CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO
Adriana Maggi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
AA 20010-11
LEZIONE 17
Acidi nucleici e farmaci
Gli acidi nucleici, oltre a riconoscere
e ibridare con altre molecole di DNA sono
in grado di assumere una struttura
tridimensionale che permette loro di
interagire con specificità anche con altre
macromolecole quali, ad es., le proteine.
FLESSIBILITA’ DEL DNA
Struttura del complesso CAP-DNA.
La struttura del DNA consentono una forte interazione
con proteine dell’apparato trascrizionale, per esempio.
MOTIVI STRUTTURALI CHE PERMETTONO LEGAME
AD ALTA AFFINITA’ TRA PROTEINE E DNA
APTAMERI
Sono ORN o ODN capaci di riconoscere una specifica
sequenza amminoacidica o un epitopo appartenente ad una
proteina
Sono stati scoperti per caso osservando l’alterazione del
processo di coagulazione, dovuto ad un aumento del tempo di
protrombina
in
seguito
alla
somministrazione
di
ODN
antisenso.
In queste molecole e’ presente un “G quartet” che conferisce
al DNA la capacità di legare la trombina inattivandola
APTAMERO PER L’a-TROMBINA
Organizzazione strutturale dell’aptamero per l’a-trombina e disposizione dei
quartetti di guanina che ne stabilizzano la conformazione
STRUTTURA DI ALCUNI APTAMERI
Riconoscimento
di ligandi
aromatici piatti:
A: strutture
B: teofillina-RNA
C: FMN-RNA
D: AMP-DNA
E: AMP-RNA
Riconoscimento
di aminoacidi
basici:
A: strutture
B,C: argininaDNA D: argininaRNA
E: citrullina-RNA
Riconoscimento
dell’antibiotico
aminoglicoside
tobramicina:
A: struttura
B: aptamero
tobramicina-RNA
C: la tasca che
accoglie il ligando
Riconoscimento di
peptidi e proteine:
A:peptide derivante
dalla proteina Rev del
virus umano HIV-1
B,C: diversi aptameri
RNA Rev D, E:
aptamero proteina di
rivestimento del
batteriofago MS2RNA
APTAMERI CON STRUTTURA 3D DETERMINATA
Acido nucleico
Affinita’ Kd (mM)
Teofillina
RNA
0,3
FMN
RNA
0,5
AMP
DNA/RNA
6/10
Arginina
DNA/RNA
125/60
Citrullina
RNA
65
Tobramicina
RNA
0,009
Neomicina B
RNA
0,115
HIV-1 Rev peptide
RNA
0,004
HTLV-1 Rex peptide
RNA
0,025
MS2 coat protein
RNA
ND
Trombina
DNA
0,025
Ligando
IDENTIFICAZIONE DI APTAMERI IN GRADO
DI LEGARE PROTEINE AD ALTA AFFINITA’
 A tutt’oggi è impossibile indicare a priori se esistano e
quali siano le sequenze di DNA in grado di riconoscere
una definita struttura enzimatica
 L’analisi basata sui metodi computazionali richiede
tempi di elaborazione esageratamente prolungati per
stabilire la conformazione spaziale di macromolecole
 L’isolamento di aptameri ad attività biologica richiede
lo sviluppo di metodologie sperimentali specifiche
SELEX ( Selection of functional nucleic acids)
UNA METODOLOGIA CHE NASCE:
1. dalla evoluzione delle tecniche di sintesi in vitro
di acidi nucleici che permette la generazione di
innumerevoli sequenze “degenerate” di nucleotidi
2. Dalla disponibilità della PCR che permette di
amplificare all’infinito sequenze specifiche di
DNA
SELEX ( Selection of functional nucleic acids)
Random or doped DNA pool
Regenerated DNA pool
Trascribed RNA pool
cDNA
1. Generazione di una
diversità di sequenza
(sintesi chimica,
manipolazione enzimatica,
PCR)
2. Selezione di forme
funzionali attraverso il
legame con il bersaglio e
l’eliminazione di molecole
non affini
3. Amplificazione della
popolazione selezionata
con metodiche di PCR
4. Step successivi di
selezione e
riamplificazione per
