CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO
Adriana Maggi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
LEZIONE 4
Acidi nucleici e nuovi farmaci
Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI
FARMACI
TRADIZIONALI
DNA duplicato
DNA
RNA
PROTEINA
Duplicazione
Trascrizione
Maturazione
Metabolismo
Traduzione
VANTAGGI NELL’UTILIZZO DI FARMACI
ANTI-ACIDI NUCLEICI
A- BERSAGLIO MOLECOLARE PIU’ DEFINITO
Numero di proteine intracellulari: 1000-100000
Numero di RNA: 100-10000
Numero di geni: 1-2
B- SINTESI MIRATA
Bersagli possono essere sequenze anche uniche nel genoma
C- AZIONE MOLTO SPECIFICA
Utilizzando interazioni con altri nucleotidi si possono sfruttare i
vantaggi della complementarità tra due catene secondo il modello di
Watson e Crick
ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI
1. ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con l’m-RNA
2. ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA
3. RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a RNA
4. APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una
sequenza
aminoacidica (competono con l’RNA
nell’interazione tra RNA e proteina)
5. DECOY: DNA complementare a sequenze aminoacidiche
(competono
con sequenze di DNA nell’interazione DNA-
proteina)
6. siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche
CRONOLOGIA DELL’ANTISENSO
 1957
Tripla elica in vitro (cell-free)
 1965
RNA antisenso in batteri
 1978
ODN antisenso
 1982
RNA catalitico (ribozima)
 1989
Recettore per ODN
 1990
Tripla elica in vivo (cellule)
 1990
Farmacotossicologia ODN in animali
 1993
Terapia dell’HBV nell’anatra
 1994
Sperimentazione ODN nell’uomo
 1998
FOMIVIRSEN è il primo ODN approvato per
il trattamento della retinite da
Citomegalovirus in pazienti con AIDS
 oggi
aODN di seconda generazione
GLI OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO (aODN)
mRNA
A
G
U
…
A
…
G
…
C
…
U
…
A
…
G
…
A
T
C
G
A
T
C
C
U
A
G
aODN
L’aODN si lega in modo specifico alla sequenza complementare
dell’mRNA. Il tratto di catena ibrida che così si forma determina
per via enzimatica o per impedimento sterico l’inattivazione
dell’intero messaggero
MECCANISMO D’AZIONE DEGLI aODN
A- ATTIVAZIONE DA PARTE DELLA RNAsi H:
Degrada la componente di RNA delle catene ibride DNA-RNA
B- IMPEDIMENTO STERICO:
La catena di RNA-DNA impedisce la traduzione sui ribosomi, impedendo
la sintesi della proteina
RNAsi H
B
A
aODN
NO PROTEINA
Ribosoma
NO PROTEINA
REQUISITI PER L’ATTIVITA’ DI UNA MOLECOLA
ANTISENSO
1
Legarsi a siti accessibili dell’mRNA target
2
Stabilità
3
Legame alla cellula ed entrata
4
Accumulo all’interno della cellula
5
Evitare la compartimentalizzazione errata
6
Localizzarsi in siti attivi (nucleo o citoplasma)
nucleo
CELLULA
7
Essere attivo
PROTEINA
DNA
RNA
DISEGNO DI UN ODN
1. Uso di programmi (es. MFOLD) che predicono il “folding” dell’RNA per
identificare siti di ibridazione accessibili
2. “Gene walking”: si genera una serie di ODNs contro l’mRNA target e
si valuta l’attivita’ di ciascuno in cellule o in vivo
3. “RNAsi H mapping”: si basa sul fatto che tale enzima riconosce e
degrada selettivamente la catena di RNA in eteroduplex RNA-DNA.
Si combina l’mRNA target con una libreria di ODNs random in
presenza di RNAsi H, l’analisi dei frammenti tagliati permette di
individuare i siti accessibili
4. “ODN scanning arrays”: Si costruisce un array sintetizzando ODN che
coprono ogni sito dell’RNA bersaglio, si ibrida dunque con l’RNA
target radiomarcato. Questa metodologia permette di individuare la
sequenza di possibili ODN
MODIFICA CHIMICA DEGLI ODN
PERCHE’ ?
