DROSOPHILA TRANSGENICA
1. “ENHANCER TRAP”
2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI
3. STUDIO DI PROMOTORI
TECNICA dell’ENHANCER TRAP
Un enhancer trap contiene un promotore minimo, insufficiente di per sé,
per indurre la trascrizione. Se, dopo la trasposizione si inserisce in una
regione sotto l’influenza di un enhancer genomico, la sequenza inserita
dovrebbe essere trascritta in maniera che riflette l’attività dell’enhancer.
Tecnica utilizzata per:
1) Identificazione di nuovi geni
2) Analisi dell’espressione di geni
tempo/tessuto specifici
3) Permette analisi molti geni
simultaneamente
TECNICA dell’ENHANCER TRAP
A) Enhancer TRAP P(LacZ) e B) Enhancer TRAP GAL4
A) Enhancer TRAP P(LacZ): gene reporter codifica per la beta-galattosidasi
L’attività dell’enhancer è localizzata tramite immunoistochimica o reazione con X-gal.
A) Enhancer TRAP P(LacZ)
1) LINEE “ENHANCER TRAP”
a) Banche di drosophila con pattern espressione, collezione di
oltre 4000 ceppi
b) Con incroci specifici si possono studiare vari pattern di
espressione
B) Enhancer TRAP GAL4:
sistema di Lievito. GAL4 attiva
trascrizione di geni a valle di UAS (Upstream Activating Sequence)
Utilizzato per IDENTIFICARE NUOVI GENI e SOVRAESPRESSIONE di geni
LIEVITO
DROSOPHILA
2) Enhancer TRAP GAL4
per identificazione di NUOVI GENI
GAL4 è prodotto SOLAMENTE se si inserisce sotto enhancer
Gene reporter (LacZ/GFP) è espresso solo se GAL4 lega la seq UAS
GAL4/UAS

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO
di TRANSGENI
GAL4/UAS:
sovraespressione di TRANSGENI tessuto specifica
GAL4/UAS:
sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica
Collezione di
ceppi di Drosophila
1)
2)
3)
Promotore UBIQUITARIO
Promotore SPECIFICO (spazio)
Promotore Temp-SENS (tempo)
IL TRANSGENE (GENE X ) E’ ESPRESSO SOLAMENTE NEL TESSUTO SPECIFICO
GAL4/UAS:
sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica
PROMOTORE
Tessuto specifico
ESISTONO MIGLIAIA di CEPPI di
DROSOPHILA CHE ESPRIMONO GAL4
IN DIFFERENTI TESSUTI E STADI
DIFFERENTI DELLO SVILUPPO
GAL4/UAS

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO
di TRANSGENI
SPAZIO
TEMPO
GAL4/UAS:
sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica
Tecnica molto utilizzata per studio di ONCOGENI
•WT
•MUTATO
•DELETO
•antisenso
WT
UAS/Cbl oncogene
Studio del PROMOTORE
Drosophila puo’ essere un ottimo strumento per l’ANALISI del PROMOTORE:
identificazione di regioni NECESSARIE per la funzione del Promotore
Vengono prodotti MUTANTI di DELEZIONE fusi al gene LacZ
Il geni ibrido viene fuso nell’elemento P e inserito nell’embrione
L’attività della betagalattosidasi permette di identificare
la regione MINIMA del PROMOTORE e sequenze NECESSARIE alla sua regolazione
Studio del PROMOTORE
Analisi del PROMOTORE del gene DRONC: caspasi di Drosophila
essenziale per apoptosi durante lo sviluppo embrionale del moscerino.
Distinct promoter regions regulate
spatial and temporal expression of
the Drosophila caspase dronc
T J Daish, D Cakouros and S Kumar
embrione
cervello
intestino
ghiandole salivari
RNA interference
Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in
Caenorhabditis elegans
ANDREW FIRE*, SIQUN XU*, MARY K. MONTGOMERY*,
STEVEN A. KOSTAS*†, SAMUEL E. DRIVER‡ & CRAIG C. MELLO‡
Fire at al, Nature V391 pp 806-811 (1998)
dsRNAi is cut in 21-23 nt fragments
Zamore et al, Cell, v101 pp25-33 (2000)
Ambion Inc. Austin, Texas, USA