Esercitazioni di Biochimica Applicata
Introduzione alle metodologie di base per l’analisi delle proteine
1. Dosaggio quantitativo delle proteine totali in un campione biologico;
2. Proteine cellulari - tecniche di omogeneizzazione e centrifugazione:
arricchimento della/le proteina/e studiate in frazioni sub-cellulari ottenute
da omogenato d’organo, tessuto, linee cellulari;
3. Saggio analitico nella frazione subcellulare (saggio enzimatico);
4. Cinetica enzimatica;
5. Procedure di separazione delle proteine in studio (elettroforesi su gel)
Tecniche mirate
Analisi di proteine specifiche o totali nei diversi tessuti e distretti
anatomici, in liquidi biologici e colture cellulari: tecniche separative più
risolutive, metodi di identificazione e purificazione.
In particolare: Western blot, elettroforesi bidimensionale, proteomica,
tecniche cromatografiche, purificazione all’omogeneità, sequenziamento.
Il dosaggio quantitativo delle proteine viene applicato:
•
per conoscere quante proteine sono
presenti in un determinato preparato
biologico, prima di procedere verso
ulteriori analisi relative ad una o più
proteine; esempi:
•
per calcolare l’attività specifica durante i
saggi funzionali (es. per vel. enzimatica);
•
per calcolare la densità specifica di un
recettore nei saggi di legame (binding)
dei recettori proteici;
•
come indice di purezza/resa della
proteina studiata durante le fasi
progressive di purificazione;
•
prima di una separazione cromatografica
o elettroforetica (SDS-PAGE, Western
blot, proteomica).
Dosaggio della concentrazione
di proteine totali in un campione biologico
Metodi chimici:
Metodo Kjeldahl (N totale)
Metodi spettrofotometrici:
-metodo in assorbanza UV
a 280 nm (amminoacidi aromatici)
- Metodi colorimetrici:
Metodo del biureto;
Metodo di Lowry;
Metodo BCA (acido bicinconinico);
Metodo di Bradford;
Metodi turbidimetrici: precipitazione in acidi TFA o
TCA e analisi turbidimetrica del precipitato.
Metodo di Kjeldahl
Determinazione dell’N proteico trasformato in gr proteine mediante un fattore di conversionePer incrementarne l’accuratezza: precipitazione delle proteine con TCA, TFA o PCA, lavaggio
per centrifugazione e precipitato usato per l’analisi successiva:
1) Digestione: il campione con le proteine viene portato ad alta temperatura in presenza di
H2SO4 concentrato + catalizzatore (ex. Cu2SO4) + ossidanti (ex. permanganato o H2O2); tutto
l’N organico si trasforma in NH4+, ossidazione di C e S a CO2 e SO2;
2) Distillazione: (NH4)2SO4 formato + 2NaOH = 2NH3 (raccolta x distillazione) + Na2SO4 + 2
H2O;
3) Titolazione: NH3 raccolta e titolata per aggiunta di acido forte (ex. HCl) a titolo noto.
Calcolo del contenuto di azoto o di proteine in
un campione
1 mol HCl = 1 mol NH3= 14 gr N
Quantità di N nel campione in gr:
ml HCl x M HCl x 14/1000
Quantità di proteine nel campione in
gr: ml HCl x M HCl x 14/1000 x 100/16
se si considera che il contenuto medio di N
proteico è 16%.
Metodi spettrofotometrici - colorimetrici
I 20 L-amminoacidi che
formano le proteine
Legame peptidico
Dosaggio proteine
Metodi spettrofotometrici
basati su reazioni che possono
coinvolgere il legame peptidico
o i gruppi –R di alcuni AA
da: www.vialattea.net
Metodi spettrofotometrici
PARAMETRI CHE CARATTERIZZANO I DIVERSI METODI DI
DOSAGGIO DELLE PROTEINE
Sensibilità: quantità più piccola di proteine determinabile nel campione
biologico;
Specificità: capacità di quantificare solo le proteine del campione;
Interferenze: queste possono alterare sia accuratezza che specificità del
metodo: es.: assorbimento alla l analitica di componenti del campione diverse
dalle proteine (es. acidi nucleici); interferenze del mezzo, ex. sali del tampone,
con la formazione di complessi colorati (metodi colorimetrici);
Capacità relativa o assoluta di misurare le proteine del campione
biologico: dipendenza dalla composizione in certi aminoacidi delle proteine o
meno: metodo relativo, metodo assoluto; importante durante procedura di
purificazione.
Integrità del campione: capacità o meno di lasciare integro il campione con
possibilità di utilizzarlo in altri dosaggi;
Stabilità: metodi colorimetrici, stabilità nel tempo dei complessi colorati.
ASSORBANZA IN UV DELLE PROTEINE
Caratteristiche:
Sensibile: 10-20 mg
Integrità del campione: si
Stabilità: si
Interferenza con:
basi azotate acidi nucleici
(si corregge a 260 e 280
nm)
Metodo relativo: può
variare in base al tipo di
proteine presenti.
Metodi colorimetrici
Metodo «capostipite»
di altre tecniche
colorimetriche,
quali i metodi del Lowry
e del BCA.
Caratteristiche:
• Integrità campione: no
• Metodo ritenuto
assoluto, più costante
di UV .
• Scarsa sensibilità
Reattivo di Benedict: solfato di rame CuSO4
in soluzione alcalina e sali citrato o tartrato di K+ o Na+
Metodo di Folin classico:
Residui fenolici quali gruppi –R di AA
aromatici (specialmente tirosina) , sono
ossidati da reattivo di Folin-Ciocalteu in
ambiente alcalino: acidi fosfotungsticomolibdico del reagente si riducono a
composti di colore blu. Il Lowry
incrementa sensibilità associando biureto
e Folin.
Integrità campione: no
Stabilità e tempistica: stabile
entro limiti di tempo, lettura
dopo 30 min.
Procedura relativamente lunga.
Metodo ritenuto più
costante specifico e sensibile
rispetto a UV, Folin classico e
biureto.
Caratteristiche:
Integrità campione: no
Stabilità: buona.
Tempistica: procedura lunga.
Interferenze: lipidi,
detergenti, EGTA;
DTT (ditiotreitolo >1mM).
Migliore del Lowry per
detergenti, sali etc..
Quota di ioni rameici rid ioni
rameosi dalle proteine in ambiente
alcalino. L’acido BCA chela ioni
rameosi formando un complesso
colorato molto stabile.
Residui di arginina, triptofano,
tirosina e fenilalanina
Integrità campione: no
Stabilità: più stabile degli
altri metodi; rapidità di esecuzione – non richiede
incubazione dopo aggiunta
reagente.
Metodo relativo- Sensibilità
comparabile a Lowry
Interferenze con
detergenti
Metodo del Biureto: retta di calibrazione – due l analitiche, a
sensibilità diversa:
545 nm, quantità di proteine misurabile: 1 – 5 mg
330 nm, quantità di proteine misurabile: 0.1-1 mg
Retta a 330 nm
Metodo del Bradford: retta di calibrazione – l analitica: 595 nm