1- per migliorare l’uptake cellulare
2- per aumentare la stabilità alle nucleasi
COME ?
A- apportando modifiche ai gruppi ossidrili
del fosforo
B- all’ossidrile 3’ del ribosio
C- alle basi
MODIFICHE UTILIZZATE SU ODN
O
O
P
X
M W
Z
GRUPPO
FOSFATO
O
O
Y
Base
M W X
P
O
O
P Oalch O
P
Me O
P
S
O
P
S
O
P
O NH
P
O
O
C
H
O
S
O
O
O-
O
O
OR’
O
Base
Base
ZUCCHERO
OR’ OAlch
2’-O-Alchil-RNA
O
Base
OR’
Alfa-nucleoside
Y
O
O
O
O
S
O
O
H
O
Z
O
O
O
O
O
O
NH
O
CH2
O
HO
fosfodiestere
fosfotriestere
metilfosfonato
fosforotioato
fosforoditioato
3’-fosforammidato
5’-fosforammidato
formacetale
solfonato
Base
OR’
arabinonucleoside
O
Base
OR’
Omo-DNA
ALCUNI aODN MODIFICATI
Base
O
O
O
P
Base
O
S
O
Base
O
O
O
P
Base
O
CH3
O
FOSFOROTIOATI: Sono analoghi degli aODN naturali in
cui uno degli ossigeni non a ponte del legame
fosfodiesterico è stato sostituito con un atomo di zolfo.
VANTAGGI: - stabili alle nucleasi
- facile sintesi
- attivazione dell’RNAsi H
SVANTAGGI: - poco assorbiti
- modesta tossicità
METILFOSFONATI: Un ossigeno non a ponte del legame
fosfodiesterico è sostituito con un gruppo metilico.
VANTAGGI: - minore solubilità quindi maggiore
concentrazione intracellulare
SVANTAGGI: - non attivano l’RNAsi H
PNA ( Peptide Nucleic Acids )
• Uno scheletro di
peptidico
mima
struttura del DNA
tipo
la
• Le basi mantengono tra
loro
la
distanza
che
avevano nel DNA e quindi
possono
riconoscere
le
basi complementari
• La sintesi
identici a
peptidi
segue schemi
quella per i
• La struttura risultante è
di natura non ionica,
stabile
alle
nucleasi,
proteasi e peptidasi
PNA: VANTAGGI E SVANTAGGI
VANTAGGI:
- facilità di sintesi
- modulabilità delle proprietà chimico-fisiche (il
gruppo ammidico può essere opportunamente
funzionalizzato)
- grande stabilità del complesso PNA-DNA
grazie alla mancanza della carica degli
oligomeri di PNA
- sono più resistenti all’attacco di proteasi e
nucleasi
SVANTAGGI: - non sono attaccati da RNAsi
- non penetrano la membrana cellulare
- possono non essere selettivi
APPLICAZIONI DI PNA
Nel 1992 fu pubblicato il primo studio sull’applicazione di PNA: PNA
microiniettati (1 mM) nei nuclei di cellule in coltura hanno bloccato la
sintesi della proteina T Ag di SV40.
Diversi gruppi hanno studiato l’effetto antisenso dei PNA in vitro su
estratti nucleari di epatociti di ratto e hanno riportato un’inibizione
della traduzione dell’mRNA che codifica per il recettore a dell’IL-2, la
cloramfenicolo acetiltrasferasi, l’iNOS…
Nel 1998 si hanno i primi risultati in vivo. PNA contro la neurotensina
e il recettore m degli oppioidi sono stati iniettati in ratti e hanno
ridotto drasticamente la risposta alla neurotensina e alla morfina. Gli
effetti sono reversibili e le risposte tornano normali dopo 5-14 giorni
dall’iniezione
Sono stati studiati PNA che bloccano specificamente l’interazione del
fattore di trascrizione NF-kB con il suo sito di legame nel promotore
di IL2-Ra.
PNA contro l’mRNA della prepro-ossitocina riducono la
dell’mRNA per l’ossitocina in modo tempo e dose dipendente
quantità
CONFRONTO STRUTTURA CHIMICA
TRA DNA E PNA
O
O
Base
NH2
N
O
O
O-
P
O
O
OR’
DNA
O
Base
O
NH
Base
N
O
OH
PNA
Base
O
FARMACOCINETICA CELLULARE DI ODN
 In vitro gli ODN attraversano la membrana cellulare con un
processo di pinocitosi ed endocitosi mediata da recettore.