isolare le molecole più
efficienti
DNA SELEX ( Selection of functional nucleic acids)
• la libreria di oligo contiene 1013 -1015 molecole
• ciascuna molecola è di 20-100 nt
• ciascuna molecola contiene sequenze di
fiancheggiamento che permettono l’appaiamento
dei primers necessari per la reazione di PCR
• per la reazione di SELEX le molecole di DNA
sono a singolo filamento (ottenute per
separazione di prodotti di PCR)
RNA SELEX ( Selection of functional nucleic acids)
La libreria di oligo contengono 1013 -1015
molecole di RNA a singolo filamento
ottenute tramite la trascrizione in vitro di
templati a doppio filamento di DNA mediante
polimerasi T7
METODI ALTERNATIVI PER L’IDENTIFICAZIONE DI
APTAMERI
Il gruppo di Clary alla Duke University ha identificato oligonuceotidi
che si legavano a un tumore indotto in topo.
Gli oligo sono stati iniettati in vivo, poi estratti dalla massa
tumorale e amplificati. Due degli oligo selezionati legavano un
biomarcatore tumorale (P68) molto espresso nel tumore indotto nei
topi.
POTENZIALE TERAPEUTICO DEGLI APTAMERI 1.
• Possono essere utilizzati come gli anticorpi, ma hanno il
vantaggio di essere prodotti di sintesi (quindi sono scevri
da contaminazioni virali/batteriche)
• Non sono immunogenici
• Possono essere funzionalizzati o legati a molecole di
riconoscimento
• A differenza di aODN possono agire su target
extracellulari: generalmente bloccano interazioni ligandorecettore e quindi hanno funzioni di “antagonisti” per
recettori di membrana
• Molecole dotate di capacità traslazionale (dal laboratorio
all’ospedale)
POTENZIALE TERAPEUTICO DEGLI APTAMERI 2.
Limitazioni nell’uso di aptameri in terapia
•
Difficolta’ di predizione delle caratteristiche farmacocinetiche
•
Breve emi-vita dovuta a filtrazione renale (dovuta alle loro
ridotte dimensioni)
•
Degradazione rapida nel circolo (fino a 2 min per oligo naturali,
ma prolungabile fino a 24h nell’uomo mediante PEGilazione es.
Macugen Pfizr/Eyetech)
•
Problemi brevettuali (il brevetto per la tecnologia SELEX –
systematic evolution of ligands by exponential enrichment) è in
scadenza (US PATENT 5271163 del 14/12/1993)
•
Difficoltà di penetrazione di membrane biologiche
MODIFICAZIONI CHIMICHE PER AUMENTARE LA
POTENZA TERAPEUTICA DEGLI APTAMERI
Aumento emivita
•
Tutte le modificazioni chimiche descritte per aODN
•
Coniugazione al 5’ con polietilenglicole (PEG)
•
Uso di Spigelmers in cui lo zucchero è un enantiomero del
ribosio (L-ribonucleotidi sono pessimi substrati per le nucleasi,
ma anche per la polimerasi)
•
”capping” dei nucleonucleotidi a livello 3’
L’unico aptamero in commercio (pagaptanib) è peghilato
TOSSICOLOGIA DEGLI APTAMERI
Possono agire quali anticoagulanti/attivatori del complemento e
stimolatori della immunità innata
L’azione anticoagulante forse associata al fatto che il DNA è
un polianione come l’eparina
L’azione di attivazione del complemento pare essere legata alla
possibilità degli oligonucleotidi di legarsi al fattore H del
complemento
BLOCCO DELLA ATTIVITA’ ANTICOAGULANTE DI
APTAMERI
L’INIEZIONE DI OLIGONUCLEOTIDI “ANTISENSO”
NEI CONFRONTI DI QUELLO TERAPEUTICO HA
FUNZIONATO COME “ANTIDOTO”
APTAMERI IN CLINICA
APTAMERI IN CLINICA
Pegaptinib (Pfizer/Eyetech) – approvato dalla USFDA nel 2004 e
sul mercato per la terapia della degenerazione maculare. Si tratta
di un aptamero che lega il VEGFA con una affinità pari a 49pM.
