del dell’immunodosaggio enzimatico convenzionale e fornisce
un’eccellente sensibilità (93,6%) e specificità (97,8%) totali
rispetto ai metodi colturali di riferimento.
Key Code TSMX7845
www.oxoid.com/ifu
Europe +800 135 79 135
US 1 855 2360 190
CA 1 855 805 8539
ROW +31 20 794 7071
IDEIA Herpes Simplex
Virus
IT
K605711-2
96
Un immunodosaggio enzimatico amplificato per la rilevazione
diretta del Virus dell’Herpes Simplex in campioni clinici umani di
pazienti sintomatici.
1.
USO PREVISTO
Il test IDEIA™ Herpes Simplex Virus (HSV) è un immunodosaggio
enzimatico amplificato, qualitativo per il rilevamento diretto
del virus dell’herpes simplex (HSV) in campioni clinici umani di
pazienti sintomatici.
Attualmente esistono 2 metodi diagnostici principali per
la rilevazione dell’HSV in campioni clinici. Il primo si basa
sull’isolamento del virus vitale in coltura cellulare e sulla sua
successiva identificazione con metodi immunologici o mediante
microscopia elettronica,1,2 il secondo si basa sulla dimostrazione
diretta dell’antigene virale in campioni clinici utilizzando
un anticorpo monoclonale marcato con fluoresceina o un
immunodosaggio enzimatico.
L’isolamento virale in colture cellulari in monostrato è difficile,
richiede tempo ed è dispendioso oltre a richiedere un grado di
esperienza tecnica non sempre disponibile in laboratorio.
Il test IDEIA HSV è un test diagnostico alternativo per il
rilevamento diretto dell’antigene dell’herpesvirus in campioni
clinici. Il test utilizza anticorpi monoclonali per rilevare l’antigene
dell’HSV1 e dell’HSV2 e un sistema di amplificazione enzimatica
per aumentare il segnale del test3. L’immunodosaggio enzimatico
è di facile esecuzione ed è più rapido rispetto al metodo di
isolamento virale per il rilevamento dell’HSV in campioni clinici
e coltura cellulare.
Il test IDEIA HSV fornisce tutti i reagenti necessari per il
rilevamento dell’HSV in campioni clinici. L’esecuzione richiede
meno di 2 ore utilizzando le procedure e la strumentazione
Fabbricato da
5.2.1
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Aprire il sacchetto della piastra, tagliando lungo la sigillatura.
Staccare il numero necessario di micropozzetti e trasferirli
nella struttura. Porre i micropozzetti inutilizzati nel sacchetto
risigillabile con l’essiccante, sigillare con attenzione il sacchetto e
conservarlo a 2-8°C. I micropozzetti possono essere utilizzati per
6 settimane dopo la prima apertura, posto che siano conservati
secondo le istruzioni.
Riconoscimenti
Gli anticorpi monoclonali sono stati creati nel Dipartimento di
Patologia dell’University of Cambridge a Cambridge nel Regno Unito4.
4.
DEFINIZIONI
I seguenti simboli sono stati utilizzati nelle informazioni del
prodotto.
Codice del prodotto e numero di catalogo
Consultare le istruzioni per l’uso
2.
SOMMARIO
L’HSV è un virus a DNA con envelope, morfologicamente simile
agli altri membri del genere Herpesviridae. Sono riconosciuti due
tipi antigenici distinti, il tipo 1 e il tipo 2.
Gli HSV di tipo 1 e 2 spesso sono implicati nelle infezioni superficiali
della cavità orale, della pelle, dell’occhio e dei genitali1,2. Più
raramente si osservano anche infezioni del sistema nervoso
centrale (meningoencefaliti) e infezioni gravi generalizzate in
neonati o in pazienti immunocompromessi. Dopo la risoluzione
della prima infezione, il virus può rimanere nel tessuto nervoso
in forma latente e al verificarsi di alcune condizioni può riattivarsi
causando la ricomparsa dei sintomi.
Contiene materiale sufficiente per ‘N’ test
Controllo positivo, 3mL: un omogenato
inattivato di cellule HeLa infettate da HSV in
soluzione tampone che contiene proteine e
detergente.
Controllo negativo, 12mL: soluzione tampone
contenente agente antimicrobico, colorante
colorato e un agente antischiuma.