 La concentrazione intracellulare è 1-3% di quella extracellulare, se
veicolati da agenti lipofili arriva a 10-20%
 La lunghezza dell’oligo è inversamente proporzionale all’uptake
cellulare
 Non tutto l’ODN internalizzato esercita un effetto poiche’ gran
parte e’ sequestrato nei compartimenti endosomiali o lisosomiali.
 Studi in vitro dimostrano una compartimentalizzazione di ODN
anche all’interno di altri organelli citoplasmatici, questo non sembra
vero in vivo
 L’emivita intracellulare degli oligo naturali è di 2-4 ore. Tale
emivita è decisamente influenzata dalla natura chimica dell’ODN
FARMACOCINETICA-2
 Somministrazione per via endovenosa, peritoneale, topica,
oftalmica, inalatoria e orale. La via orale dà buoni livelli
circolanti però l’assorbimento è irregolare
 L’emivita plasmatica degli ODN naturali è assai breve, dovuta
alla degradazione da parte delle nucleasi sieriche e alla
captazione
dai
tessuti
periferici
(ridistribuzione).
Piu’
somministrazioni sono in genere richieste per avere una certa
efficacia, questo e’ particolarmente importante se il target ha
un basso turnover. Esempio PERIFERINA= proteina dei filamenti
intermedi tipica dei neuroni, half life=7 giorni circa, la
somministrazione ripetuta di ODN per piu’ di 40 giorni porta alla
riduzione del 90% di livelli di periferina
 Sono disponibili sistemi impiantabili a base di polimeri
biodegradabili in grado di rilasciare il composto attivo per piu’ di
un mese (il rilascio e’ in funzione della chimica e lunghezza
dell’ODN)
FARMACOCINETICA DEI FOSFOROTIOATI
 I FOSFOROTIOATI, somministrati per via sistemica, si
distribuiscono rapidamente in tutti gli organi tranne il
SNC. L’assorbimento determina una rapida diminuzione dei
livelli plasmatici e l’equilibrio si stabilisce entro 20-30
minuti dalla somministrazione.
 La concentrazione che si ottiene è sufficiente per l’azione
farmacologica.
 L’emivita è di 16-18 ore.
 L’eliminazione è degradativa (20-30% nelle urine dopo 24
ore). Non si è osservata eliminazione fecale.
 Si suggerisce per terapia sistemica 10-50 mg/kg.
DISTRIBUZIONE ED ELIMINAZIONE DI aODN
Dopo somministrazione
intravenosa gli oligo
possono
essere
rintracciati
in
una
varietà di tessuti con
la
percentuale
più
alta di accumulazione
nel rene (cellule dei
tubuli prossimali) e
nel fegato (cellule
endoteliali) seguiti da
milza e midollo osseo
e in minime quantità
nelle cellule ematiche
mononucleari
periferiche (PBMCs).
VEICOLAZIONE DI ODN PER
USO TERAPEUTICO-1
Data la veloce eliminazione degli ODN plasmatici liberi
è necessario che essi siano specificamente veicolati
verso le cellule del tessuto bersaglio.
Le strategie di trasferimento degli ODN sono diverse
e tutte implicano il processo di adesione alla membrana
e il successivo rilascio all’interno della cellula con
inclusa efficienza, stabilità ed assenza di effetti
citotossici.
VEICOLAZIONE DI ODN PER
USO TERAPEUTICO-2
1. LIPOSOMI CON LIPIDI CATIONICI
I liposomi incapsulano gli ODN nel
centro acquoso. I lipidi cationici dotati
di
carica positiva
facilitano la
incorporazione di DNA (a carica
negativa) e il trasporto nella cellula
mediante fusione con le membrane
cellulari o endocitosi mediata da
recettori. Per facilitare il rilascio
dall’endosoma o liposoma si puo’
incorporare un lipide helper = DOPE
(dioleil fosfatidiletanol amina) che
distrugge la parete endosomiale.
