CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL
FARMACO
Adriana Maggi
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
AA 2008/09
LEZIONE 6
Acidi nucleici e farmaci
GLI OLIGONUCLEOTIDI ANTI-GENE
(TRIPLEX)
L’oligonucleotide si lega in modo
specifco al DNA, intercalandosi
nella struttura a doppia elica,
formando un tratto di catena
tripla
che
determina
l’inattivazione della replicazione
del DNA e della trascrizione
dell’mRNA
VANTAGGI DELLA TERAPIA ANTIGENE
RISPETTO AGLI ODN
Questa strategia comporta la formazione di un breve tratto a tripla
elica (mediante legami di Hoogsteen) nelle regioni di controllo della
trascrizione presenti nel DNA.
Tale modalità di impiego mostra prospettive alquanto interessanti
poiché l’azione diretta sul gene implica l’uso di quantità inferiori di
ODN essendo in questo caso solo due i targets (le due copie del gene)
rispetto ai numerosissimi targets della strategia ODN (le copie
dell’mRNA). Si garantisce inoltre una più durevole attività terapeutica
contando sulla maggiore durata dell’emivita del gene rispetto a quella
del messaggero.
TRIPLEX
 Le prime indicazioni, indirette circa la possibilità di formazione di un
tratto di DNA a tripla elica risale a studi sulla densità ottica con
miscele di poli U e poli A condotti da B. Felsenfeld nel 1957.
 Hoogsteen chiarisce la natura dei legami che consentono la
formazione della tripla elica in tratti omopurinici e omopirimidinici
(AG o TC). In questo contesto la C non presenta atomi disponibili
per un ponte idrogeno con la G prospiciente e deve essere quindi
protonata. Tale reazione può avvenire a un pH leggermente acido
(6,6) e in presenza di ioni bivalenti. In queste condizioni l’ODN
ibridizza con la sequenza omopurinica complementare mediante
legami di Hoogsteen, formando così le due triplette T-AT e C-GC.
L’ODN si colloca nel solco maggiore del duplex preesistente con una
orientazione parallela alla sequenza omopurinica del DNA bersaglio.
LEGAMI DI HOOGSTEEN
PROBLEMATICHE DELLA TERAPIA ANTI-GENE
1. Il
bersaglio
deve
essere
omopuriniche/pirimidiniche
costituito
da
sequenze
2. La lunghezza della sequenza bersaglio deve essere minimo di 15
nucleotidi consecutivi
3. Il rapporto A/G non deve essere inferiore a 4
 molte sequenze 5’ rispetto ai DNA codificanti hanno tratti
omopurinici
4. Tutte le C devono essere protonate e quindi occorre agire a pH più
bassi di quello fisiologico.
 Questo problema può essere superato con alcuni stratagemmi
METODICHE PER SUPERARE L’OSTACOLO DELLA
PROTONAZIONE
1. utilizzo nella sintesi dell’ODN di 5-metilcitosina che
consente l’ibridizzazione al duplex anche a pH neutri
2. Utilizzare ODN costituiti da PNA che hanno una migliore
capacità di ibridizzare
3. Utilizzo di molecole intercalanti legate all’ODN, capaci di
legare una base sul duplex conferendo una maggiore
stabilità alla tripla elica
4. Sostituire la base citosina con l’eterociclo 2aminopiridina, il cui pKa è maggiore di quello della
citosina e ciò favorisce il legame a pH neutro
CHIMICA DEL LEGAME PNA-DNA
I PNA possono legarsi al DNA sia attraverso legami idrogeno sia di Hoogsteen
CH3
5’
5’
3’
CH3
3’
T
3’
3’
O
N
5’
5’
N
O
O
H
H
N
H
N
PNA
Strand
invasion
Hoogsteen
T
H
N
N
N
N
O
N
Watson - Crick
A
Watson-Crick
+
NH
3
PNA Strand
C T C T T C T T C
DNA Strand '3
G A G A A G A A G
5'
C T C T T C T T C
NH3+
Hoogsteen
PNA Strand
COO -
COO-
I RIBOZIMI
RIBOZIMI NATURALI
Producono nel taglio di un RNA substrato estremità 3’OH e 5’
fosfato.