Coniugato, 7mL: anticorpo monoclonale
murino (frammento principale Fab) coniugato
con fosfatasi alcalina in tampone stabilizzante
contenente colorante colorato e un agente
antimicrobico.
Tampone di lavaggio concentrato (10x), 125mL
soluzione tamponata con Tris contenente
detergente e un agente antimicrobico.
Amplificatore A, 13mL: sali inorganici e
soluzione enzimatica tamponata contenente
tetrazolio violetto e un agente antimicrobico.
Amplificatore B, 13mL: soluzione di NADPH
stabilizzata.
Soluzione di arresto, 13mL: acido fosforico
1mol/L.
5.2. PREPARAZIONE, CONSERVAZIONE E RIUTILIZZO DEI
COMPONENTI DEL KIT
Il formato del kit IDEIA HSV permette l’analisi di 12 lotti di
campioni. Per garantire il risultato ottimale del test è importante
che i componenti inutilizzati del kit siano conservati secondo le
istruzioni.
3.
PRINCIPIO DEL TEST
Il test IDEIA HSV utilizza anticorpi monoclonali murini specifici
per l’HSV e un sistema di amplificazione enzimatica3. L’antigene
dell’HSV (comune per il tipo 1 e 2), presente in un campione
clinico, si lega all’anticorpo monoclonale murino adsorbito alla
superficie del micropozzetto in plastica. L’anticorpo monoclonale
murino coniugato con l’enzima si lega all’antigene”catturato” e
successivamente l’enzima catalizza la conversione del substrato
nel prodotto. Questo prodotto partecipa a una seconda reazione
enzimatica che porta al cambiamento del colore. Lo sviluppo del
colore è interrotto dall’aggiunta dell’acido. L’intensità del colore
significativamente superiore ai livelli di background è indicativa
della presenza dell’antigene dell’HSV nei campioni clinici
(consultare la sezione 9).
N
Utilizzare entro
Codice del lotto
Limiti di temperatura di conservazione
5.
REAGENTI FORNITI
96 – Ogni kit contiene materiale sufficiente per 96
- La stabilità del kit è indicata nell’etichetta
determinazioni.
all’esterno della confezione.
5.1.
CONTENUTO DEL TEST IDEIATM HSV
Un libretto di istruzioni per l’uso.
Una piastra imbustata da 96 micropozzetti
di 12 strisce staccabili da 8 micropozzetti,
coattati con anticorpo monoclonale murino
anti HSV. È fornito un sacchetto in plastica
risigillabile per conservare i micropozzetti
inutilizzati.
Un flacone di ciascuno dei seguenti:
Terreno di trasporto, 100mL: detergente non
ionico in un tampone contenente colorante
colorato, agente antimicrobico e un agente
antischiuma.
5.2.2
Micropozzetti coattati con anticorpo monoclonale -
Terreno di trasporto -
Fornito pronto per l’uso. È importante mischiare il terreno di
trasporto, prima dell’uso.
La torbidità del terreno di trasporto è dovuta alla presenza
dell’agente antischiuma, non influisce sull’analisi e non è dovuta
alla contaminazione microbica.
5.2.3
Controllo positivo -
Pronto per l’uso. Conservare a 2-8°C il controllo positivo
inutilizzato.
5.2.4
Controllo negativo -
Pronto per l’uso. Conservare a 2-8°C il controllo negativo
inutilizzato.
5.2.5
Coniugato -
Pronto per l’uso. Conservare a 2-8°C il coniugato inutilizzato.
5.2.6
Tampone di lavaggio concentrato -
Fornito concentrato 10X. Preparare il tampone di lavaggio alla
concentrazione di lavoro, aggiungendo 1 parte del tampone
concentrato a 9 parti di acqua deionizzata o distillata fresca. Il
concentrato fornito è sufficiente per preparare 100mL di tampone
di lavaggio alla concentrazione di lavoro per ogni striscia da 8
micropozzetti. Preparare la quantità di tampone di lavaggio alla
concentrazione di lavoro necessaria per la giornata lavorativa
(consultare la sezione 8.2.10). Conservare a 2-8°C il concentrato
rimasto.
Non conservare il tampone di lavaggio alla concentrazione di
lavoro per usi successivi (consultare la sezione 8.2.10).
5.2.7
Amplificatore A -
Pronto per l’uso. Conservare a 2-8°C l’amplificatore A inutilizzato.