Un’altra
strategia
consiste
nell’utilizzare liposomi pH sensibili: a
PH acido il liposoma collassa e cio’
determina la fusione con la membrana
endosomiale e il rilascio del contenuto
nel citoplasma.
VEICOLAZIONE DI ODN PER
USO TERAPEUTICO-3
2. NANOPARTICELLE E MICROSFERE:
Le NANOPARTICELLE sono veicolanti colloidali di dimensioni
nanometriche. Sono costituite da polialchil-ciano-acrilati
(PACA), molto biodegradabili e a basso costo. Poiche’ hanno
superficie carica negativamente si utilizzano copolimeri
cationici o detergenti idrofobi cationici per facilitare il
legame dell’ODN che rimane adsorbito alla superficie carica
Le MICROSFERE hanno dimensioni comprese tra 1 e 100mm,
sono a base di zuccheri biodegradabili che consentono il
rilascio ritardato di acidi nucleici. P(LA-GA) sono le piu’
usate
VEICOLAZIONE DI ODN PER
USO TERAPEUTICO-4
3. RILASCIO MEDIATO DA UN PEPTIDE CARRIER:
Una delle più potenti strategie per il rilascio all’interno delle cellule
di ODN è basata sull’uso di un breve peptide chiamato MPG (27
residui). MPG contiene un dominio idrofobico derivato dalla fusione di
sequenze gp41 dell’HIV ed un dominio idrofilico derivato dalla
sequenza dell’antigene T dell’SV40. MPG ha un’alta affinità per il
DNA sia a singola elica che a doppia elica. I legami principali tra
MPG e l’ODN avvengono attraverso interazioni elettrostatiche che
coinvolgono residui basici del peptide vettore. Il rapporto MPG/ODN
deve essere molto elevato (dell’ordine di 20/1). Questa nuova
strategia offre diversi vantaggi rispetto agli altri approcci
comunemente in uso, aumentando la stabilità degli ODN nei confronti
delle nucleasi e facilitando l’attraversamento della membrana
plasmatica.
VEICOLAZIONE DI ODN PER
USO TERAPEUTICO-5
4. VIRUS:
Durante l’assemblaggio del capside l’ODN terapeutico viene
incorporato nello spazio intravirale sostituendo il contenuto nucleico
originale.
5. CONIUGAZIONE:
Composti coniugati con oligonucleotidi:
 LIGANDI (ferritina, porfirina, EGF, anticorpi):
l’uptake cellulare per endocitosi e per via recettoriale
potenziano
 LIPIDI (colesterolo, PEG, poli L-lisina): aumentano il passaggio
passivo attraverso le membrane e incrementano la stabilità
 INTERCALANTI (psoralene, acridina, antracicline): accrescono la
stabilità della doppia elica
 MARCANTI (biotina, fluoresceina)
TOSSICOLOGIA CELLULARE DEGLI ODN
 Solo per concentrazioni superiori a 100 mM
 Possono causare 10-20% di inbizione della proliferazione
cellulare forse per ibridazioni parziali aspecifiche
 Non sono state mai descritte mutazioni permanenti per
inserimento degli oligo nel DNA
 Non sono state mai descritte trasformazioni neoplastiche
TOSSICOLOGIA IN VIVO
TOPO DL/50
350 mg/kg
I.V e I.P.
RATTO DL/50
100 mg/kg/giorno/3 mesi
Sofferenza epatica solo in caso di somministrazione di tioati.
Non ci sono effetti teratogeni
aODN:SETTORI DI UTILIZZO
TERAPEUTICO-1
1. CONTROLLO DELLA CRESCITA NEOPLASTICA:
PRIMA GENERAZIONE: aODN contro mRNA importanti nel ciclo
mitotico (subunità a polimerasi, myc..)
