Basi molecolari delle patologie
Molecular disesae
Linus Pauling e l’a-elica
Itano e Singer dimostrarono nel
1946 mediante elettroforesi che Hb
falciforme aveva più cariche
positive. Questa fu una scoperta
sorprendente, alla quale Pauling
diede il nome di “Malattia
molecolare”
Monomero emoglobina
Hb falciforme (HbS)
Val
Val
Glu
Val
La mutazione nel gene della b
globina
La presenza
della valina
crea una zona
idrofobica che
interagisce
con la regione
idrofobica
della catena b
di una Hb
adiacente.
Elettroforesi del DNA
normali
• Elettroforesi di
frammenti di DNA
ottenuti tramite
enzimi di
restrizione dal gene
della globina b
S
S AAA
Elettroforesi della proteina
+
_
Identificazione tramite HPLC
della proteina
*
*= Hb glicata
Le patologie congenite
nel cane
Introduzione
• Nei cani di razza pura sono state
identificate circa 500 patologie genetiche
• Sito Web “Inherited Diseases in Dogs”
(IDID): www.vet.cam.ac.uk/idid
• Più di metà sono congeniti secondo la
modalità recessiva autosomica
mendeliana semplice (problema per gli
allevatori!)
Patologie
• Atrofia retinica progressiva (Setter, Labrador,
Corgi, Mastino, Bassotto, ecc)
• Malattia di von Willebrand (Bovaro bernese,
Doberman, Pinscher, alcuni Terrier, ecc)
• Carenza di piruvato cinasi (Basenji, Chihuahua,
Bassotto, ecc)
• Tossicità da ivermectina (Pastore tedesco,
Collie, Bobtail ecc)
• Intossicazione da Cu
Carenza di piruvato cinasi
Piruvato cinasi
Dominio B
Dominio A
Dominio C
Struttura e caratteristiche
• 4 isozimi M1, M2, R e L codificati da 2 geni distinti:
LR (nell’uomo sul cromosoma 1) codifica per
isoforme R (specifica per eritrociti) e L (fegato, corteccia
surrenali, intestino tenue);
M (nell’uomo sul cromosoma 15) codifica per
isoforme M1 (muscolo scheletrico adulto, cuore cervello)
e M2 (fetale in tutti i tessuti, poi viene sostituita dalle
altre isoforme tranne che in rene, tessuto adiposo,
leucociti).
• Cinetica e regolazione
Metabolismo degli eritrociti
Glucosio
Glucosio-6-P
6 Fosfogluconato
Pentosi fosfati
PEP
Piruvato
Lattato
• Carenze negli enzimi che controllano la glicolisi
risultano in una bassa produzione di ATP,
riducono la vita media degli eritrociti e
provocano anemia (fosfofruttocinasi-PFK e
piruvato cinasi-PK)
• Carenza di Glucosio-6-P deidrogenasi rende gli
eritrociti suscettibili a danni ossidativi per
carenza di glutatione ridotto
• (nell’uomo sono note 158 diverse mutazioni del gene PK-LR e
l’incidenza è 1:20.000 nella popolazione bianca).
Scoperta nei primi
anni ’70 in Basenji e
Beagle, ma presente
anche in altre razze
• Questa carenza è trasmessa come
carattere autosomico recessivo
• Gli omozigoti presentano minor
resistenza all’esercizio, tachicardia,
mucose pallide e splenomegalia. Gli
eritrociti hanno una vita più breve, si
ha anemia rigenerativa con elevata
presenza di reticolociti
• Nei cani normali: Ht 48 e % Rtc 0,4
(nell’uomo 1%)
• Nei cani ammalati: Ht 21 e % Rtc 40.
La prolungata anemia emolitica produce
un anormale assorbimento di ferro a
livello intestinale, con successivo
accumulo nel fegato (emosiderosi).
Anche nell’uomo, un accumulo di ferro
nel fegato si manifesta come
complicazione della carenza di PK
Iperplasia delle cellule
del Kupfer contenenti
granuli di emosiderina
Basi molecolari
• Nei cani affetti da carenza di PK negli eritrociti
manca l’isoforma R dell’adulto.
• Il tipo di mutazione varia a seconda della razza:
ad esempio nel Basenji la mutazione è il
risultato di una singola delezione che porta alla
formazione di una proteina tronca che non
presenta il sito catalitico funzionante.
• Negli eritrociti è invece presente l’isoforma M2,
che è presente normalmente nei reticolociti.
Test diagnostici
• Misura attività PK nell’emolisato: molto spesso
normale, in quanto i reticolociti hanno attività
molto alta
• Dal momento che M2 ha attività molto labile può
aiutare un test di stabilità termica, lasciando
l’emolisato a per 1h a 50°C.
• Altri test: immunoblotting, misura di intermedi
glicolitici
• Diagnosi molecolare basata su DNA (PennGen:
w3.vet.upenn.edu/research/centers/penngen/ser
vices/alldiseases.html)
Anche nei gatti
Abissino
gatto domestico a pelo corto
Malattia di von Willebrand
Introduzione
• La malattia di von Willebrand (vWD) è il difetto
genetico della coagulazione più comune
nell’uomo e nel cane.
• Deriva da carenza qualitativa e/o quantitativa di
una glicoproteina multimerica, il fattore di von
Willebrand, necessario per il processo di
adesione delle piastrine.
• Ci sono 4 tipi di vWD ereditaria.
• La malattia fu scoperta nel 1924 da un pediatra
finlandese, E.A. von Willebrand
Fattore (proteina) di von Willebrand
Proteina di von
Willebrand
(blu) legata al
recettore
piastrinico
(giallo)
Nell’uomo: in gene per vWF si estende per 178kb e comprende
52 esoni
Il monomero contiene 2050 AA organizzati in vari domini
Viene glicosilato e dimerizza mediante ponti-S-S- nel reticolo
Nel Golgi forma multimeri estremamente grandi >20,000 KDa
che sono funzionalmente attivi
Le mutazioni
• Il tipo di mutazione
determina la severità della
patologia
• Il fattore manca negli
individui che presentano la
forma severa della patologia
(tipo III) (Scottish Terrier e
Shetland Sheep).
• Forme meno severe (I ) con
bassi livelli nel Doberman
Pinscher.
Il caso del doberman
• La mutazione nei doberman comporta la
presenza di livellli normali di vWf intorno al 510%, mentre il restante 90-95% è patologico
• La mutazione in questo caso colpisce un sito di
splicing (splice site mutation)
• Si tratta di una mutazione che modifica il sito di
splicing portando alla permanenza di introni nel
messaggero maturo con conseguente proteina
aberrante