5.2.8
Amplificatore B -
Pronto per l’uso. Conservare a 2-8°C l’amplificatore B inutilizzato.
5.2.9
Soluzione di arresto -
Pronto per l’uso. Conservare a 2-8°C la soluzione di arresto
inutilizzata.
6.
REAGENTI AGGIUNTIVI
6.1. REAGENTI
Acqua deionizzata o distillata fresca per la preparazione del
tampone di lavaggio.
6.2. ACCESSORI
I seguenti prodotti sono destinati all’uso con il kit IDEIA HSV. Per
ulteriori informazioni contattare la filiale o il distributore Oxoid
di zona.
IDEIA HSV Extraction Buffer 10mL (codice n. S601230-2).
IDEIA HSV Blocking Reagents (codice n. S603330-2).
IDEIA PCE Chlamydia/HSV Wash Buffer Concentrate (X10) 125mL
(codice n. S603930-2).
IDEIA HSV Transport Medium 100mL (codice n. S605530-2).
7.
ATTREZZATURA
È necessaria la seguente attrezzatura:
fiale con tappo a vite pulite
agitatore vortex
carta assorbente pulita (su cui picchiettare leggermente i
micropozzetti per asciugarli)
pipette di precisione e puntali monouso da 50-1000µL o pipette
in plastica graduate per dispensare campioni di 200µL (opzionale)
contenitore per i rifiuti da smaltire con disinfettante fresco adatto
incubatore a 37°C
lavapiastre automatico (opzionale) o attrezzatura adatta per
il lavaggio di strisce di 8 micropozzetti (consultare la sezione
10.4.4), Nota: se si utilizza un lavapiastre automatico con
testina da 8 micropozzetti per il lavaggio di una striscia con
meno di 8 micropozzetti, è importante riempire la striscia con
micropozzetti vuoti.
spettrofotometro o lettore di piastre per immunodosaggio
immunoenzimatico (EIA) per leggere una piastra da 96
micropozzetti a un’assorbanza di 490nm con un intervallo di
riferimento di 620-650nm. Opzionale, consultare la sezione
Lettura dei risultati del test, sezione 10.5).
8.
PRECAUZIONI
- Per uso diagnostico in vitro. Il personale che esegue un
saggio utilizzando questo prodotto deve essere stato addestrato
per l’uso ed essere esperto in procedure di laboratorio.
8.1. PRECAUZIONI DI SICUREZZA
8.1.1
Il terreno di trasporto; il coniugato; il tampone di
lavaggio concentrato; il controllo positivo; il controllo
8.1.2
8.1.3
8.1.4
8.1.5
8.1.6
8.1.7
8.1.8
8.2.
8.2.1
8.2.2
8.2.3
8.2.4
8.2.5
8.2.6
8.2.7
8.2.8
negativo e il reagente amplificatore A contengono azide
sodica (15mmol/L), che è un veleno. L’azide sodica può
reagire con le tubature in rame e in piombo formando
azidi metalliche esplosive. Eliminare sempre i materiali
contenenti azidi sciacquando abbondantemente con
acqua.
La soluzione di arresto contiene acido fosforico 1mol/L.
Indossare abbigliamento e occhiali protettivi per evitare
il contatto con gli occhi e la pelle.
Il controllo positivo contiene l’antigene dell’HSV
inattivato, che è stato dimostrato non essere infettivo.
In ogni caso il controllo deve essere manipolato come
potenzialmente infetto. Contiene anche un detergente
(1% v/v); evitare il contatto con la pelle.
Non mangiare, bere, fumare, conservare né preparare
cibi o applicare cosmetici nell’area di lavoro designata.
Non pipettare i materiali a bocca.
Durante la manipolazione dei campioni si raccomanda
l’utilizzo di guanti monouso e di lavare sempre le mani
dopo aver lavorato con materiale potenzialmente
infettivo.
Smaltire tutti i campioni clinici e i reagenti in conformità
alle normative locali.
Le schede di sicurezza sono disponibili su richiesta per
l’operatore specializzato.
PRECAUZIONI TECNICHE
I componenti non devono essere utilizzati dopo la data
di scadenza indicata sulle etichette. Non mischiare o
scambiare tra loro reagenti provenienti da lotti differenti.
