Le malattie da triplette
28 Aprile 2010
Paola Rusmini
Una porzione significante del genoma umano contiene
semplici sequenze ripetute come i MICROSATELLITI.
I Microsatelliti sono :
-Sequenze ripetute in TANDEM di 1-6 nucleotidi.
-Templato per mutazioni dinamiche trovate in diverse
malattie denominate MALATTIE da TRIPLETTE
(malattie neurologiche).
Le mutazioni dinamiche:
-sono cambiamenti nel materiale genetico che possono
continuare a mutare nei tessuti (mitosi) e lungo le
generazioni (meiosi,più frequenti)
-possono avere effetti sulla struttura del DNA, la
trascrizione, splicing trasporto e stabilità dell’RNA, sulla
traduzione, sulla struttura e funzionalità proteica
Pearson CE et al. doi: 10.1038/nrg1689
Unstable repeat tracts and the process associated with repeat instability
Nature Reviews Genetics (2005) 6, 729-742
Malattie da triplette
Espansione in regioni non codificanti
(CGG;GCC,GAA,CTG,CAG)
La mutazione causa perdita di funzione o danni a
livello di mRNA.
Espansione in regioni codificanti:
La mutazione porta ad una proteina mutata con
guadagno di funzione tossica e/o perdita di
funzionalità.
La lunghezza del tratto espanso:
Dipende
dai
processi
metabolici
del
DNA.
(duplicazione-Riparo e mantenimento perché è un
fenomeno presente anche in cellule post-mitotiche).
Da luogo al MOSAICISMO genetico
Tratti più lunghi sono più soggetti a mutazioni di quelli
corti
ANTICIPAZIONE GENETICA
Gusella JF & MacDonald ME
Unmasking polyglutamine triggers in neurodegenerative diseases
Nature Reviews Neuroscience 2000, 1:109-115
Sequenze ricche in glutammina/aspartato (Q/N):
-Sono presenti frequentemente negli eucarioti. Si
ritrovano nei lieviti e il loro numero aumenta negli
invertebrati e nei mammiferi, indicando che gli
organismi più complessi necessitano di queste sequenze
ripetute.
-Non sono più abbondanti nelle proteine neurologiche
-Si ritrovano in proteine importanti per lo sviluppo, e in
domini proteici funzionali (interazioni proteichericonoscimenti molecolari-signalling).
-Non si conosce ancora il loro significato, vi sono
diverse ipotesi:
Per modulare nuovi domini proteici
Per modulare lo sviluppo e aggiungere nuove diversità
nella specie.
-germ line (..and meiotic) mutations
- Responsible for inherited diseases
-somatic mutations
- Tumors ?
- Cell specific and/or tissue alterations
Cell Research (2008) 18:198–213. doi: 10.1038/cr.2008.5
Features of trinucleotide repeat instability in vivo
Irina V Kovtun and Cynthia T McMurray
Espansione in regioni non codificanti:
Sindrome da X fragile
Causata da un’espansione CGG nel 5’ UTR del gene
fragile X mental retardation (FMR1), localizzato sul
cromosoma X. Colpisce solo gli uomini.
