Produzione di organismi transgenici
Gli organismi transgenici possono essere ottenuti
modificando cellule embrionali totipotenti
Esempio: generazione di topi transgenici mediante microiniezione
di DNA nei pronuclei maschili
Iniezione di costrutti di espressione
lineari, che si integrano sotto forma
di concatameri a partire dai
primissimi stadi di sviluppo.
Promotore Introne
1
CDS
2 3
ATG
4
Poly-A
5
*
• Dopo la microiniezione gli embrioni vengono reimpiantati in femmine pseudogravide
• Gli animali nati da questi esperimenti devono essere analizzati per mezzo di Southern
blotting o PCR per valutare se il transgene si è integrato e in quante copie.
•Gli animali transgenici (founders e/o loro discendenza) vengono successivamente
analizzatati per valutare se il transgene si esprime in, ed eventualmente gli effetti
fenotipici della sua espressione
Caratteristiche
• Tecnica relativamente semplice, che può essere applicata sia al topo che ad
altri mammiferi (pecore, maiali), ma anche a Drosophila e C. Elegans.
• Il limite principale è che non è possibile decidere il punto di inserzione del
transgene, per cui l’espressione può essere molto variabile (variabilità
inserzionale dovuta alla struttura della cromatina nella regione di inserzione).
Produzione di topi geneticamente modificati mediante
ricombinazione omologa in cellule ES
Produzione di topi geneticamente modificati mediante
ricombinazione omologa in cellule ES: inserzione del gene in copia
singola e in un punto preciso del genoma
• Affinchè la modifica passi alla progenie, le cellule ES
ricombinanti devono contribuire alla linea germinale
dei topi chimerici.
Le piante transgeniche vengono prodotte con metodiche simili
Applicazioni
• Studio della funzione e della regolazione genica
• Manipolazione delle caratteristiche fenotipiche di specie utili
per la zootecnia
• Produzione di proteine umane in altre specie (specialmente utile
per le proteine che a causa della complessità delle modificazioni
post-traduzionali non possono essere prodotte in organismi più
semplici)
Come studiare i geni e le loro funzioni?
Problemi e soluzioni più comuni
Forward genetics: dalla funzione al gene
In questo caso il punto di partenza è costituito da un
fenotipo, rilevabile sia a livello di organismi che di
cellule in coltura.
Una volta identificato il mutante il gene responsabile
può essere identificato mediante metodiche di
clonaggio funzionale o posizionale
Esempi di fenotipi: lieviti con
proprietà di crescita anomale
Esempi di fenotipi:
cecità per la luce UV in Drosophila
Esempi di fenotipi:
sviluppo vulvare anomalo C. Elegans
Esempi di fenotipi:
sviluppo vulvare anomalo C. Elegans
Esempi di fenotipi:
malattie genetiche
La forma più diretta di clonaggio funzionale è il
clonaggio per complementazione. A seconda
dell’organismo questo può richiedere l’utilizzo di
library genomiche o di cDNA.
Il lievito è l’organismo
eucariotico che più consente più
facilmente il clonaggio per
complementazione.
Questo approccio si può usare
per clonare non solo i geni del
metabolismo, ma anche quelli
coinvolti nel ciclo cellulare,
nella riparazione del DNA, nel
traffiking etc. Data la
dimensione limitata dei geni di
lievito si possono usare sia
library genomiche che di cDNA.
La complementazione può essere usata
anche in cellule di mammifero in coltura
Anemia di Fanconi
Radiazioni ionizzanti
Linea cellulare da paziente
Cellule morte
Linea cellulare normale
Cellule vive
Screening funzionale
Vettore plasmidico
cDNA normale
Linea cellulare da paziente
cDNA library da soggetto normale
Radiazioni
Cellule trasfettate
con library
Analisi del plasmide
Clone
Esempio di clonaggio funzionale:
identificazione di oncogeni cellulari
Cellule tumorali
Le cellule trasformate sono in grado
di crescere in particolari condizioni,
come terreni di coltura senza siero, e
formano colonie isolabili
CMV
cDNA library in vettore
di espressione
Cellule normali
Purificando e sequenziando il DNA
plasmidico presente nelle colonie
trasformate si possono identificare gli
oncogeni
Cellula trasformata
Per gli organismi più complessi non si può effettuare
direttamente il clonaggio funzionale.