I reagenti sono forniti a concentrazioni di lavoro fisse.
Qualsiasi alterazione dei reagenti o la conservazione
non conforme a quanto indicato nella sezione 5.2 può
influire negativamente sul risultato del test.
Evitare la contaminazione dei reagenti.
Quando si utilizza il metodo della boccetta contagocce,
controllare che tutti i reagenti siano aggiunti nello
stesso modo. (La combinazione dell’uso di pipette e di
contagocce, può alterare la prestazione del kit).
Evitare il campionamento multiplo dai reagenti di
amplificazione. Trasferire la quantità richiesta nei
recipienti adatti, puliti. Non rimettere il reagente in
eccesso nella boccetta contagocce.
Utilizzare pipette monouso o puntali differenti per
ogni campione, controllo o reagente (se non si usano
le boccette contagocce), per evitare la contaminazione
crociata dei campioni, dei controlli e dei reagenti, che
può portare a risultati scorretti.
Conservare l’acqua deionizzata o distillata per la
diluizione dei reagenti concentrati in contenitori puliti
per evitare la contaminazione microbica.
In ogni fase dell’analisi controllare che non si verifichi
contaminazione crociata tra i micropozzetti. È
importante non lasciare che il coniugato contamini gli
altri reagenti o l’attrezzatura. Se non si usa il metodo con
contagocce, utilizzare pipette diverse per dispensare
il coniugato e i reagenti di amplificazione. Evitare di
toccare o schizzare il bordo del micropozzetto con il
coniugato, poiché il coniugato lasciato asciugare sul
bordo del micropozzetto può alterare la prestazione
dell’analisi.
8.2.9
8.2.10
I micropozzetti non possono essere riutilizzati.
Non conservare il tampone di lavaggio alla
concentrazione di lavoro per usi successivi. Quando
non è in uso, il serbatoio del tampone di lavaggio deve
essere sciacquato con acqua deionizzata o distillata e
lasciato asciugare.
8.2.11 Il sistema di amplificazione enzimatica è un rilevatore
delle molecole di fosfatasi alcalina altamente sensibile. È
molto importante che tutto il coniugato non legato sia
rimosso lavando i micropozzetti, prima dell’aggiunta
dei reagenti di amplificazione. Lavare attentamente i
micropozzetti, seguendo le indicazioni descritte nella
sezione 10.4.4; in caso contrario si possono ottenere
risultati errati.
8.2.12 L’attrezzatura per il lavaggio manuale o automatico non
deve presentare contaminazione microbica, deve essere
calibrata correttamente e sottoposta a manutenzione
conforme alle istruzioni del produttore.
8.2.13 Non si devono utilizzare soluzione salina a tampone
fosfato (PBS) o altre soluzioni di lavaggio contenenti
fosfato, al fine di prevenire l’inibizione dell’enzima
del coniugato che potrebbe alterare la prestazione
dell’analisi. L’attrezzatura di lavaggio utilizzata con
soluzioni di lavaggio a base di fosfato deve essere
sciacquata accuratamente con acqua deionizzata o
distillata, prima di caricare l’IDEIA PCE Chlamydia/HSV
Wash Buffer (codice n. S603930-2) alla concentrazione
di lavoro.
9.
RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il kit IDEIA HSV può analizzare i campioni raccolti nei seguenti
modi:
campioni raccolti nell’IDEIA HSV transport medium
(consultare la sezione 9.3.1)
campioni raccolti nel terreno di trasporto per
l’isolamento virale in colture cellulari in monostrato
(consultare la sezione 9.3.2).
9.1. TERRENO DI TRASPORTO
Se si deve utilizzare l’IDEIA HSV transport medium per la raccolta
dei campioni, dispensarne 1mL nelle fiale con tappo a vite, pulite.
Le aliquote da 1mL possono essere conservate a 2-8°C per 12
mesi o fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta della fiala
Conservare a temperatura ambiente (15-30°C) per 6 mesi.
Nota: prima di dispensare o utilizzare il transport medium,
è importante agitarlo con il vortex o mischiarlo. Il transport
medium contiene un agente antischiuma, che rende il
terreno torbido, ma non influisce sull’analisi e non è dovuto a
contaminazione microbica. Inoltre contiene un detergente forte,
che rende il campione inadatto alla coltura cellulare.