Originariamente identificato in una libreria SELEX, una volta
selezionato è stato ridotto a 27 nt con sostituzione di 12 delle 14
ribopurine con 2’-o-metil-purine per limitare la sensibilità alle
nucleasi. Inoltre il nucleotide è stato peghilato per aumentarne la
stabilità e limitare la sua capacità di distribuirsi nei tessuti.
Viene somministrato tramite iniezione intravitrea (0.3 mg/occhio)
una volta ogni 6 settimane per limitare la angiogenesi aberrante
causata dalla maculopatia.
In competizione con il frammenti di anticorpo Ranimizumab
(Genetech, Lucentis) che lega tutte le forme di VEGFA.
AS1411
Oligo di 26 nucleotidi (solo G e T) che pare esercitare effetti
antiproliferativi legando la nucleolina (una proteina coinvolta nella
sintesi e maturazione dei ribosomi).
L’aptamero inoltre pare destabilizzare la proteina Bcl2 in B-linfomi,
e NFkB.
AS1411 è in fase clinica II per la cura della leucemia mieloide acuta
e per il tumore del rene
REG1 (Regado Biosciences)
Un aptamero specifico per il fattore di coagulazione IX per il quale
ha una affinità pari a 2.8 nM in studio per operazioni di intervento
percutaneo sulle coronarie.
Contiene 34 nucleotidi e proviene da uno screening SELEX di una
libreria di molecole 2’-ribo purine/2’-fluoropirimidine.
ARC1779 (Archemix)
Un aptamero che lega il dominio A1 del fattore di vonWillebrand
(Kd=2nM) e ha effetto antitrombotico senza attività
anticoagulante.
E’ stato identificato nello screening di una library di oligodegenerati
ed è stato troncato a 39 nucleotidi. La sequenza è stata prodotto
come fosfotioato con un cap al 3’, l’oligo è peghilato.
In fase II per microagiopatie trombotiche in pazienti con patologie
della carotide che subiscono chirurgia della carotide.
NOX-A12 (NOXXON Pharma)
Lega il ligando della chemochine 12, una chemochina ritenuta
rilevante nella metastatizzazione tumorale e nella angiogensi.
E’ un l-RNA (Spiegelmer) sviluppato per trapianto autologo di cellule
emopoietiche in pazienti con linfoma non-Hodgkin (attualmente in
fase I)
APTAMERI IN DIAGNOSTICA
Aptamero legante della tenascina per imaging di
neoplasie in sviluppo da parte della Schering AG
SVANTAGGI DEGLI APTAMERI COME FARMACI
1. Come gli aODN sono molecole relativamente poco stabili
2. Problemi nella distribuzione e nella biodisponibilità
3. Costo di produzione
NB. Possono però essere modificati chimicamente per aumentarne
la stabilità e si possono utilizzare le metodologie di
veicolazione già viste per gli ODN
VANTAGGI DEGLI APTAMERI COME FARMACI
1. Interagiscono specificatamente con i loro target
2. La grande area superficiale degli acidi nucleici permette la
formazione di più interazioni con il bersaglio rispetto ai
farmaci classici, ciò determina un legame molto stretto (Kd
nel range nanomolare e picomolare)
3. Sono in grado di inibire la funzione del loro bersaglio ma
anche di modificare il metabolismo associato a quel bersaglio
es. aptameri anti-trombina bloccano anche la coagulazione del
sangue
UTILIZZO DEGLI APTAMERI
L’UTILIZZO TERAPEUTICO è ancora incerto
Sono utili MEZZI DIAGNOSTICI grazie alla loro alta affinità e
specificità per il bersaglio.