Per questo è necessario ricorrere al clonaggio posizionale,
ossia alla identificazione del gene basata sulla sua
posizione fisica sul cromosoma.
Fibrosi cistica del pancreas
• Patologia autosomica recessiva, molto frequente
• Anomala viscosità delle secrezioni, che determina chiusura dei dotti
pancreatici (maldigestione) e dei bronchi (polmoniti recidivanti e
bronchiectasie).
• Anomala concentrazione di cloro nelle secrezioni (test del sudore)
Pancreas normale
Pancreas di paziente
Identificazione del gene della fibrosi cistica
• Nel 1985 il gene venne localizzato sul cromosoma 7 grazie al suo
linkage con un marcatore proteico.
• Successivamente fu possibile un mappaggio più fine, che localizzò il
gene in un intervallo di 500 kb tra due marcatori (cMet e D7S8).
• Il DNA di tutta la regione è stato clonato usando le tecniche del
chromosome walking e jumping.
• Il sequenziamento di questi cloni ha permesso di identificare nuovi
marcatori polimorfici, in forte linkage disequilibrium con il gene della
fibrosi cistica. Questo è stato possibile perché la maggior parte
degli alleli mutati nella popolazione non derivano da nuove
mutazioni, ma da un’unica mutazione ancestrale, mantenuta in virtù
del vantaggio dell’eterozigote (gli eterozigoti sono probabilmente
più resistenti del resto della popolazione all’infezione da Salmonella
typhi).
Identificazione del gene della fibrosi cistica
Marcatore 1
Regione critica
2 Mb
Marcatore 2
Gene malattia
Cloni YAC (1Mb)
Cloni BAC, P1, PAC (100-200 Kb)
Cloni fagici e cosmidici (20-40 Kb)
Identificazione del gene della fibrosi cistica
Identificazione del gene della fibrosi cistica
• Il sequenziamento della regione fiancheggiante i marcatori più vicini
al gene della fibrosi cistica permise di identificare il primo esone del
gene.
• Il resto è stato identificato facendo diversi screening di cDNA
libraries.
• Alla fine nei pazienti è stata trovata nel 70% dei casi una mutazione
in omozigosi consistente nella delezione di un codone (F508Del).
Mutagenesi mediata da trasposoni
In alcuni modelli sperimentali è possibile condurre
esperimenti di mutagenesi su vasta scala inducendo in
maniera controllata il salto di trasposoni (di cui si
conosce la sequenza). Se un ceppo mutagenizzato da
un trasposone mostra un fenotipo, è molto facile
identificare il gene utilizzando la sequenza del
trasposone come sonda.
Reverse genetics: dal gene alla funzione
In questo caso il problema consiste nel comprendere la
funzione di un gene (e della proteina codificata) di cui
si conosce soltanto la sequenza. Problema molto
comune soprattutto in seguito ai progetti di
sequenziamento genomico.
Domande a cui rispondere:
• Quale è la struttura del gene e della proteina codificata?
• Quali sono le regioni della proteina funzionalmente importanti?
• In quali cellule il gene svolge la sua funzione?
• Quale è la localizzazione subcellulare della proteina?
• Cosa succede nelle cellule e negli organismi se si abolisce la
funzione del gene?
• Cosa succede nelle cellule e negli organismi se si incrementa la
funzione del gene?
• Con quali proteine interagisce fisicamente e funzionalmente il
prodotto del gene?
Importanza della comparazione di sequenze
mediante i programmi di allineamento
• L’allineamento della sequenza in esame con quelle contenute nella
banca dati mi consente spesso di ricostruire la sequenza completa
dell’mRNA (confronto con sequenze EST), e anche di evidenziare la
presenza di varianti alternative.
• L’allineamento della sequenza dell’mRNA con quella genomica
permette di definire la struttura del gene (giunzioni esoni-introni).
