Biotecnologie Farmacologiche e
Basi molecolari dell’azione del farmaco
AA 2010/11
Lezione 19
Adriana Maggi
FARMACI BIOLOGICI
Per la Comunità Europea, un composto o
un farmaco biologico è definito come: “una
sostanza che è prodotta o estratta da una
sorgente biologica che richiede per la sua
caratterizzazione e controllo di qualità una
combinazione di analisi fisiche-chimiche e
biologiche, insieme al processo di
produzione e suoi controlli”
(Dir. 2003/63/EC, part I, Section 3.2.1 (b)).
FARMACI BIOTECNOLOGICI
Farmaci biologici prodotti da cellule
procariote o eucariote opportunamente
modificate per opera di ingegneria genetica
Considerando l’origine da organismi viventi
sono da considerare come composti/farmaci
biologici molti antibiotici, ormoni, enzimi,
immunoglobuline, emoderivati…
e tutti i farmaci prodotti grazie a tecnologie
di ingegneria genetica:
IL MINIMO COMUNE DENOMINATORE DI
TUTTI QUESTI COMPOSTI E’ LA
COMPLESSITA’ STRUTTURALE
I biofarmaci hanno dimensioni e struttura
molto più complesse dei prodotti chimici
Prodotti biotecnologici
Prodotti di sintesi
Aspirina
peso molecolare: 180 Da
Interferone beta:
peso molecolare: 19000 Da
Proteine terapeutiche - Svantaggi
1.
2.
3.
4.
5.
6.
nuove metodologie di produzione
riproducibilità nella produzione
purificazione della macromolecola di
sintesi
contaminanti nella purificazione
stabilità del prodotto finito
vie di somministrazione e farmacocinetica
Proteine terapeutiche – Vantaggi
1. Generalmente esercitano una attività estremamente mirata e
specifica
2. Data la loro specificità hanno limitati effetti collaterali
indesiderati
3. Data la loro alta specificità ed essendo di origine umana sono
generalmente ben tollerati
4. Possono sopperire a un difetto genetico – nuovi bersagli terapeutici
5. Il tempo di approvazione da parte delle autorità regolatorie è
significativamente inferiore a quello di molecole di sintesi (1 anno
per 33 proteine/ 294 piccole molecole approvate tra 1980 e 2002 )
6. La protezione brevettuale può essere più lunga di altri composti
per le difficoltà di ottenere prodotti biosimilari
Proteine terapeutiche di I e II generazione
Proteine di I generazione identiche alle proteine
endogene umane
Proteine di II generazione modificate al fine di:
-
-
Migliorarne le caratteristiche farmacocinetica
(diminuire la biodegradabilità, aumentare la
penetrazione cellulare, ecc)
Generare prodotti innovativi con funzioni
diverse da quelle originarie
Generare dei prodotti più stabili facilitandone
la conservazione
Proteine di II generazione
TNFa (Fattore di Necrosi Tumorale) una citochina che gioca un
ruolo chiave nel danno infiammatorio in malattie autoimmuni o
nella malattia di Crohn
La prima di queste, l’ Etanercept (Enbrel), è una proteina di
fusione dal peso molecolare di 150 kDa tra la forma solubile del
recettore per il TNFalfa umano e la porzione Fc delle
immunoglobuline umane IgG.
Farmaci con funzione analoghe sono l’Infliximab (Remicade),
un anticorpo monoclonale “chimerico” cioè in parte umano
(frammento Fc umano) e in parte di derivazione murina (domini
della catena variabile VK e VH)
Adalimumab (HUMIRA) sviluppato molto recentemente che
consta di un anticorpo interamente umanizzato.