SECONDA GENERAZIONE: aODN contro le traslocazioni
cromosomiche di linfomi e leucemie
2. TERAPIA ANTIVIRALE:
HIV: SIDA
blocco delle proteine essenziali per il ciclo
riproduttivo (TAT,REF)
Herpes Simplex: impiego clinico per cheratite erpetica
Virus influenzali
aODN:SETTORI DI UTILIZZO
TERAPEUTICO-2
4. CARDIOLOGIA:
 Ipertensione: aODN contro geni che sintetizzano per
molecole vasoattive (renina-angiotensina, recettore
adrenergico,
endotelina
e
neuropeptide
Y,
callicreina,peptide natriuretico atriale, NO, calcitonina)
 Ischemia miocardica
 Nel controllo della ristenosi sono utilizzati per inibire la
proliferazione endotelio-intima muscolare delle arterie
coronariche dopo stress meccanico (azione sull’m-RNA
che codifica per il PDGF)
AODN IN VIROLOGIA
1. esperimenti su animali da laboratorio hanno evidenziato un effetto
anti-HIV di un ODN di 28 mer complementare al gene tat dell’HIV.
In pazienti con AIDS conclamata, utilizzato alla concentrazione di
3,6 mg/kg per via endovenosa, non ha dato effetti positivi.
Attualmente la Hybridon sta studiando una sequenza (GEM 91) che
sembra bloccarenon solo la replicazione dell’HIV ma anche inibire il
suo legame alle cellule.
2.
ODN contro Citomegalovirus = FOMIVIRSEN (VitraveneTM),
responsabile della cecità registrata in alcuni pazienti affetti da
AIDS. Somministrazione topica per via intra-oculare. Approvato nel
1998 per il commercio in USA e nel 1999 per l’Europa
3. ODN anti influenzale. Blocca l’espressione del gene ICAM 1 che funge
da recettore per il passaggio del virus all’interno della cellula
4. ODN contro Papillomavirus (HPV) probabilmente responsabile del
tumore della cervice uterina. Somministrazione intra-papilloma o per
pomata
aODN IN ONCOLOGIA
 I GENERAZIONE
Studi di somministrazione topica di DNA associato a nanoparticelle
che ha come bersaglio il gene Ras, somministrato a pazienti con
carcinoma alla vescica
 II GENERAZIONE
Tumori sistemici (leucemie e linfomi):
ODN diretti ad ibridizzare le sequenze originate dalla
traslocazione cromosomica 8:14 nel linfoma di Burkitt, 9:21
(cromosoma Filadelfia) nella leucemia mieloide cronica, 14:18 nella
leucemia B umana.
LEUCEMIA B UMANA
Ch.18
bcl-2
V
bcl-2
N J6 E
D
J
E
IgH
Ch.14
A)
IgH
B)
C)
sequenza specifica
bcl-2
IgH
5’ TGCAGTGGTGCT CCCTGGTTCCCCGAA TACTACTACCTA 3’
Traslocazione cromosomica 14:18. A) La doppia
rottura del cromosoma 18 nel gene bcl-2 e del
cromosoma 14 nel locus della catena pesante
delle immunoglobuline (IgH) determina (B) la
formazione del gene ibrido bcl-2-IgH formando
una sequenza nucleotidica specifica nel punto di
giunzione (C).
aODN CONTRO GENI CANCRO-CORRELATI-1
C-myc: Inibizione della proliferazione sia nei linfociti T sia delle cellule
HL60, le quali sono indotte ad un differenziamento spontaneo;
inibizione della crescita di una linea tumorale derivata da un
linfoma di Burkitt
C-myb:Inibizione dell’attività proliferativa delle cellule mieloidi in
coltura, dei precursori emopoietici mieloidi nrmali e dei Tlinfociti PHA stimolati
C-abl: Parziale inibizione della capacità proliferativa e della formazione
di colonie mieloidi
Cdc2: Inibizione della proliferazione dei linfociti T PHA stimolati
Bcl-2: Inibizione della proliferazione di cellule leucemiche con massiva
morte cellulare
aODN CONTRO GENI CANCRO-CORRELATI-2
CSF-1:
Prevenzione della senescenza di cellule endoteliali umane,
aumento della capacità proliferativa
BCR/ABL: Soppressione della formazione di colonie di cellule di
leucemia mieloide cronica
P53:
Soppressione della formazione di colonie di cellule di leucemia
mieloide acuta
Protimosina a: Inibizione
mielomatose
della
proliferazione
delle
cellule
Butirrilcolinesterasi:Inibizione selettiva della megacariocitopoiesi
EFFETTO ANTITUMORALE DI aODN ANTI-MYB
10
Non trattati
ODN controllo
8
aODN anti-myb
6
4
2
0
0
12
24
36
48
ODN IN ALTRE PATOLOGIE
PSORIASI: ODN per diminuire la velocità di proliferazione delle cell
della pelle o contro un difetto del sist imm.