• L’allineamento della sequenza del gene e della proteina con quelli
delle altre specie permette di identificare le regioni più conservate
della proteina (in genere più importanti dal punto di vista
funzionale), e le regioni di controllo dell’espressione genica
• L’identificazione di ortologhi del gene in altre specie (specialmente
nei modelli geneticamente trattabili) permette molto spesso di
ottenere ottimi indizi sulla funzione del gene in questione.
Studi di espressione
• Il gene si esprime in modo ubiquitario o è tessuto-specifico?
• E’ espresso in particolari cellule e/o in un particolare momento
dello sviluppo?
• L’espressione può essere indotta o repressa da particolari
condizioni?
• Quante e quali varianti esistono, e come si esprimono?
Localizzazione subcellulare
• Anticorpi (per generarli in genere bisogna produrre una proteina ricombinante)
• Costrutti di espressione in cui al cDNA della proteina viene fuso in-frame un
‘tag’ proteico fluorescente (GFP) o che renda la proteina riconoscibile da parte
di un anticorpo (epitopi HA, MYC e FLAG)
Come si può ‘spegnere’ la funzione di un gene?
Inattivazione mediante ricombinazione omologa
Gene mutato
Gene normale
Come si può ‘spegnere’ la funzione di un gene?
A livello post-trascrizionale: espressione di un RNA antisenso
Trasfezione
costrutto antisenso
RNA-antisenso
mRNA
DEGRADAZIONE
Come si può ‘spegnere’ la funzione di un gene?
A livello post-trascrizionale:
trasfezione di oligonucleotidi antisenso
Oligonucleotidi normali o fosforotioati
mRNA
ATG
DEGRADAZIONE
Oligonucleotidi morfolino
mRNA
ATG
Blocco della traduzione
Come si può ‘spegnere’ la funzione di un gene?
A livello post-trascrizionale: RNA-interference
•RNAi: è un processo mediante il quale RNA doppio-strand
silenzia, in modo sequenza-specifico, l’espressione di geni
omologhi attraverso la degradazione dell’mRNA.
•Meccanismo biochimico molto conservato, presente in
piante, funghi e animali. Identificato per la prima volta nel
nematode C.elegans (’98) da Fire e Mello, i quali scoprirono
che is dsRNA induce un silenziamento genico 10 volte
maggiore di RNA single-strand (senso o antisenso).
Come si può ‘spegnere’ la funzione di un gene?
A livello post-trascrizionale: RNA-interference
a. Due molecole di DICER
(Rnasi III) tagliano il
dsRNA in siRNA (22nt),
che vengono incorporati in
un complesso nucleasico
(RISC) che usa il siRNA
come guida, per
riconoscere in modo
sequenza-specifico, il
substrato (mRNA
bersaglio) da degradare.
b. Legame di DICER al
dsRNA.
Come si può ‘spegnere’ la funzione di un gene?
A livello post-trascrizionale: RNA-interference
Come si può ‘spegnere’ la funzione di un gene?
A livello post-traduzionale
• Iniezione di anticorpi bloccanti
• Uso di inibitori
• Espressione di mutanti dominant-negative
Membrana
p53
Mutante
Dominio di
interazione
dominant-negative
Dominio
catalitico
Substrato
Come si può aumentare la funzione di un gene?
• Aumento del numero di copie
• Overespressione mediata da promotori forti
• Espressione di forme costitutivamente attive
Proteina inattiva
Ras
Dominio inibitorio
Dominio catalitico
Proteina attivata
Mutante costitutivamente attivo
Ingegnerizzazione di proteine mutanti
I mutanti di delezione si possono costruire sfruttando gli enzimi di restrizione….
AUG
Prom. 5’UTR
*
Dominio 1
Bam HI
Dominio 2
Pst I
3’UTR
Not I
Ingegnerizzazione di proteine mutanti
… o mediante PCR. Quest’ultima tecnica è molto più versatile, perché non dipende
dai siti di restrizione che si trovano sulla sequenza, ed inoltre perché l’estremità 5’ dei
primer puo essere modificata in modo da contenere la sequenza che si desidera.