MODIFICAZIONI SECONDARIE CHE CAMBINO
IL PROFILO DI IDROFOBICITÀ
Possono migliorare il legame con proteine di
trasporto plasmatiche di trasporto e quindi la
residenza nel circolo:
Insulina detemir della Novo Nordisk),
interferone alfa, peptide GLP1, desmopressina
(legame di acidi grassi a residui attivi sulla
superficie della proteina)
AGGIUNTA DI POLIETILENGLICOLE
(PEG) PER AUMENTARE LE
DIMENSIONI DELLA PROTEINA E
RIDURNE IL METABOLISMO E
CLEARENCE RENALE
Analoghi del GH : Pegvisomant
Analogo ricombinante di hGH
- lys 120 sostituita con una gly
previene la dimerizzazione funzionale del recettore
qualsiasi aminoacido tranne lys o ala in questa posizione:
Promotore della crescita Þ antagonista GH
- Pegilazione – coniugazione via i gruppi aminici a 4 - 6
catene di polietilen-glicole
Aumento di T1/2 (SC) a circa 6 giorni
Picco plasmatico 33 - 77 ore
Ridotta immunogenicità
la pegilazione maschera i determinanti antigenici
Ridotta affinità di legame
altri otto aminoacidi sostituiti
La complessità strutturale dei
biofarmaci richiede una complessità
nella produzione
Produzione di proteine terapeutiche
Processi diversi danno luogo a prodotti non identici tra loro
Il prodotto finale è il
risultato di numerose scelte
INIZIO
FINE
La scelta della
sequenza genica
La scelta del
downstream
processing
Typical Protein Production Process
La scelta del
vettore
La scelta
dell’organismo
per la produzione
La scelta delle
condizioni di
fermentazione
Difficoltà nella produzione di
biofarmaci
• Istituzione di Master cell banks caratterizzate in
dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita,
contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di
espressione del transgene.
• Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad
ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamento
nell’impianto pilota
• Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di
fermentazione, con la preparazione di Extended cell
banks.
• Controllo delle condizioni di produzione
• Recupero e produzione
• Caratterizzazione del prodotto
CONTROLLO
QUALITA’
Difficoltà nella produzione di
biofarmaci
Controllo di qualità di proteine terapeutiche
Caratterizzazione della proteina
Determinazione dello stato di purezza
Saggio biologico
SDS PAGE/Western
Saggio immunologico
HPLC
SDS PAGE Western
Presenza di proteine seriche
Isoelectrofocusing
Presenza di proteine cellulari
HPLC
Presenza pirogeni
Mappa peptidica
Presenza di DNA cellulare
Sequenziamento N-terminale
Spettrometria di massa
Composizione in carboidrati
Composizione in acido sialico
Microeterogeneità di proteine
terapeutiche
collegate alla biologia del prodotto o al processo produttivo
process related, undesired
modifications of side chains
(e.g.,carbamylation,
citraconylation)
artifical, desired modification
(e.g. pegylation)
process related, undesired
modifications of amino acids
(e.g., oxidation, deamidation
pyroglutamate formation)
biologic, undesired modifications
(e.g., methylation, acetylation,
formylation, proteolysis)
biologic, desired modifications
(e.g., glycosylation, phosphorylation,
sulfatation, acylation)
process related, undesired modifications of the tertiary and
quaternary structure (e.g., partial denaturation, aggregation)
L’esempio del : t-PA (527 amino-acid protein; 17 S-S bridges; 3 glycosylation
sites)
Eterogeneità determinate per via sperimentale
Variability in N-linked
carbohydrate side
chains
Oxidation of Cys
or Met residues
Deamidation of Asn residues
Additional O-Glycosylation
Proteolysis at Arg-X
Single-chain and
two-chain forms
N-terminal sequence length variation
NH2
References available
COOH
Total possible variants: 1.09 x 109
Spesso i farmaci biotecnologici sono
costituiti da una miscela di isoforme
Isoelectric Focusing: glycosylated product
is subfraction of cell culture isoforms
In-vivo Bioactivity
400000
14
13
12
11
10
350000
300000
[U/mg]
Cell
Pure
Culture Bulk
250000
200000
150000
100000
50000
0
5
7
8
9
10
11
12
Isoform Number
13
14
Eritropoietina sintetizzata da diversi
laboratori
Different biophysical characteristics when compared to the
innovator product (Eprex®)
Source: Schellekens H, EJHP, 3/2004,
Scientific Section, pp 43-47.
