DROSOPHILA
Ciclo vitale
La drosophila ha
un ciclo vitale
rapido
3mm
0,5mm
4d
1d
Fecondazione/embriogenesi
3d
1d
1d
1 coppia di moscerini genera CENTINAIA di individui in 14dd.
La progenie diventa matura sessualmente in 1 settimana.
La Drosophila è un ottimo sistema modello:
1) Ha un ciclo vitale rapido e produttivo
2) Animale piccolo, facile da sfamare e da crescere (molti
individui in poco spazio)
3) “Piccolo genoma”: 105 Mb (5% genoma umano
4) 4 cromosomi (2 autosomi + X + piccolo)
5) 14.000 geni
6) 100 anni di genetica
7) 75% geni umani identificati in Drosophila
MA……..
1) I ceppi non possono essere congelati. Richiesta di
coltura continua.
2) Non è possibile effettuare RICOMBINAZIONE
OMOLOGA (no gene targeting)
METODI PER CREARE DROSOPHILA MUTANTE
(TRANSGENICA)
RAGGI IONIZZANTI (raggi X):
• SI: produzione di rotture cromosomiche visibili. Facile
identificazione del gene
• NO: mutagenesi complesse in porzioni limitate di tessuto 1/1000
MUTAGENESI CHIMICA (EMS etc.)
• SI: mutagenesi di singole basi del genoma
• NO: difficili da localizzare 1/10000
MUTAGENESI mediata dai TRASPOSONI (P-elements etc.)
• SI: singolo evento facile da localizzare (gene reporter)
• NO: non random. Solo alcuni geni sono bersaglio.
Elementi mobili in Drosophila
Il 15% del genoma di Drosophila è MOBILE
•Esistono 80 tipi differenti di ELEMENTI TRASPONIBILI
•Lunghezza tra 50-10.000bp (media 5Kb)
•Da 1 a 1000 copie nel genoma (circa 50/genoma)
•Molti sono specie specifici
1) ELEMENTO COPIA
2) ELEMENTO P: elemento mobile del genoma.
lunghezza variabile tra 500-2900 bp
Aggiunta RECENTISSIMA nel genoma di Drosophila Melanogaster
Studi del 1992 hanno osservato che gli elementi P provengono da un’altra specie
che ha “contaminato” la D.m. intorno al 1950.
L’elemento P
L’elemento P
Gli elementi P si muovono mediante
un meccanismo di COPIA e INCOLLA
STOP
ORF0-ORF1-ORF2
ORF0-ORF1-ORF2-ORF3
http://www.oup.co.uk/best.textbooks/
Gli elementi P
sono presenti sui cromosomi
di TUTTI I TESSUTI ma
LA TRASPOSASI E’ ATTIVA
SOLO NELLE CELLULE
GERMINALI
L’elemento P
In presenza della TRASPOSASI, qualsiasi frammento di DNA posto tra le
regioni terminali invertite puo’ essere MOBILIZZATO
Tutto ciò che è
all’interno
delle seq ripetute
viene mobilizzato
L’elemento P si integra preferibilmente nelle estremità 5’-3’ del gene ospite
o tende ad inserirsi nelle vicinanze di altri elementi P ed ha una leggera
preferenza per sequenze target GGCCAGAC
CEPPO di DROSOPHILA con elemento P (circa 30-50 copie): ceppo P
CEPPO di DROSOPHILA senza elemento P: ceppo M
L’elemento P è CAUSA della DISGENESI DEGLI IBRIDI
Disgenesi degli Ibridi
Incapacità di certi ceppi di Drosophila di incrociarsi in modo
Produttivo poiché generano ibridi sterili
(benché fenotipicamente simili)
Gli IBRIDI generati da questi incroci sono DISGENICI:
Aberrazioni cromosomiche
Mutazioni
Sterilità
Alterata segregazione alla meiosi
Disgenesi degli Ibridi è ASIMMETRICA
L’elemento P è CAUSA della DISGENESI DEGLI IBRIDI
CEPPO di DROSOPHILA con elemento P: ceppo P
CEPPO di DROSOPHILA senza elemento P: ceppo M
http://www.oup.co.uk/best.textbooks/
Disgenesi degli Ibridi
Nel citoplasma
delle UOVA
di ceppo P
Elevati livelli
di
repressore
LA TRASPOSASI E’
ATTIVA
SOLO NELLE CELLULE
GERMINALI
(splicing)
Riarrangiamenti
cromosomici
STERILITA’
Nel citoplasma
delle UOVA
di ceppo M
NO Repressore
SI Trasposasi
PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P
Elemento P come
vettore per il
trasferimento genico
Spradling and Rubin
(Science 1982)
sviluppano un sistema
per l’integrazione
delle sequenze clonate
nell’elemento P nei
cromosomi della linea
germinale
+ TRASPOSASI
PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P
PLASMIDE DONATORE:
1) transgene di interesse (tra seq
ripetute invertite 5’P-3’P)
2) gene reporter (LacZ)
3) Gene marker (wt+ occhi rossi)
Embrione wt -/-
PLASMIDE conTRASPOSASI:
1) Codifica per trasposasi
2) Sequenza ripetuta 5’p difettiva
TRASPOSASI INATTIVA
Iniezione dei 2 vettori in embrione precoce
DNA esogeno entra in alcune cellule
Nelle cellule della linea germinale: elemento P TRASPONIBILE
PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P
ROSY -
ROSY -
ROSY +
ROSY ROSY +
DROSOPHILA TRANSGENICA
1. “ENHANCER TRAP”
2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI
3. STUDIO DI PROMOTORI
TECNICA dell’ENHANCER TRAP
Un enhancer trap contiene un promotore minimo, insufficiente di per sé,
per indurre la trascrizione. Se, dopo la trasposizione si inserisce in una
regione sotto l’influenza di un enhancer genomico, la sequenza inserita
dovrebbe essere trascritta in maniera che riflette l’attività dell’enhancer.