Sono raggruppabili in classi in base alla loro struttura ed alle
reazioni in cui sono coinvolti
RNAsi P:
Ubiquitaria, è responsabile della maturazione
dei tRNA nel loro estremo 5’
RNAsi HRP:
Replicazione DNA mitocondriale tagliando RNA
primer
INTRONI tipo I: Tetrahymena
pre RNA mitocondriale di lievito
geni di cloroplasti
INTRONI tipo II: con meccanismo di splicing conservato
(precursori di mRNA in organelli di funghi e
piante)
CARATTERISTICHE COMUNI AI RIBOZIMI
 Reazione di formazione e rottura di legami covalenti in molecole
substrato a RNA
 I ribozimi sono catalizzatori di reazioni che li vedono altresì
implicati come substrato
 La struttura tridimensionale dell’enzima determina la sua specificità
di legami con il substrato a creare il sito catalitico
 Le reazioni catalizzate sono basate sullo scambio di protoni (con
conseguente idrolisi o transesterificazione risultanti nel taglio di
legami fosfodiesterici)
 I ribozimi sono metallo-enzimi
MECCANISMO D’AZIONE DEGLI
INTRONI DI TIPO I
1. Attacco
nucleofilo della
guanina presente
nell’ambiente
2. Generazione di
un terminale OH
3. Seconda
transesterificazio
ne per attacco
nucleofilo del
terminale libero
sul primo
nucleotide
dell’esone in 3’
SITI ATTIVI NEGLI INTRONI DI TIPO I
ex2
3'
3'G414
OH
414
G
G-binding site
G-OH
5' G
ex1
5'
Substrate
binding
site
3'
CUCUCU
GGGAGG
2nd transfer
IGS
UUUACCU
GGGAGG
ex1
+
ex2
1st transfer
ex2
3rd transfer
G414
ex1
5'
G 414
CUCUCU OH
GGGAGG
G 5'
GGGAGG
+
5' G
UUUACCU
MECCANISMO D’AZIONE DEGLI INTRONI
DI TIPO II
• Usano il 2’ OH di una
adenina interna all’introne
2’ A
• Attacca il 5’ fosfato sul
Exon 1 HO
Exon 2
primo nucleotide dell’introne
• L’introne assume una
struttura circolare tipica
detta “lariat”
2’ A
• Gli esoni sono uniti e l’introne
OH
è exciso mantenendo la
struttura “lariat”
• Un enzima appositamente
Exon 1+2
deputato taglia il “lariat” e
2’ A
+
origina un introne lineare
• L’introne lineare viene
degradato
STRUTTURA DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD
Lo schema rappresenta il cambiamento di struttura in due fasi,
indotto dal legame di ioni Mg2+.
La prima fase consiste nella formazione di un dominio coassiale tra
due eliche la seconda genera il core catalitico.
Il ribozima con la struttura finale è in grado di auto-tagliarsi nel
punto indicato dalla freccia rossa
STRUTTURA SECONDARIA E TERZIARIA
DEI RIBOZIMI HAMMERHEAD
La sequenza CUGA adiacente allo
stem loop I è sufficiente per il
taglio
Struttura terziaria
STRUTTURA CRISTALLOGRAFICA DEI
RIBOZIMI HAMMERHEAD
La struttura
cristallina
evidenzia 5 siti di
legame per il Mg2+
PICCOLI RNA CATALITICI-1
VIROIDI
Molecole di RNA
infettive che
funzionano
indipendentemente,
prive di capside
proteico
VIRUSOIDI
Simili ai viroidi ma sono
incapsulati
insieme
al
genoma virale in virus di
piante.
Non
replicano
indipendentemente
dal
virus. Sono perciò detti
RNA satelliti
PICCOLI RNA CATALITICI-MECCANISMO D’AZIONE
1. legame
fosfodiestere intatto
2. Stato di transizione
che coordina il mg2+
3. Taglio del legame
fosfodiestere
Questi RNA promuovono reazioni di auto-taglio. Tale reazione è
favorita da cationi divalenti e genera terminali 5’ OH e 2’-3’ ciclici.
Molti di essi per tagliare assumono una struttura hammerhead
RIBOZIMI MECCANISMO D’AZIONE -1
RNA è una molecola meno stabile del DNA perché l’O in 2’ può
attaccare il legame fosfodiesterico adiacente (attacco nucleofilo) e
romperlo, lasciando un fosfato 2’-3’ ciclico e un ossidrile in 5’.