9.2. RACCOLTA DEI CAMPIONI
Per un rilevamento ottimale dei campioni clinici è essenziale
una buona tecnica di campionamento. I campioni da una lesione
clinica devono essere raccolti da personale qualificato mediante
un tampone sterile. I campioni devono essere raccolti in modo da
contenere quanto più materiale infetto possibile. Sono consigliati
tamponi sterili con punta in cotone o Dacron® con gambo in
plastica o carta compressa.
Creme, unguenti, lozioni, ghiaccio, alcool, soluzione di betadine,
zinco o un recente semicupio riducono significativamente la
raccolta del virus8. Prima della raccolta dei campioni evitare tali
rimedi, se possibile, o nel caso comunicarlo al medico durante la
raccolta del campione.
9.2.1
Campioni clinici
Le ulcere devono essere passate fermamente con il tampone per
raccogliere le cellule e l’essudato infetti dalla base dell’ulcera. Le
vescicole devono essere aperte con cura, il liquido raccolto sul
tampone e la base della lesione passata con il tampone. Porre
il tampone in una fiala con tappo a vite, pulita con il relativo
terreno di trasporto. Le lesioni pustolose devono essere trattate
come le vescicole, le croste possono essere aggiunte al terreno di
trasporto in una fiala con tappo a vite o inviate secche. I campioni
devono essere conservati a 2-8°C non oltre 3 giorni.
I campioni rettali o ano-rettali contaminati con materiale fecale
possono dare risultati falsi positivi. Tali risultati possono essere
confermati con gli IDEIA HSV Blocking Reagents (codice n.
S603330-2).
9.2.2
Campioni cervicali in pazienti sintomatiche
Passare con forza il tampone su qualsiasi lesione visibile, altrimenti
passarlo sulla cervice. Estrarre il tampone senza toccare la parete
vaginale e porlo in una fiala con tappo a vite con il relativo terreno
di trasporto. I campioni devono essere conservati a 2-8°C non
oltre 3 giorni.
9.3. PROCESSAMENTO DEI CAMPIONI
9.3.1 Tamponi nell’IDEIA HSV Transport Medium
Prima dell’analisi agitare i campioni con il vortex e procedere alla
sezione 10.2.
9.3.2
Tamponi nel terreno di trasporto per l’isolamento
virale
Per il processamento dei tamponi raccolti nel terreno di trasporto
del laboratorio per l’isolamento virale è necessario l’IDEIA HSV
Extraction Buffer (codice n. S601230-2). I campioni devono essere
processati per l’analisi IDEIA HSV solo dopo l’inoculo delle colture
cellulari in monostrato, poiché il trattamento con l’extraction
buffer concentrato rende il campione inadatto all’isolamento
virale.
Aggiungere 100µL di extraction buffer (codice n. S601230-2) a
900µL di terreno di trasporto virale. Processare i campioni in base
alla procedura descritta nella sezione 10.2.
Non utilizzare il terreno di trasporto fornito con il kit per
processare i tamponi nel terreno di trasporto virale, poiché
non permette un’estrazione ottimale dell’antigene dell’HSV dal
tampone.
10.
PROCEDURA DEL TEST
PRIMA DI SVOLGERE LA PROCEDURA DEL TEST SI PREGA DI
LEGGERE LA SEZIONE 8.2 (PRECAUZIONI TECNICHE).
10.1. PREPARAZIONE DEI CONTROLLI
Controllo negativo
Agitare con il vortex il controllo negativo per un minimo di
15 secondi. Aggiungere il reagente direttamente ai micropozzetti
assegnati.
Controllo positivo
Agitare mediante vortex il controllo positivo per 1 minuto.
Aggiungere il reagente direttamente ai micropozzetti assegnati.
Se necessario, si può analizzare un ulteriore controllo con un
livello di reattività inferiore per monitorare la prestazione del kit.
10.2. TRATTAMENTO DI CAMPIONI E CONTROLLI
Agitare con il vortex i campioni processati (vedere sezione 9.3) e
i controlli per 15 secondi, prima di aggiungerli ai micropozzetti.
10.3. CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI TRATTATI
I campioni possono essere conservati a –20°C per 4 settimane
dopo il processamento. Se si analizzano campioni congelati,
lasciarli raggiungere la temperatura ambiente (15-30°C) e
successivamente agitarli vigorosamente mediante vortex per un
minimo di 1 minuto immediatamente prima dell’analisi.