Tecnica utilizzata per:
1) Identificazione di nuovi geni
2) Analisi dell’espressione di geni
tempo/tessuto specifici
3) Permette analisi molti geni
simultaneamente
TECNICA dell’ENHANCER TRAP
A) Enhancer TRAP P(LacZ) e B) Enhancer TRAP GAL4
A) Enhancer TRAP P(LacZ): gene reporter codifica per la beta-galattosidasi
L’attività dell’enhancer è localizzata tramite immunoistochimica o reazione con X-gal.
A) Enhancer TRAP P(LacZ)
1) LINEE “ENHANCER TRAP”
a) Banche di drosophila con pattern espressione, collezione di
oltre 4000 ceppi
b) Con incroci specifici si possono studiare vari pattern di
espressione
B) Enhancer TRAP GAL4:
sistema di Lievito. GAL4 attiva
trascrizione di geni a valle di UAS (Upstream Activating Sequence)
Utilizzato per IDENTIFICARE NUOVI GENI e SOVRAESPRESSIONE di geni
LIEVITO
DROSOPHILA
2) Enhancer TRAP GAL4
per identificazione di NUOVI GENI
GAL4 è prodotto SOLAMENTE se si inserisce sotto enhancer
Gene reporter (LacZ/GFP) è espresso solo se GAL4 lega la seq UAS
GAL4/UAS

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO
di TRANSGENI
GAL4/UAS:
sovraespressione di TRANSGENI tessuto specifica
GAL4/UAS:
sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica
Collezione di
ceppi di Drosophila
1)
2)
3)
Promotore UBIQUITARIO
Promotore SPECIFICO (spazio)
Promotore Temp-SENS (tempo)
IL TRANSGENE (GENE X ) E’ ESPRESSO SOLAMENTE NEL TESSUTO SPECIFICO
GAL4/UAS:
sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica
PROMOTORE
Tessuto specifico
ESISTONO MIGLIAIA di CEPPI di
DROSOPHILA CHE ESPRIMONO GAL4
IN DIFFERENTI TESSUTI E STADI
DIFFERENTI DELLO SVILUPPO
GAL4/UAS

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO
di TRANSGENI
SPAZIO
TEMPO
GAL4/UAS:
sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica
Tecnica molto utilizzata per studio di ONCOGENI
•WT
•MUTATO
•DELETO
•antisenso
WT
UAS/Cbl oncogene
GAL4/UAS:
sovraespressione di TRANSGENI tessuto specifica
Studio del PROMOTORE
Drosophila puo’ essere un ottimo strumento per l’ANALISI del PROMOTORE:
identificazione di regioni NECESSARIE per la funzione del Promotore
Vengono prodotti MUTANTI di DELEZIONE fusi al gene LacZ
Il geni ibrido viene fuso nell’elemento P e inserito nell’embrione
L’attività della betagalattosidasi permette di identificare
La regione MINIMA del PROMOTORE e sequenze NECESSARIE alla sua regolazione
Studio del PROMOTORE
Analisi del PROMOTORE del gene DRONC: caspasi di Drosophila
essenziale per apoptosi durante lo sviluppo embrionale del moscerino.
Distinct promoter regions regulate
spatial and temporal expression of
the Drosophila caspase dronc
T J Daish, D Cakouros and S Kumar
embrione
cervello
intestino
ghiandole salivari