Come gli anticorpi possono essere legati a molecole radioattive o
ad enzimi la cui attività può essere facilmente valutata. Sono però
più piccoli e maneggevoli degli anticorpi
Referenze bibliografiche:
Aptamers as therapeutics
AD Keefe, S Pai and A Ellington
Nature Review on Drug Discovery 9:537, 2010
DECOY
Sono brevi sequenze di DNA omologhe ad una
sequenza consenso per una proteina transattivante.
Il
decoy
legandosi
inibisce
in
riconoscimento
consenso
modo
della
la
funzione
della
competitivo
al
sito
la
sequenza
proteina
con
proteina
di
MECCANISMO D’AZIONE DI DECOY CHE INIBISCONO
LA PROLIFERAZIONE CELLULARE
Ciclina A
cdk
P
RB
E2F
Silente
TTTCGCGC
C-myc
C-myb
Cdc2
Kinase
PCNA
Ciclina A
cdk
RB
P
E2F
TTTCGCGC
Ciclina A
cdk
RB
E2F
TTTCGCGC
P
Transattivante
TTTCGCGC
TTTCGCGC
TTTCGCGC
TTTCGCGC
Silente
DECOYS IN THERAPY
oligonucleotide mimicking a negative regulatory
sequence of promoter C of estrogen receptor alpha
(ER alpha) gene is sufficient for its re-expression in
ER-negative human cancer cell lines
NFκB decoy oligo therapy for IBD (Inflammatory
Bowel Disease)
E2F Decoy Transfection by HVJ-AVE–Liposome
Method Cardiac Allograft Arteriopathy
NUOVI TARGET TERAPEUTICI
DIFFERENZE APTAMERI/DECOY
APTAMERI
• RNA o DNA
filamento
singolo o doppio
• Omologhi di consensus dell’RNA
• legano proteine citoplasmatiche
DECOY
• ODN a doppia elica
• Omologhi di consensus dell’DNA
• legano proteine nucleari
GLI OLIGONUCLEOTIDI ANTI-GENE
(TRIPLEX)
L’oligonucleotide si lega in modo
specifco al DNA, intercalandosi
nella struttura a doppia elica,
formando un tratto di catena
tripla
che
determina
l’inattivazione della replicazione
del DNA e della trascrizione
dell’mRNA
VANTAGGI DELLA TERAPIA ANTIGENE
RISPETTO AGLI ODN
Questa strategia comporta la formazione di un breve tratto a tripla
elica (mediante legami di Hoogsteen) nelle regioni di controllo della
trascrizione presenti nel DNA.
Tale modalità di impiego mostra prospettive alquanto interessanti
poiché l’azione diretta sul gene implica l’uso di quantità inferiori di
ODN essendo in questo caso solo due i targets (le due copie del gene)
rispetto ai numerosissimi targets della strategia ODN (le copie
dell’mRNA). Si garantisce inoltre una più durevole attività terapeutica
contando sulla maggiore durata dell’emivita del gene rispetto a quella
del messaggero.
TRIPLEX
 Le prime indicazioni, indirette circa la possibilità di formazione di un
tratto di DNA a tripla elica risale a studi sulla densità ottica con
miscele di poli U e poli A condotti da B. Felsenfeld nel 1957.
 Hoogsteen chiarisce la natura dei legami che consentono la
formazione della tripla elica in tratti omopurinici e omopirimidinici
(AG o TC). In questo contesto la C non presenta atomi disponibili
per un ponte idrogeno con la G prospiciente e deve essere quindi
protonata. Tale reazione può avvenire a un pH leggermente acido
(6,6) e in presenza di ioni bivalenti. In queste condizioni l’ODN
ibridizza con la sequenza omopurinica complementare mediante
legami di Hoogsteen, formando così le due triplette T-AT e C-GC.