10.4. PROCEDURA D’ANALISI
Durante la procedura d’analisi si consiglia di utilizzare lo stesso
metodo per l’aggiunta dei reagenti nei micropozzetti, ovvero
puntali per pipette, boccette contagocce o sonde automatizzate.
Per piccoli gruppi di analisi l’uso delle boccette contagocce
evita la multipla entrata dei puntali delle pipette nei flaconi dei
reagenti.
10.4.1 Aggiunta dei campioni e dei controlli
Posizione il numero di micropozzetti necessari nel
portamicropozzetti. Aggiungere 200µL dei campioni ai
micropozzetti assegnati. Aggiungere 6 gocce (o 200µL) di controllo
negativo e controllo positivo in micropozzetti distinti. (Devono
essere inclusi almeno 3 controlli negativi e 1 controllo positivo
per ogni lotto di campioni analizzati).
10.4.2 Aggiunta del coniugato
Dopo aver aggiunto tutti i campioni e i controlli, aggiungere 1
goccia (50µL) di coniugato a ogni micropozzetto. Durante la
dispensazione del coniugato non immergere il puntale della
pipetta o la punta della boccetta contagocce nei micropozzetti
per evitare la contaminazione crociata tra di essi. Evitare anche
di toccare o contaminare i tappi o i bordi dei micropozzetti con il
coniugato per non alterare il risultato del test.
10.4.3 Prima incubazione
Porre un coperchio sopra le piastre e incubare i micropozzetti a
35-37°C in una camera umida per 90 minuti.
10.4.4 Lavaggio dei micropozzetti
I micropozzetti devono essere lavati con tampone di lavaggio alla
concentrazione di lavoro fresco (consultare la sezione 5.2.6).
La tecnica del lavaggio è estremamente importante per il
rendimento del test (consultare la sezione 8.2.10) e deve essere
eseguita in modo da garantire il riempimento (con un minimo di
350µL di tampone di lavaggio alla concentrazione di lavoro) e lo
svuotamento completo dei pozzetti.
Sono necessari almeno 4 cicli di lavaggio, con tecniche di lavaggio
automatico o manuale, inserendo 2 minuti di immersione durante
il secondo lavaggio o un totale di 2 minuti di immersione durante
il ciclo completo.
Lavaggio manuale
Per il lavaggio manuale dei micropozzetti, aspirarne il contenuto o
svuotare i micropozzetti capovolgendoli e, utilizzando il tampone di
lavaggio fresco, assicurarsi di riempirli e svuotarli completamente.
Dopo ogni ciclo di lavaggio, rimuovere il rimanente tampone di
lavaggio picchiettando i pozzetti capovolti su carta assorbente
pulita. Il lavaggio manuale risulta più efficiente se il tampone di
lavaggio è versato su un angolo in modo da produrre un vortice
nei micropozzetti. Dopo il lavaggio finale, la piastra deve essere
invertita e picchiettata sulla carta assorbente per rimuovere le
ultime tracce del tampone di lavaggio.
Lavaggio automatico
I lavapiastre automatici devono essere programmati per
completare almeno 4 cicli di lavaggio e incorporare l’equivalente
di 2 minuti di immersione durante il ciclo completo di lavaggio. I
lavapiastre devono essere calibrati correttamente per assicurare
il riempimento e lo svuotamento completo dei micropozzetti tra
i singoli lavaggi. Dopo il lavaggio finale, la piastra deve essere
invertita e picchiettata sulla carta assorbente per rimuovere le
ultime tracce del tampone di lavaggio.
10.6. SOMMARIO DELLA PROCEDURA DEL TEST IDEIA HSV
10.4.5 Aggiunta degli amplificatori
Determinazione fotometrica
I campioni clinici con valori di assorbanza superiori al valore di cutoff sono positivi (consultare la sezione 11.1). Un risultato che cade
all’interno di 0,015 unità di assorbanza del valore di cut-off deve
essere interpretato con cautela, si deve ripetere il test o prelevare
un nuovo campione dal paziente. Se i controlli cadono al di fuori
dei valori attesi, i risultati dei pazienti non devono essere riportati.
Aggiungere 2 gocce (o 100µL) di amplificatore A a ogni
micropozzetto.