MODALITA’ DI TAGLIO DI RNA:
RNAsi P e introni di tipo I e II catalizzano l’idrolisi del legame
fosfodiesterico, lasciando un fosfato in 5’ e un ossidrile in 3’
Le reazioni di taglio che dipendono dall’O in 2’ possono essere
attivate in due modi:
1) Ambiente alcalino: l’O in 2’ si attiva per ionizzazione
2) Ribonucleasi A catalizza la reazione di taglio usando un residuo
basico di istidina per spostare il protone dell’O al 2’ e un residuo
acido di aspartato per trasferirlo al 5’
RIBOZIMI MECCANISMO D’AZIONE -2
La carica positiva di un residuo di lisina adiacente interagisce con il
fosfato e lo stabilizza durante lo stato di transizione.
Il fosforo tende ad assumere una conformazione a bipiramide trigonale
durante lo stato di transizione e questo può spiegare perché il taglio
mediato dall’O al 2’ è più rapido in presenza di nucleotidi (pirimidina,
adenosina) specifici perché le interazioni tra basi possono influenzare
la conformazione del legame fosfodiestere
APPLICAZIONI TERAPEUTICHE DEI RIBOZIMI-1
Sono attivi in “CIS” cioè intramolecolarmente. Studi in corso
prevedono manipolazioni per indurli a lavorare in “TRANS” ad
esempio per il riparo di RNA mutati o danneggiati.
Esempio: ripristino del controllo della proliferazione cellulare
agendo su p53
mRNA mutato
mRNA corretto
+
Ribozima con mRNA corretto
mRNA scartato
+
+
ribozima
RIBOZIMI IN CLINICAL TRIALS-1
ANGIOZYME TM
Ribozima disegnato per inibire il VEGF (Vascular Endothelial
Growth Factor).
ANGIOGENESIS
HEPTAZYME TM
Ribozima che lega sequenze altamente conservate del
virus dell’epatite C
HCV DRUG RESISTANCE
RIBOZIMI IN CLINICAL TRIALS-2
HIV Gene Therapy...
Bone Marrow Sample
Treat Stem Cells with Retroviral Vector
Encodes Gene for anti-HIV Ribozyme
Re-Implant Treated Cells
APTAMERI
Sono ORN o ODN capaci di riconoscere una specifica
sequenza amminoacidica o un epitopo appartenente ad una
proteina
Sono stati scoperti per caso osservando l’alterazione del
processo di coagulazione, dovuto ad un aumento del tempo di
protrombina
in
seguito
alla
somministrazione
di
ODN
antisenso.
In queste molecole e’ presente un “G quartet” che conferisce
al DNA la capacità di legare la trombina inattivandola
APTAMERO PER L’a-TROMBINA
Organizzazione strutturale dell’aptamero per l’a-trombina e disposizione dei
quartetti di guanina che ne stabilizzano la conformazione
APTAMERI CON STRUTTURA 3D DETERMINATA
Acido nucleico
Affinita’ Kd (mM)
Teofillina
RNA
0,3
FMN
RNA
0,5
AMP
DNA/RNA
6/10
Arginina
DNA/RNA
125/60
Citrullina
RNA
65
Tobramicina
RNA
0,009
Neomicina B
RNA
0,115
HIV-1 Rev peptide
RNA
0,004
HTLV-1 Rex peptide
RNA
0,025
MS2 coat protein
RNA
ND
Trombina
DNA
0,025
Ligando
STRUTTURA DI ALCUNI APTAMERI
Riconoscimento di
ligandi aromatici
piatti:
A: strutture
B: teofillina-RNA C:
FMN-RNA
D: AMP-DNA
E: AMP-RNA
Riconoscimento
dell’antibiotico
aminoglicoside
tobramicina:
A: struttura
B: aptamero
tobramicina-RNA C:
la tasca che
accoglie il ligando
Riconoscimento di
aminoacidi basici:
A: strutture
B,C: arginina-DNA
D: arginina-RNA
E: citrullina-RNA
Riconoscimento di
peptidi e proteine:
A:peptide derivante
dalla proteina Rev
del virus umano HIV1
B,C: diversi aptameri
RNA Rev D, E:
aptamero proteina di
rivestimento del
batteriofago MS2RNA
MOTIVI STRUTTURALI CHE RICONOSCONO IL
DNA
FLESSIBILITA’ DEL DNA
Struttura del complesso CAP-DNA. Il DNA risulta ripiegato in due
punti in seguito all’interazione con la proteina. I cilindri
rappresentano la regione proteica interessata.