Sintomi:Ritardo mentale-Ritardo dello sviluppo del
linguaggio verbale-Iperattività-Sterilità
6-55 ripetizioni-soggetto sano
56-200 ripetizioni-“premutazione”
Oltre 200 ripetizioni- patologia
Espansione in regioni non codificanti:
Sindrome da X fragile
A livello molecolare:
L’espansione CGG nel 5’ UTR
del gene causa ipermetilazione
della
regione
richiamando
metil DNA binding protein ed
enzimi che modificano gli
istoni (HDAC) che inibiscono la
trascrizione genica
Espansione in regioni non codificanti:
Sindrome da X fragile- approcci terapeutici
•Agenti demetilanti (5-azadeoxycytidina o 5-aza)
•Inibitori di HDAC
Uso sinergistico dei 2 composti
Espansione in regioni non codificanti:
Friedrich Ataxia
La mutazione del gene più comune, che codifica per
una proteina detta Frataxina, è costituita dalla
ripetizione della tripletta GAA situata nel primo introne
del gene. La sequenza di queste basi nucleotidiche,
che normalmente ha un massimo di 40 triplette negli
individui normali, si espande fino ad alcune centinaia
nei pazienti malati. L’effetto è una diminuzione
marcata di livello di RNA della Frataxina nonchè della
quantità di Frataxina espressa, anche se una minima
parte viene comunque prodotta. La Frataxina è una
proteina mitocondriale e agirebbe regolando il flusso
del ferro all’interno dei mitocondri stessi.La perdita di
frataxina porta ad accumulo di ferro a livello
mitocondriale, aumentata suscettibilità allo stress
ossidativo, riduzione della fosforilazione ossidativa.
Espansione in regioni non codificanti:
Friedrich Ataxia-approcci terapeutici
-antiossidanti (Idebone.
Analogo a catena corta del
coenzima Q10)
-Chelazione del Fe
mitocondriale (pyridoxal
isonicotynoil hydrazanePIH, mobilizza
selettivamente il Fe
mitocondriale.)
-Modulazione degli istoni
(inibitori di HDAC)
Gatchel & Zoghbi Nature Rev Genet 2005, 6: 743
Sono proteine espresse in modo ubiquitario, ma
presentano disfunzioni solo a livello neurologico.
Sono caratterizzate da una lenta progressione e sono
tutte incurabili.
Malattie autosomiche, ad eccezione di SBMA che è legata
Al cromosoma X.
Caratterizzate da fenomeno dell’anticipazione
Ross C.A. (1995) Neuron 15:493-496
Huntington
HD:
Htt è localizzata nel citoplasma, assoni, sinapsi e nel
nucleo. E’ coinvolta nello shuttling nucleo-citoplasma
e nella regolazione trascrizionale.
-si
lega
al
repressore
trascrizionale
(REST/NRSF=neur
on
restrictive
silencer factor) e
lo sequestra nel
citoplasma. NRSF
non può agire sul
DNA
sui
NRSE
presenti su geni
come BDNF.
HD:
-Ha ruolo nel trasporto assonale,interazioni con
vescicole, interagisce con diverse proteine
responsabili del trasporto intracellulare ed endocitosi.
-Regola signalling del calcio
Spinal and Bulbar Muscular Atrophy (SBMA)
or Kennedy's disease
X-linked disease associated to a CAG repeat expansion in the androgen
receptor gene;
The CAG repeat is translated to an elongated polyglutamine tract in the
N-terminal transactivation domain of the androgen receptor protein.
Motoneuronal cell death.
- Clinical features:
. Motor cranial nerve deficits, amyotrophy, sensory neuropathy
- Types of lesion
. Gynecomastia, motor neuron loss in the brain stem and spinal cord
. Distal axonopathy, atrophy of dorsal root ganglion root
- Neuroanatomic distribution of the lesion
. Motor nerve nuclei of brain stem
. Anterior horn in the spinal cord, dorsal root ganglia
normal
.....CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG.....
mutant
.....CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG.....
mRNA
5'-UTR
AUG1-UGA
Upstream
ORF
Exon 1
AUG2
Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exons 5/6/7/8
3'-UTR
polyA
(CAG)n
protein
Transactivation domain/ (AF-1/AF-5) \ ID
P
PP
polyGln
P
P
A
S P S
Zn
Zn
DNA binding
domain
NLS AF-2
P
H12
Hormone
binding
domain
P = phosphorylation
A = acetylation
S = sumoylation
Poletti Front Neuroendocrinol 2004
Spinal and Bulbar Muscular Atrophy (SBMA)
Human
Tg mouse for SBMA
X-linked disease
the AR gene is on X-chrom
AR transgene randomly
integrated in the genome
- Only males affected
- gain-of-function of SBMA AR
- Only males affected (!!)