GAATTCAGGTCCATCTGAC
AGGTCCATCTGACGTTGCTAGGACATTTAACACGAGAGACCTGATGACCTCTACATACCGACGAGC
TCCAGGTAGACTGCAACGATCCTGTAAATTGTGCTCTCTGGACTACTGGAGATGTATGGCTGCTCG
TGTATGGCTGCTCGCTATAG
GAATTCAGGTCCATCTGACGTTGCTAGGACATTTAACACGAGAGACCTGATGACCTCTACATACCGACGAGCGATATC
CTTAAGTCCAGGTAGACTGCAACGATCCTGTAAATTGTGCTCTCTGGACTACTGGAGATGTATGGCTGCTCGCTATAG
Ingegnerizzazione di proteine mutanti
Le mutazioni puntiformi possono essere inserite mediante
oligonucleotidi mutati….
GTAGACTGCAACGATCCTGTAAATTGTGCTCTCTAGACTACTGGAGATGTATGGCTGCTC
CATCTGACGTTGCTAGGACATTTAACACGAGAGACCTGATGACCTCTACATACCGACGAG
Ingegnerizzazione di proteine mutanti
Le mutazioni puntiformi possono essere inserite mediante
oligonucleotidi mutati….
GTAGACTGCAACGATCCTGTAAATTGTGCTCTCTAGACTACTGGAGATGTATGGCTGCTC
CATCTGACGTTGCTAGGACATTTAACACGAGAGATCTGATGACCTCTACATACCGACGAG
Ingegnerizzazione di proteine mutanti
… o sfruttando la PCR
P1
P3
TGTGCTCTCTAGACTACTGGAG
AGGTCCATCTGAC
AGGTCCATCTGACGTTGCTAGGACATTTAACACGAGAGACCTGATGACCTCTTTGTCTATGCAACATACCGACGAGC
TCCAGGTAGACTGCAACGATCCTGTAAATTGTGCTCTCTGGACTACTGGAGAAACAGATACGTTGTATGGCTGCTCG
ACACGAGAGATCTGATGACCTC
P2
AGGTCCATCTGACGTTGCTAGGACATTTAACACGAGAGATCTGATGACCTC
TCCAGGTAGACTGCAACGATCCTGTAAATTGTGCTCTCTAGACTACTGGAG
PCR P3+P4
TGTATGGCTGCTCG
P4
PCR P1+P2
ACACGAGAGATCTGATGACCTCTTTGTCTATGCAACATACCGACGAGC
TGTGCTCTCTAGACTACTGGAGAAACAGATACGTTGTATGGCTGCTCG
Ingegnerizzazione di proteine mutanti
… o sfruttando la PCR
AGGTCCATCTGACGTTGCTAGGACATTTAACACGAGAGATCTGATGACCTC
TCCAGGTAGACTGCAACGATCCTGTAAATTGTGCTCTCTAGACTACTGGAG
ACACGAGAGATCTGATGACCTCTTTGTCTATGCAACATACCGACGAGC
TGTGCTCTCTAGACTACTGGAGAAACAGATACGTTGTATGGCTGCTCG
P1
AGGTCCATCTGAC
AGGTCCATCTGACGTTGCTAGGACATTTAACACGAGAGATCTGATGACCTCTTTGTCTATGCAACATACCGACGAGC
TCCAGGTAGACTGCAACGATCCTGTAAATTGTGCTCTCTAGACTACTGGAGAAACAGATACGTTGTATGGCTGCTCG
TGTATGGCTGCTCG
P4
PCR P1+P4
Interazione fisica tra proteine
• Tecniche biochimiche per l’isolamento di complessi proteina-proteina
• Sistema del doppio ibrido
• Screening di library di espressione mediante proteine marcate
Interazione funzionale tra proteine:
potenza dei modelli geneticamente trattabili
Interazione funzionale tra proteine:
potenza dei modelli geneticamente trattabili
EGF
EGF-R
Grb2
Ras
Sos