L’ODN si colloca nel solco maggiore del duplex preesistente con una
orientazione parallela alla sequenza omopurinica del DNA bersaglio.
LEGAMI DI HOOGSTEEN
PROBLEMATICHE DELLA TERAPIA ANTI-GENE
1. Il
bersaglio
deve
essere
omopuriniche/pirimidiniche
costituito
da
sequenze
2. La lunghezza della sequenza bersaglio deve essere minimo di 15
nucleotidi consecutivi
3. Il rapporto A/G non deve essere inferiore a 4
 molte sequenze 5’ rispetto ai DNA codificanti hanno tratti
omopurinici
4. Tutte le C devono essere protonate e quindi occorre agire a pH più
bassi di quello fisiologico.
 Questo problema può essere superato con alcuni stratagemmi
METODICHE PER SUPERARE L’OSTACOLO DELLA
PROTONAZIONE
1. utilizzo nella sintesi dell’ODN di 5-metilcitosina che
consente l’ibridizzazione al duplex anche a pH neutri
2. Utilizzare ODN costituiti da PNA che hanno una migliore
capacità di ibridizzare
3. Utilizzo di molecole intercalanti legate all’ODN, capaci di
legare una base sul duplex conferendo una maggiore
stabilità alla tripla elica
4. Sostituire la base citosina con l’eterociclo 2aminopiridina, il cui pKa è maggiore di quello della
citosina e ciò favorisce il legame a pH neutro
CHIMICA DEL LEGAME PNA-DNA
I PNA possono legarsi al DNA sia attraverso legami idrogeno sia di Hoogsteen
CH3
5’
5’
3’
CH3
3’
T
3’
3’
O
N
5’
5’
N
O
O
H
H
N
H
N
PNA
Strand
invasion
Hoogsteen
T
H
N
N
N
N
O
N
Watson - Crick
A
Watson-Crick
+
NH
3
PNA Strand
C T C T T C T T C
DNA Strand '3
G A G A A G A A G
5'
C T C T T C T T C
NH3+
Hoogsteen
PNA Strand
COO -
COO-
I RIBOZIMI
RIBOZIMI NATURALI
Producono nel taglio di un RNA substrato estremità 3’OH e 5’
fosfato.
Sono raggruppabili in classi in base alla loro struttura ed alle
reazioni in cui sono coinvolti
RNAsi P:
Ubiquitaria, è responsabile della maturazione
dei tRNA nel loro estremo 5’
RNAsi HRP:
Replicazione DNA mitocondriale tagliando RNA
primer
INTRONI tipo I: Tetrahymena
pre RNA mitocondriale di lievito
geni di cloroplasti
INTRONI tipo II: con meccanismo di splicing conservato
(precursori di mRNA in organelli di funghi e
piante)
CARATTERISTICHE COMUNI AI RIBOZIMI
 Reazione di formazione e rottura di legami covalenti in molecole
substrato a RNA
 I ribozimi sono catalizzatori di reazioni che li vedono altresì
implicati come substrato
 La struttura tridimensionale dell’enzima determina la sua specificità
di legami con il substrato a creare il sito catalitico
 Le reazioni catalizzate sono basate sullo scambio di protoni (con
conseguente idrolisi o transesterificazione risultanti nel taglio di
legami fosfodiesterici)
 I ribozimi sono metallo-enzimi
MECCANISMO D’AZIONE DEGLI
INTRONI DI TIPO I
1. Attacco
nucleofilo della
guanina presente
nell’ambiente
2. Generazione di
un terminale OH
3. Seconda
transesterificazio
ne per attacco
nucleofilo del
terminale libero
sul primo
nucleotide
dell’esone in 3’
SITI ATTIVI NEGLI INTRONI DI TIPO I
ex2
3'
3'G414
OH
414
G
G-binding site
G-OH
5' G
ex1
5'
Substrate
binding
site
3'
CUCUCU
GGGAGG
2nd transfer
IGS
UUUACCU
GGGAGG
ex1
+
ex2
1st transfer
ex2
3rd transfer
G414
ex1
5'
G 414
CUCUCU OH
GGGAGG
G 5'
GGGAGG
+
5' G
UUUACCU
MECCANISMO D’AZIONE DEGLI INTRONI
DI TIPO II
• Usano il 2’ OH di una
adenina interna all’introne
2’ A
• Attacca il 5’ fosfato sul
Exon 1 HO
Exon 2
primo nucleotide dell’introne
• L’introne assume una
struttura circolare tipica
detta “lariat”
2’ A
• Gli esoni sono uniti e l’introne
OH
è exciso mantenendo la
struttura “lariat”
• Un enzima appositamente
Exon 1+2
deputato taglia il “lariat” e
2’ A
+
origina un introne lineare
• L’introne lineare viene
degradato
STRUTTURA DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD
Lo schema rappresenta il cambiamento di struttura in due fasi,
indotto dal legame di ioni Mg2+.