- gain-of-function of SBMA AR
--@@--
--@@--
Females may show few clinical
symptoms:
Females DO NOT show clinical
symptoms
--> random X-chromosome
inactivation ??
--> random X-chromosome
inactivation NOT RELATED
--> effect of testosterone ??
--> effect of testosterone
TWO Homozygous females -->
NO CLINICAL SYMPTOMS
Schmidt et al. Neurology (2002) 59:770-772
Katsuno et al. Neuron (2002) 35:843-854
Katsuno et al. Nat Med (2003) 9:768-773
Cx
Disease
NO Disease
T
No symptoms
Symptoms
Malattie da PolyQ:
-perché solo nei neuroni?
-perché solo in alcune popolazioni neuronali??
Malattie da PolyQ - Patologie che insorgono con l’età:
Le proteine mutate acquistano tossicità, il tratto polyQ
modifica la conformazione e la funzione provocando
(GAIN of FUNCTION)
Interazioni anomale tra proteine
Modificazione della localizzazione cellulare
Tossicità cellulare
Suscettibilità al taglio proteolitico
Malattie da PolyQ - Patologie che insorgono con l’età:
-Proteine misfolded - GAIN OF FUNCTION
-Formazione di inclusioni intracellulari
-Alterazioni trascrizionali
-Sequestro di proteine importanti Hsps
-Alterazioni dei sistemi degradativi
-Alterazioni del trasporto assonale
-Danni mitocondriali
Meccanismi patologici della malattie polyQ
1. Misfolding e aggregazione
Gli aggregati si formano a livello citoplasmatico e
nucleare. Il loro ruolo non è ancora ben chiaro.
Adapted from:
Adachi H et al. Widespread nuclear and cytoplasmic accumulation of mutant
androgen receptor in SBMA patients. Brain 2005 (doi:10.1093/brain/awh381)
Muchowski and Wacker NATURE REVIEWS | NEUROSCIENCE VOLUME 6 | JANUARY 2005 | 11
Atomic force microscopy shows the presence of
fibrillar forms of the purified recombinant
AR.Q46 N-terminal fragment expressed in E.Coli
Palazzolo I et al., JSB (2008) 108: 245-253
NH2
N - terminal
DNA
N - terminal
DNA
HINGE
GFP
DNA
HORMONE
GFP-AR.Q0
HINGE
GFP
N - terminal
HORMONE
GFP-AR.Q22
HINGE
GFP
COOH
HORMONE
GFP-AR.Q48
in pEGFP-C1
Aggregate formation in immortalized motorneurons expressing
androgen receptor with an elongated polyglutamine tract
GFP-AR.Q0
GFP-AR.Q22
GFP-AR.Q48
-T
+T
Simeoni et al. Hum Mol Genet 2000
Effects of testosterone on ARpolyQ
solubility in SBMA
Rusmini et al. Neurobiol Ag 2007
Redistribution of GFP-AR.Q48 aggregates after ligand removal
courtesy by Michael A. Mancini, Dpt. Cell Biology
Baylor College of Medicine, Houston, Tx, USA
Aggregates
induced by
2h
T-treatment
Neuropil aggregates in immortalized motorneurons expressing
androgen receptor with an elongated polyglutamine tract
Aggregates of
Full-lenght AR.Q48
nuclear
cytoplasmic
0
0
0
0
29
6
0.3
neuropil
NSC34/AR.Q0
NSC34/AR.Q22
NSC34/AR.Q46
Simeoni et al. Hum Mol Genet 2000
NSC34/GFP-AR.Q0/mtBFP
NSC34/GFP-AR.Q22/mtBFP
NSC34/GFP-AR.Q48/mtBFP
Piccioni et al. FASEB J 2002
Mitochondria accumulation in immortalized motorneurons
bearing aggregates in cell processes
Poletti Front Neuroendocrinol 2004
Neuropil aggregates in immortalized motor neurons
expressing SBMA androgen receptor
Red = AR.Q48
Green = tubulin
Blue = kinesin
Goldstein L.S. Do disorders of movement cause movement disorders and dementia?