SELEZIONE DEGLI APTAMERI-1
 A tutt’oggi è impossibile indicare a priori se esistano e quali siano
le sequenze di DNA in grado di riconoscere una definita struttura
enzimatica
 L’analisi basata sui metodi computazionali richiede tempi di
elaborazione
esageratamente
prolungati
per
stabilire
la
conformazione spaziale di macromolecole
 L’isolamento di aptameri ad attività biologica richiede lo sviluppo
di metodologie sperimentali specifiche
SELEX ( Systematic evolution of ligands by
exponential amplification)
Random or doped DNA pool
Regenerated DNA pool
Trascribed RNA pool
cDNA
1. Generazione di una
diversità di sequenza
(sintesi chimica,
manipolazione enzimatica,
PCR)
2. Selezione di forme
funzionali attraverso il
legame con il bersaglio e
l’eliminazione di molecole
non affini
3. Amplificazione della
popolazione selezionata
con metodiche di PCR
4. Step successivi di
selezione e
riamplificazione per
isolare le molecole più
efficienti
UTILIZZO DEGLI APTAMERI
L’UTILIZZO TERAPEUTICO è ancora incerto
Sono utili MEZZI DIAGNOSTICI grazie alla loro alta affinità e
specificità per il bersaglio.
Come gli anticorpi possono essere legati a molecole radioattive o
ad enzimi la cui attività può essere facilmente valutata. Sono però
più piccoli e maneggevoli degli anticorpi
APTAMERI IN TERAPIA
Il primo aptamero approvato come farmaco è stato il
MACUGEN per il trattamento della degenarazione maculare
(OSI Pharmaceuticals).
Archemix (Cambridge, Ma) sviluppa aptameri antagonisti del
Fattore di Willebrand attualmente in Fase clinica 2 per
sindrome acuta coronarica
Aptameri non modificati sono in studio per la coagulazione
ematica e per la terapia di patologie oculari
APTAMERI IN DIAGNOSTICA
Aptamero legante della tenascina per imaging di
neoplasie in sviluppo da parte della Schering AG
SVANTAGGI DEGLI APTAMERI COME FARMACI
1. Come gli aODN sono molecole relativamente poco stabili
2. Problemi nella distribuzione e nella biodisponibilità
3. Costo di produzione
NB. Possono però essere modificati chimicamente per aumentarne
la stabilità e si possono utilizzare le metodologie di
veicolazione già viste per gli ODN
VANTAGGI DEGLI APTAMERI COME FARMACI
1. Interagiscono specificatamente con i loro target
2. La grande area superficiale degli acidi nucleici permette la
formazione di più interazioni con il bersaglio rispetto ai
farmaci classici, ciò determina un legame molto stretto (Kd
nel range nanomolare e picomolare)
3. Sono in grado di inibire la funzione del loro bersaglio ma
anche di modificare il metabolismo associato a quel bersaglio
es. aptameri anti-trombina bloccano anche la coagulazione del
sangue
DECOY
Sono brevi sequenze di DNA omologhe ad una
sequenza consenso per una proteina transattivante.
Il
decoy
legandosi
inibisce
in
riconoscimento
consenso
modo
della
la
funzione
della
competitivo
al
sito
la
sequenza
proteina
con
proteina
di
MECCANISMO D’AZIONE DI DECOY CHE INIBISCONO
LA PROLIFERAZIONE CELLULARE
Ciclina A
cdk
P
RB
E2F
Silente
TTTCGCGC
C-myc
C-myb
Cdc2
Kinase
PCNA
Ciclina A
cdk
RB
P
E2F
TTTCGCGC
Ciclina A
cdk
RB
E2F
TTTCGCGC
P
Transattivante
TTTCGCGC
TTTCGCGC
TTTCGCGC
TTTCGCGC
Silente
DECOYS IN THERAPY
oligonucleotide mimicking a negative regulatory
sequence of promoter C of estrogen receptor alpha
(ER alpha) gene is sufficient for its re-expression in
ER-negative human cancer cell lines
NFκB decoy oligo therapy for IBD (Inflammatory
Bowel Disease)
E2F Decoy Transfection by HVJ-AVE–Liposome
Method Cardiac Allograft Arteriopathy
NUOVI TARGET TERAPEUTICI
DIFFERENZE APTAMERI/DECOY
APTAMERI
• RNA o DNA
filamento
singolo o doppio
• Omologhi di consensus dell’RNA
• legano proteine citoplasmatiche
DECOY
• ODN a doppia elica
• Omologhi di consensus dell’DNA
• legano proteine nucleari