Cosa sappiamo delle risposte cliniche a
“piccole” variazioni nelle molecole
sintetizzate da diversi laboratori?
Experience from Innovators and
manufacturing process changes
Tissue Plasminogen Activator (tPA) - Genentech
• Roller bottle to a fed batch process (new cell line, new downstream processing and new
formulation)
• Analytics showed different carbohydrate structures; clinical studies showed impact on PK and
efficacy
• This led to a delay in clinical development whilst differences were further investigated
Lenercept - Genentech
• Scaled-up the manufacturing process that led to less sialylation of the protein
• In clinical studies, this was shown to impact the PK and increase the immunogenicity
• The project was terminated
Raptiva - Genentech
• Scaled-up the process before conducting phase 3 clinical studies and found small analytical
differences
• No differences in nonclinical PK. In clinical studies AUC had increased by 30% and efficacy had
decreased
• Phase 3 study repeated
Eprex  – J&J
• Formulation change; no analytical differences observed
• Resulted in >180 cases of pure red cell aplasia (PRCA) in renal failure patients (175/191 Eprex)
• SC route of administration contraindication; further drug product changes; 20,000 patient registry
Due farmaci con meccanismo d’azione
apparentemente identico

Adalimumab e Infliximab :
legame selettivo con il TNFa e
conseguente blocco della
interazione con i recettori del
TNF, p55 e p75

Etanercept: inibizione
competitiva del legame del TNF
ai recettori di superficie, che
previene le risposte cellulari
mediate dal TNF rendendo il
TNF biologicamente inattivo
Due farmaci con meccanismo d’azione
apparentemente identico
 Apparente maggiore efficacia di moAb anti-TNF vs
Etanercept
 Ma risposta clinica a Etanercept in alcuni casi nonresponsivi a Infliximab
 Blocco TNFa e b vs a solo
 Dosaggi diversi?
 Effetto biologico diverso? (efficacia in m.
granulomatose, i.e. Crohn)
Biosimilari in quanto sono simili, non
identici, ai prodotti originali copiati
EMEA Guidelines
• “It is not expected that the quality attributes … will
be identical”
• “Minor differences in the active substance, such as
variability in post-translational modifications may
be acceptable, however, must be justified”
• “there may be subtle differences between
biosimilars”
These differences can have clinical implications
eg. different efficacy or safety
Perchè biosimilare e non generico
• Biosimilar, Follow-on Biologic, Follow-on Protein, Subsequent Entry
Biologic …….
• Prodotto biologico che vuole essere assimilabile a un prodotto
biologici innovativo il cui brevetto è scaduto. Tuttavia, la produzione
del biosimilare
– Avviene da parte di ditte diverse dalla Ditta originaria detentrice
del brevetto
– Richiede un nuovo orgaismo per la produzione, un nuovo
processo produttivo, nuovi metodi analistici
• I primi biosimilari:
– Omnitrope® (somatropin) in Australia, EU e USA
– Valtropin® (somatropin) in EU
– NON esistono prodotti-copia in Asia e in S. America
Leggi e regolamenti
L’European Medicines Agency (EMEA) nel 2004 ha elaborato
una serie di direttive per l’approvazione di farmaci biosimilari : i
primi tre farmaci biosimilari approvati in Europa sono stati:
1. Ormone della crescita
2. Eritropoietina
3. Granulocyte-colony stimulating factor
Nell’ottobre 2010 i funzionari EMEA hanno iniziato a prendere
in considerazione la legislazione per l’immissione sul mercato di
anticorpi monoclonali (mercato globale 36,4 miliardi di US$):
nel 2013 scade il brevetto del Rituximab (mercato globale 5,6