Neuron (2003) 40:415-25
SBMA AR
SBMA AR + TESTOSTERONE
Cytoplasmic inclusions
toxicity debated
SBMA AR + TESTOSTERONE
Neuropil inclusions
axonal dysfunctions
a) Migration from cell soma ?
b) "In situ" formation ?
SBMA AR + TESTOSTERONE
Neuropil inclusions
axonal dysfunctions
Neurite damage
fast axonal transport
alteration
SBMA AR + TESTOSTERONE
Neuropil inclusions
axonal dysfunctions
Axonal degeneration
SBMA AR + TESTOSTERONE
Neuropil inclusions
Cell death
Meccanismi patologici della malattie polyQ
1. Misfolding e aggregazione
Gli aggregati si formano a livello citoplasmatico e
nucleare. Il loro ruolo non è ancora ben chiaro.
2. Modifiche post-traduzionali-Taglio proteolitico
Produzione di corti frammenti tossici.
TRUNCATED FORMS of the ANDROGEN RECEPTOR
AR16HA e AR112HA
Caspase-3
cleavage site
Caspase-3 cleavage
COOH
product
of AR identified
in spinal cord motoneurons
of SBMA patients
NH2
polyQ
DBD
transactivation
domain
hormone
binding
domain
polyQ = 16
AR16HA
polyQ = 112
AR112HA
Courtesy by DE Merry, TJU, USA
Intranuclear inclusion in immortalized motoneurons
expressing AR.Q112  HA
Mk Mock Q16 Q112
The GFPu protein is
a modification of an
unstable form of
GFP, targeted to
the proteasome
system by fusion
with the following
peptide:
Detergent (SDS) resistant
intracellular aggregates
<-<-- AR112.HA
<-- aggregates
AR112.HA
<-- dimer
<-- AR112.HA
Ala-Cys-Lys-AsnTrp-Phe-Ser-SerLeu-Ser-His-PheVal-Ile-Hys-Leu
monomer
<-- AR16.HA
Courtesy by R KOPITO, USA
AR.Q112  HA
DAPI
Merge
Meccanismi patologici della malattie polyQ
1. Misfolding e aggregazione
Gli aggregati si formano a livello citoplasmatico e
nucleare. Il loro ruolo non è ancora ben chiaro.
2. Modifiche post-traduzionali-Taglio proteolitico
Produzione di corti frammenti tossici.
3. Localizzazione nucleare della Proteina tossica
Alterazione dell’espressione genica e dell’organizzazione
nucleare.
4. Hsp-andamento bifasico. Alta espressione nella fase
Iniziale, riduzione nelle fasi finali.
Meccanismi patologici della malattie polyQ
1. Misfolding e aggregazione
Gli aggregati si formano a livello citoplasmatico e
nucleare. Il loro ruolo non è ancora ben chiaro.
2. Modifiche post-traduzionali-Taglio proteolitico
Produzione di corti frammenti tossici.
3. Localizzazione nucleare della Proteina tossica
Alterazione dell’espressione genica e dell’organizzazione
nucleare.
4. Hsp-andamento bifasico. Alta espressione nella fase
Iniziale, riduzione nelle fasi finali.
HSP70 sequestration in SBMA AR aggregates
Meccanismi patologici della malattie polyQ
1. Misfolding e aggregazione
Gli aggregati si formano a livello citoplasmatico e
nucleare. Il loro ruolo non è ancora ben chiaro.
2. Modifiche post-traduzionali-Taglio proteolitico
Produzione di corti frammenti tossici.
3. Localizzazione nucleare della Proteina tossica
Alterazione dell’espressione genica e dell’organizzazione
nucleare.
4. Hsp-andamento bifasico. Alta espressione nella fase
Iniziale, riduzione nelle fasi finali.
