutaminasi coinvolta nella
formazione degli aggregati
Caratteri complessi
Vincenzo Nigro
Dipartimento di Patologia Generale
Seconda Università degli Studi di Napoli
Telethon Institute of Genetics and Medicine
(TIGEM)
un carattere non Mendeliano ha una
componente genetica?

i genitori trasmettono
– i geni
– l’ambiente (questo vale specialmente per caratteri quali IQ
e i disordini psichiatrici)


anche le abitudini alimentari, il clima, ecc.
Occorre provare il ruolo dei geni al di là della
ricorrenza familiare
geni condivisi





gemelli monozigoti
fratelli, genitori-figli
fratellastri, zii-nipoti
cugini I grado
cugini II grado





1/1 consanguineità
1/2 consanguineità
1/4 consanguineità
1/8 consanguineità
1/32 consanguineità
gemelli monozigoti MZ

hanno lo stesso sesso

hanno gli stessi alleli

hanno gli stessi polimorfismi

se femmine, hanno un differente pattern di
inattivazione dell’X

hanno un differente repertorio di immunoglobuline

hanno un differente TCR

spesso hanno un ambiente più simile
gemelli dizigoti DZ

hanno lo stesso sesso nel 50% dei casi

hanno il 50% degli alleli in comune

hanno il 50% dei polimorfismi in comune
Occorre considerare il rapporto MZ/DZ che
può essere inferiore a 2 o superiore a 2 in
funzione del numero dei geni coinvolti
Analisi nonparametrica
Senza un modello
Non si sa a priori se la trasmissione è dominante o
recessiva o mista o poligenica, ecc
Si valuta quanta parte si condivide dei segmenti di DNA
nelle famiglie o nelle popolazioni
Studi di associazione
• Sono diventati il metodo migliore per identificare
fattori di rischio per malattie complesse
• Più potente del linkage se le varianti che
conferiscono suscettibilità sono comuni, mentre è
meno potente se le varianti sono rare
• È necessario procedere con una mappa che
comprende molti marcatori a breve distanza l’uno
dall’altro
usare SNPs comuni
Associazione indiretta
Gli SNPs sono genotipizzati sulla
base del linkage disequilibrium (LD)
Infinium, Illumina
Infinium HD
BeadChip
Markers
(per
sample)
Median Marker
Spacing
Human1MDuo
>1.1 million
1.5kb
Human660W
-Quad
>658,000
2.5kb
HumanCytoS
NP-12
~300,000
10kb
Human510SDuo*
>510,000
3.2kb
GWA (genomic wide association) studies
• GWAs servono a comprendere la base genetica dei tratti complessi
• Per alcuni tratti ci sono molti loci: diabete, cancro della prostata e
della mammella, malattia infiammatoria intestinale, ecc
• Per altri tratti i loci sono pochi: asma, malattia coronarica,
fibrillazione atriale
A Catalog of Genome-Wide Association Studies
http://www.genome.gov/26525384
punti critici dei GWAs
• Selezione dei casi
– minimizzare l’eterogeneità fenotipica?
– focalizzazione su casi familiari?
– scegliere casi ad insorgenza precoce?
• Selezione dei controlli
– Controlli comuni a differenti tratti?
– 3000 controlli della Wellcome Trust Case Control
Consortium
• Significatività statistica
– p < 5 x 10–8
– Replica dello studio
Tremore
• 02/25/09 Stefansson
February 01, 2009 Nat Genet
Variant in the sequence of the LINGO1 gene confers risk
of essential tremor Essential tremor
• 452 cases
• 14,378 controls
• 15q24.3
• LINGO1
• 1 x 10-9
• Illumina [305,624]
obesità
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
01/15/09Thorleifsson December 14, 200Nat Genet
Genome-wide association yields new sequence variants at seven loci that associate
with measures of obesity
Body mass index
Studio iniziale: 80,969 individuals
Replica: 11,036 individuals
16q12.2 FTO 1 x 10-47
2p25.3 TMEM18 4 x 10-17
16q12.2 18q21.32 19q13.11 1p31.1 3q27.2 16p11.2 11p14.1 11p14.1 1q25.2
12q13.13 1p21.3 11p14.1
FTO MC4R KCTD15, CHST8 NEGR1 SFRS10, ETV5, DGKG SH2B1, ATP2A1
BDNF BDNF SEC16B, RASAL2 BCDIN3D, FAIM2 NR BDN
4 x 10-13 1 x 10-12 7 x 10-12 1 x 10-11 7 x 10-11 3 x 10-10 5 x 10-10 9 x 10-10 6 x
10-8 1 x 10-7 4 x 10-6 8 x 10-6 8.04 [6.96-9.12] % SD 6.12 [4.69-7.55] % SD 5.25
[3.82-6.68] % SD 4.38 [3.16-5.60] % SD 4.18 [2.98-5.38] % SD 3.77 [2.67-4.87] %
SD 4.42 [3.09-5.75] % SD 3.63 [2.49-4.77] % SD 4.58 [3.07-6.09] % SD 3.85 [2.625.08] % SD 3.36 [2.14-4.58] % SD 3.28 [2.06-4.50] % SD 2.6 [1.50-3.70] % SD 3.15
[1.78-4.52] % SD
Illumina [305,846]
Aneurismi intracranici
• Bilguvar November 09, 2008 Nat Genet
Susceptibility loci for intracranial aneurysm in European
and Japanese populations
• 1,580 European cases, 6,276 European controls
• 495 Japanese cases, 676 Japanese controls
• 8q11.23 SOX17 1 x 10-10
• 9q21.3 CDKN2A CDKN2B 1 x 10-10
• Illumina [289,271]
Manhattan plot
GWA Diabete di tipo 2
Crom 10 TCF7L2 transcription factor 7-like 2
Crom 16 FTO fat mass and obesity associated
Crom 6 CDKAL1 = CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1