La prima fase consiste nella formazione di un dominio coassiale tra
due eliche la seconda genera il core catalitico.
Il ribozima con la struttura finale è in grado di auto-tagliarsi nel
punto indicato dalla freccia rossa
STRUTTURA CRISTALLOGRAFICA DEI
RIBOZIMI HAMMERHEAD
La struttura
cristallina
evidenzia 5 siti di
legame per il Mg2+
STRUTTURA SECONDARIA E TERZIARIA
DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD
La sequenza CUGA adiacente allo
stem loop I è sufficiente per il
taglio
Struttura terziaria
RIBOZIMI MECCANISMO D’AZIONE -1
RNA è una molecola meno stabile del DNA perché l’O in 2’ può
attaccare il legame fosfodiesterico adiacente (attacco nucleofilo) e
romperlo, lasciando un fosfato 2’-3’ ciclico e un ossidrile in 5’.
MODALITA’ DI TAGLIO DI RNA:
RNAsi P e introni di tipo I e II catalizzano l’idrolisi del legame
fosfodiesterico, lasciando un fosfato in 5’ e un ossidrile in 3’
Le reazioni di taglio che dipendono dall’O in 2’ possono essere
attivate in due modi:
1) Ambiente alcalino: l’O in 2’ si attiva per ionizzazione
2) Ribonucleasi A catalizza la reazione di taglio usando un residuo
basico di istidina per spostare il protone dell’O al 2’ e un residuo
acido di aspartato per trasferirlo al 5’
RIBOZIMI MECCANISMO D’AZIONE -2
La carica positiva di un residuo di lisina adiacente interagisce con il
fosfato e lo stabilizza durante lo stato di transizione.
Il fosforo tende ad assumere una conformazione a bipiramide trigonale
durante lo stato di transizione e questo può spiegare perché il taglio
mediato dall’O al 2’ è più rapido in presenza di nucleotidi (pirimidina,
adenosina) specifici perché le interazioni tra basi possono influenzare
la conformazione del legame fosfodiestere
APPLICAZIONI TERAPEUTICHE DEI RIBOZIMI-1
Sono attivi in “CIS” cioè intramolecolarmente. Studi in corso
prevedono manipolazioni per indurli a lavorare in “TRANS” ad
esempio per il riparo di RNA mutati o danneggiati.
Esempio: ripristino del controllo della proliferazione cellulare
agendo su p53
mRNA mutato
mRNA corretto
+
Ribozima con mRNA corretto
mRNA scartato
+
+
ribozima
RIBOZIMI IN CLINICAL TRIALS-1
ANGIOZYME TM
Ribozima disegnato per inibire il VEGF (Vascular Endothelial
Growth Factor).
ANGIOGENESIS
HEPTAZYME TM
Ribozima che lega sequenze altamente conservate del
virus dell’epatite C
HCV DRUG RESISTANCE