Aggiungere 2 gocce (o 100µL) di amplificatore B a ogni pozzetto.
Evitare di toccare i pozzetti con i puntali del contagocce o della
pipetta durante la dispensazione degli amplificatori A e B per
evitare la contaminazione crociata tra i micropozzetti.
10.4.6 Seconda incubazione
11.4. INTERPRETAZIONE E VERIFICA DEI RISULTATI
11.4.1 Interpretazione dei risultati del test
Porre un coperchio sopra le piastre e incubare i micropozzetti a
35-37°C in una camera umida per 30 minuti.
10.4.7 Blocco della reazione
Aggiungere 2 gocce (o 100µL) di soluzione di arresto a ogni
micropozzetto. Assicurare il miscelazione omogenea del
contenuto dei micropozzetti. Il prodotto colorato è stabile
per 30 minuti. Non esporre alla luce solare diretta per evitare
fotodecolorazione del prodotto.
10.5. LETTURA DEI RISULTATI DEL TEST
10.5.1 Lettura visiva
È possibile valutare visivamente i micropozzetti fino a 30 minuti
dopo l’aggiunta della soluzione di arresto. Si consiglia di leggere
fotometricamente i micropozzetti, la cui intensità di colore è di
dubbia lettura, se confrontati con il controllo negativo (consultare
la sezione 10.5.2).
10.5.2 Lettura fotometrica
È possibile leggere fotometricamente i micropozzetti fino a 30
minuti dopo l’aggiunta della soluzione di arresto. Mischiare il
contenuto dei micropozzetti e leggere l’assorbanza di ognuno
utilizzando uno spettrofotometro adatto o un lettore di piastre per
immunodosaggio immunoenzimatico (EIA) impostato a 490nm.
Prima della lettura controllare che il fondo dei micropozzetti sia
pulito e che non vi sia materiale estraneo all’interno. La lettura
deve essere misurata contro aria (cioè senza piastra sul carrello),
prima di procedere alla scansione della piastra.
Alternativamente, se lo spettrofotometro o il lettore di piastre per
EIA consente l’utilizzo di una lunghezza d’onda di riferimento (da
620-650nm), si consiglia la lettura a doppia lunghezza d’onda per
eliminare qualsiasi possibile interferenza causata da aberrazioni,
come sporco o segni, sulla superficie ottica dei micropozzetti.
quello del controllo negativo è positivo. Ogni campione che dà un
colore uguale o di minor intensità al colore dei controlli negativi è
negativo. Ogni campione con una colorazione rosa pallido, simile a
quella dei controlli negativi, deve essere letto fotometricamente o
essere ritestato. In alternativa si può prelevare un altro campione
dal paziente.
11.
CONTROLLO DI QUALITÀ E INTERPRETAZIONE DEI
RISULTATI DEL TEST
11.1. CONTROLLO NEGATIVO
Come descritto nella sezione 10.4.1 (Aggiunta dei campioni e
dei controlli), è necessario includere 3 micropozzetti di controllo
negativo in ogni saggio.
Determinazione visiva
Tutti i micropozzetti dei controlli negativi devono essere incolore o
solo leggermente rosa. In caso contrario non è possibile eseguire
la determinazione visiva del risultato del test. I risultati devono
essere letti fotometricamente o si deve ripetere il test.
Determinazione fotometrica
I valori di assorbanza del singolo controllo negativo devono essere
inferiori o pari a 0,30 unità di assorbanza. I valori di assorbanza
del singolo controllo negativo devono rientrare nell’intervallo
compreso tra il valore medio dell’assorbanza dei 3 controlli
negativi + 0,05 unità di assorbanza. Se il valore di un controllo
negativo cade al di fuori dell’intervallo accettato, escludere il
valore e ricalcolare la media dei 2 controlli rimasti. Se i valori
di 2 controlli negativi risultano inaccettabili, il test deve essere
ripetuto.
Calcolo del valore di cut-off
Il cut-off è calcolato aggiungendo 0,15 alla media dei valori di
assorbanza ottenuti dai controlli negativi.
11.2. CONTROLLO POSITIVO
Come descritto nella sezione 10.4.1 (Aggiunta dei campioni e dei
controlli), è necessario includere 1 micropozzetto di controllo
positivo in ogni saggio.