RETINITE indotta da infezione da citomegalovirus: Vitravene
TRATTAMENTO DELL’ASMA: L’Hybridon ha messo a punto un
antisenso in grado di inibire le espressioni delle interleuchine durante
la risposta immunitaria.
MORBO DI CROHN: ISIS 2302 e’ in fase II, esso inibisce la
sintesi di una proteina di adesione cellulare che favorisce il
passaggio delle cellule infiammatorie attraverso i vasi sanguigni
SCLEROSI MULTIPLA: la ISIS ha cercato di mettere a punto un
ODN contro il recettore VLA4 sulla superficie dei linfociti per
bloccare l’inappropriata migrazione di linfociti nel SNC che
contribuisce alla patogenesi della malattia
DISTROFIA MUSCOLARE
rattamenti intramuscolari
DI
DUCHENNE:
effetto
positivo
di
Dystrophin is a rod-shaped cytoplasmic protein, and a vital part of a protein complex that connects the
cytoskeleton of a muscle fiber to the surrounding extracellular matrix through the cell membranes. This
complex is variously known as the costamere or the dystrophin-associated protein complex. Many muscle
proteins, such as α-dystrobrevin, syncoilin, synein, sarcoglycan, dystroglycan, and sarcospan, colocalize
with dystrophin at the costamere.
As of 2007, dystrophin is the longest gene known, covering 2.4 megabases (0.08% of the human
genome) at locus Xp21. Theprimary trancript measures about 2,400 kilobases and takes 16 hours to
transcribe, the mature mRNA measures 14.0 kilobases. The 79 exons code for a protein of over 3500
amino acid residues.
PTC 124; Ataluren; 3-(5-(2-fluorophenyl)1,2,4-oxadiazol-3-yl)benzoic acid; 3-[5-(2fluorophenyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]benzoic acid
PTC124 is a novel small-molecular agent that makes
ribosomes less sensitive to stop codons. However, it
is not equally effective with every stop codon,
working best on the sequence 'UGA'.
Exon skipping: una nuova applicazione per oligonucleotidi
Antisenso: l’esempio della patologia di Duchenne 1.
Exon skipping: una nuova applicazione per oligonucleotidi
Antisenso: l’esempio della patologia di Duchenne 2.
Utilizzodi acidi nucleici
per alterare la
maturazione di RNA
PROBLEMATICHE RIGUARDANTI GLI
ANTISENSO IN TERAPIA
1. Scarsa riproducibilità negli esperimenti in colture cellulari
2. Uso fosforotioati
3. Variabilità del grado di purezza delle diverse preparazioni
4. Uptake cellulare ancora poco definito
5. Costo
ODN DI SECONDA GENERAZIONE-1
Proprietà biologiche
Affinità
Substrato dell’Rnasi H
Farmacocinetica cellulare
Proprietà farmacocinetiche
Stabilità in vivo
Rilascio sito specifico
Emivita plasmatica
ODN DI SECONDA GENERAZIONE-2
Il modello di oligonucleotide deputato ad assolvere tutte queste
funzioni e a mostrare tutte queste proprietà sembra rappresentato
dalla classe degli MBO (mixed backbone oligonucleotides). Un ODN
chimerico ultimamente approntato possiede una breve sequenza di
DNA fosforotioato (3-9 basi) usata per attivare l’Rnasi H e un
braccio ibridizzante fornito di nucleotidi modificati che non
formano substrati per l’Rnasi H. Nucleotidi 2’-O-Metil o 2’-fluoro
modificati sono stati usati per i bracci ibridizzanti. Il gruppo 2’O-metile incrementa l’affinità dell’oligomero per l’RNA target e ne
aumenta l’attività in coltura.
Gli MBO mostrano una elevata stabilità in vivo che potrebbe
consentire somministrazioni meno frequenti nonché meno gravi
effetti locali legati alla natura polianionica e alla risposta
immunitaria. Questo è dovuto al ridotto numero di legami
fosforotioati contigui oltre che alla posizione centrale dei segmenti
modificati.