milioni di US$)
Biosimilar views outside the EU
Omnitrope® (somatropin) - Sandoz
Different opinions in different regions
Australia
Genotropin
• Children; GHD
• Adults; GHD
• Turner syndrome
• Prader-Willi syndrome
Omnitrope
• Children; GHD
• Turner syndrome
• Growth disturbance;
renal insufficiency
Europe
Genotropin
• Children; GHD
• Adults; GHD
• Turner syndrome
• Prader-Willi syndrome
• Children small for
gestational age
• Growth disturbance
renal insufficiency
Omnitrope
• Children; GHD
• Adults; GHD
• Turner syndrome
• Prader-Willi syndrome
• Children small for
gestational age
• Growth disturbance;
renal insufficiency
United States
Genotropin
• Children; GHD
• Adults; GHD
• Prader-Willi syndrome
• Children small for
gestational age
Omnitrope
• Children; GHD
• Adults; GHD
Omnitrope Clinical Programme
• Phase 1 (PK/PD)
• 3 studies in healthy volunteers; n = 60
• Phase 3
• 1 study in children with GHD; n = 89
Post- approval commitments (EU)
•
•
•
•
Safety in children small for gestational age
Safety in children with Prader-Willi syndrome
Occurrence of malignancy
Occurrence & impact of anti-GH antibodies
United States
Legal and Regulatory Status
Legal basis for approval
Food, Drug & Cosmetics Act (FDCA)
• Several provisions for abbreviated
approvals
• eg. Hatch-Waxman for drugs
• Biologics are specifically excluded
• 505(b)2 offers a pathway for FDCA
proteins eg. Omnitrope
Public Health Service Act (PHSA)
• Majority of biologics approved under this
act
• PHSA does not have provisions for
abbreviated approvals
• Congress discussing legislative pathway
now (proposed legislation under debate)
• FDA has published a “white paper” 4 and testified at Congressional hearings
• Science allows a legal and regulatory pathway to be established
• Generics principles cannot be applied
• Data exclusivity provisions for innovators (proposals range from 0 to 14+ years)
Outstanding issues
Issues still being addressed in Europe
Interchangeability
(ie. automatic substitution)
Pharmacovigilance
& Traceability
Prescribing
Information
Non-proprietary
Names
 Should or can we adopt the same “automatic substitution”
principles that we have in place for small-molecule generics?
 Generic principles are based on the active substance being
identical – biosimilars will be similar, not identical
 “to support pharmacovigilance monitoring, the specific medicinal
product given to the patient should be clearly identified” 1
 Decisions/guidance on how this will work in practice still pending
 What information should be provided to healthcare providers and
patients – should we follow the generic model?
 Transparency seems to be ultimate direction ie. not generic model
 eg. clinical data for approval, advice on substitution
 On-going debate at international level
 Questions centre on role of INN in clinical practice ie.
prescribing/dispensing and pharmacovigilance
 WHO decision expected in late 2007
Conclusioni
Conclusioni
• Biosimilari sono una nuova classe di prodotti medicinali
– Non sono generici come inteso per le piccole molecole di sintesi
• L’ EMEA ha stabilito ottimi standard per l’approvazione
– Una serie di importanti domande deve trovare una risposta solo dopo
l’approvazione
• Rimangono punti di discussione che riguardano l’introduzione dei
biosimilari nella pratica clinica
– Regole per la sostituibilità automatica
– Farmacovigilanza
– Labelling
– Scelta del nome
• La comunità medica deve avere la piena consapevolezza delle
problematiche legate all’uso di biosimilari
References
1.
2.
3.
4.