5. Alterazione dei sistemi degradativi: proteasome e
autofagia
Molecular pathogenesis of the polyglutamine diseases and the protein quality control system
Naiki, H. et al. J Biochem 2009 146:751-756; doi:10.1093/jb/mvp119
Copyright restrictions may apply.
Ubiquitin positive - AR aggregates
Misfolded proteins
Polyubiquitination
Proteasomal
Degradation
Goldberg AL
Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins
Nature 426, 895 - 899 (2003)
Taylor et al. Science 291:1991, 2002
Effects of testosterone on proteasome
functions in SBMA
DEGRON SIGNAL Ub
Ub
Ub
FOR UPP
Ub
GFP A-C-K-N-W-P-S-S-L-S-H-P-VI-H-L
ARpolyQ
misfolded
proteins
GFPu degradation
GFPu accumulation
Rusmini et al. Neurobiol Ag 2007
Nature 441, 819-820 (15 June 2006) | doi:10.1038/441819°
Neurodegeneration: Good riddance to bad rubbish Daniel J. Klionsky1
Quali approcci terapeutici????????
1.Fattori neurotrofici (infusione, vettori virali,cell
delivery)
BDNF, VEGF
2.Trapianti cellulari per ripristinare i circuiti neuronali
esperimenti
in
HD
trapianto
di
cellule
fetali
striatali,analisi post-mortem ha rivelato che le cellule si
erano impiantate ma non si sono riscontrati benefici per
la malattia.
3.Somministrazione di RNA antisenso per ridurre i livelli
Trascrizionali, per silenziare solo l’allele polimorfico.
Quali approcci terapeutici????????
4. Inibitori delle Caspasi
zVAD-fmk
minociclina antibiotico inibitore della caspasi 1 e 3
5. Overespressione di fattori trascrizionali
6. Inibitori di HDAC
Fenilbutirrato, acido valproico
Il sequestro di fattori trascrizionali ad azione acetiltrasferasica posso portare ad alterazione dell’attività
trascrizionale alterando i livelli di acetilazione degli istoni.
Questo effetto può essere controbilanciato con l’inibizione
dell’attività de-acetilasica.
Quali approcci terapeutici????????
7. degradazione proteica via UPS e autofagia e
inibizione dell’aggregazione
Trealosio- Congo Red, Litio, 17-AAG, overespressione di
Chaperone
Litio inibisce inositolo monofosfatasi e porta alla deplezione di inositolo libero e
di conseguenza di inositolo tri-fosfato (IP3)
stress
native protein
unfolding intermediate
aggregate
ADP
ATP
HSP70
sHSPs
proteasomal degradation
Modified from Haslbeck and Buchner (2002)
Hu et al. J Neurosci Res, Feb 07, DOI: http://dx.doi.org/10.1002/jnr.21231
Moreover, HspB8...
Lys41 mutations have been linked to either distal motor neurophaty or
CMT_2L;
 has been found in senile plaques of Alzheimer’s disease brains (Wilhelmus et
al, 2006)
 inhibits in vitro aggregation of amyloid- protein (Wilhelmus et al, 2006)
Effects of HspB8 on the SBMA ARpolyQ
aggregation and on proteasome functions
ARQ46
HspB8
-
+
-
+ T [10-8]
ARQ23
ARQ46
ARQ23
ARQ46
HspB8
AR
HspB8
YFPu
YFPu contains the CL1
an hydrophobic peptide
that generates a misfolded domain
actin
+
-
+
-
+
-
+ T [10-8]M
Nature Medicine 11, 1052 - 1053 (2005)
doi:10.1038/nm1005-1052
Targeting toxic proteins for turnover
Albert R La Spada & Patrick Weyd
17AAG increases the degradation of
the misfolded SBMA ARpolyQ
17AAG: Hsp90 inhibitor / Hsp70 inducer
AR
YFPu
actin
T : 10 nM
17AAG : 330 nM
MG132 : 10 M
QuickTime™ e un
decompressore
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