EMEA guidelines for similar biological medicinal products. Available at
http://www.emea.europa.eu/htms/human/humanguidelines/multidiscipline.htm
European Public Assessment Report (scientific assessment) for Omnitrope.
http://www.emea.europa.eu/humandocs/Humans/EPAR/omnitrope/omnitrope.htm
European Medicines Agency Questions and Answers on recommendation for refusal of marketing
application for Alpheon. http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/opinion/19089606en.pdf
The FDA’s assessment of follow-on protein products: a historical perspective
Nature Reviews Drug Discovery, published online 13 April 2007; doi:10.1038/nrd2307
http://www.nature.com/nrd/journal/vaop/ncurrent/pdf/nrd2307.pdf
FARMACI INTELLIGENTI
(TARGETED THERAPY)
…..ogni terapia, per definizione, ha un
bersaglio.
forse ad oggi non abbiamo ancora compreso
tutti i bersagli esatti da colpire, purtroppo i
nostri pazienti soffrono ancora per questa
mancanza…
George W. Sledge, Jr; J Clin Oncol, 2005
Initiating event
hyperproliferation inflammation
resist. to deathECM remodeling
migration angiogenesis
invasion lynphoangiogenesis
.. ma per molte neoplasie
il bersaglio è ben definito
estrogen receptor in
an infiltrating
ductal carcinoma
Alterazioni della funzione di geni che giocano un ruolo
importante nell’origine e patogenesi delle neoplasie
umane.
Tre categorie principali di alterazioni delle funzioni geniche
sono alla base della progressione tumorale; queste
comprendono
• geni che codificano per proteine “sopressore”
• geni che codificano enzimi per il riparo del DNA
• oncogeni
COSA SI INTENDE PER TARGETED THERAPY
Una terapia con un bersaglio molecolare ben definito
La “targeted therapy” dovrebbe agire su un processo
biologico rilevante (generalmente, anche se non
sempre, su una singola molecola) preferibilmente il
processo caratteristico della patologia da curare.
Il bersaglio dovrebbe poter essere misurabile
clinicamente e la misura dell’effetto della terapia sul
bersaglio dovrebbe correlare con lo stato di salute del
paziente.
TARGETED THERAPY – LE MOLECOLE
Molecole di piccole dimensioni-farmaci più tradizionali
• Imatinib mesylate (Gleevec, also known as STI–571)
• Gefitinib (Iressa, also known as ZD1839), targets the epidermal growth factor
receptor (EGFR) tyrosine kinase
• Erlotinib (marketed as Tarceva). Erlotinib inhibits epidermal growth factor
receptor
• Bortezomib (Velcade) is an apoptosis-inducing drug that causes cancer cells
to undergo cell death by interfering with proteins.
• Newer BCL-2 antagonists (e.g. Gossypol).
• The selective estrogen receptor modulator tamoxifen has been described as
the foundation of targeted therapy
Farmaci biologici – anticorpi monoclonali (chimerici-umanizzati-umani)
• Rituximab targets CD20 found on B cells.
• Trastuzumab (Herceptin) targets the Her2/neu (also known as ErbB2)
receptor
• Cetuximab (marketed as Erbitux) targets the epidermal growth factor
receptor.
• Bevacizumab (marketed as Avastin) targets circulating VEGF ligand
Targeted therapy
Un trattamento che utilizza farmaci o altre
sostanze, quali anticorpi monoclonali, per
identificare e agire selettivamente sulla cellula
neoplastica ….
…..non mirato a colpire tutte le cellule in mitosi
(es. la chemioterapia più tradizionale)
Targeted therapy deve avere minori effetti
collaterali rispetto a trattamenti più
tradizionali.
Dictionary of Cancer Terms National Cancer
Institute USA
ALLA TERAPIA MIRATA OCCORRE AFFIANCARE METODI
PRECISI:
•
PER L’IDENTIFICAZIONE DEL PAZIENTE
•
PER LA IMMEDIATA VERIFICA DELLA EFFICACIA
DEL TRATTAMENTO
FARMACOGENETICA
Il prossimo obiettivo per le “targeted therapies” sarà
l’identificazione dei pazienti che possono rispondere al
meglio alla terapia. La via per l’identificazione di questesottopopolazioni sono marcatori e “molecole di misura”
surrogati.
Tecnologie per l’analisi dell’immagine
applicabili alla verifica degli effetti positivi del
trattamento in tempi reali
IL COSTO DEI FARMACI INTELLIGENTI
ricerca biologica
trattamento di pazienti