Determinazione visiva
Il micropozzetto del controllo positivo deve avere un color rosso/
magenta chiaramente distinguibile dai controlli negativi. In caso
contrario non è possibile eseguire la determinazione visiva del
risultato del test. I risultati devono essere letti fotometricamente
o si deve ripetere il test.
La seguente tabella riassume le interpretazioni consigliate e i
risultati riportati
Tabella 11.4
Sommario dell’interpretazione dei risultati e
dei referti suggeriti
Risultato
OD > CO + 0,015
OD = CO ± 0,015
OD < CO - 0,015
Interpretazione Referto suggerito
Positivo*
Antigene dell’HSV presunto
(Non è stato eseguito il blocco del test)
Dubbio*
Impossibile determinare il risultato.
Ritestare
Negativo
Nessun antigene dell’HSV rilevato
OD = densità ottica (unità di assorbanza)
CO = Cut-off = media dei controlli negativi + 0,15 unità di assorbanza
* I risultati positivi e dubbi devono essere verificati.
11.4.2 Verifica dei risultati del test
Se è necessaria la verifica dei campioni risultati reattivi con il
test IDEIA HSV, si consiglia l’utilizzo degli IDEIA HSV Blocking
Reagents (codice n. S603330-2). Il test bloccante per la verifica
dei risultati offre un ulteriore mezzo per il controllo della qualità
delle condizioni della raccolta dei campioni.
12.
LIMITAZIONI DELLA PRESTAZIONE
12.1. La qualità dei campioni è essenziale per la riuscita dei test
diagnostici. I campioni raccolti devono contenere quanto
più antigene virale possibile (consultare la Sezione 9).
Quindi un controllo negativo non esclude la possibilità di
un’infezione da HSV.
12.2. Per una prestazione ottimale utilizzare l’IDEIA HSV
Transport Medium o l’Extraction Buffer. Non sono state
convalidate le caratteristiche prestazionali di questo test
utilizzando un terreno di trasporto diverso.
12.3. Non sono state convalidate le caratteristiche prestazionali
di questo test per l’uso su campioni di pazienti asintomatici,
liquido cerebrospinale, biopsia tissutale o essudato
oculare e per la conferma della coltura del tessuto.
12.4. Questo test rileva il virus dell’Herpes simplex di tipo 1 e di
tipo 2, ma non differenzia il tipo infettante.
Determinazione fotometrica
Il micropozzetto del controllo positivo deve avere un valore di
assorbanza superiore a 0,50 unità di assorbanza. In caso contrario
si deve ripetere il test.
12.5. Questo test non deve essere utilizzato quale unico
metodo di diagnosi dell’HSV, in caso si programmi un
parto cesareo. Devono prevalere i risultati da coltura (se
disponibili) e il giudizio clinico.
11.3. CAMPIONI
Determinazione visiva
Ogni campione che dà un colore rosso/magenta più intenso di
12.6. Questo test può rilevare HSV non vitali, HSV di colture
negative o antigeni di HSV.
12.7. I risultati del test devono essere interpretati valutando
le informazioni derivanti dagli studi epidemiologici, dalla
valutazione clinica del paziente e da altre procedure
diagnostiche.
13.
VALORI ATTESI
Le frequenze dei positivi possono variare in base alla prevalenza
dell’HSV nelle diverse popolazioni, alla posizione geografica, alla
raccolta dei campioni, alla manipolazione, alla conservazione, al
trasporto dei campioni, al comportamento sessuale e all’ambiente
sanitario generale della popolazione dei pazienti in studio.
Il virus dell’herpes simplex infetta l’uomo e ha una diffusione
mondiale; oltre l’80% della popolazione adulta nei paesi
occidentali ha sperimentato l’infezione primaria e molti di essi
sono asintomatici9. A seguito dell’infezione primaria, circa il 45%
degli individui con infezione orale e circa il 60% di pazienti con
herpes genitale sperimentano infezioni ricorrenti10.
Le infezione di herpes simplex all’occhio sono la causa principale
di indirizzamento agli ambulatori oculistici10. L’HSV è stato isolato
dal tratto genitale del 3-5,4% degli uomini e dell’1,0-8,0% delle
donne in cliniche per le malattie sessualmente trasmesse11,12.
Nelle infezioni primarie e ricorrenti sintomatiche le lesioni sono
osservabili sulla pelle, sulle mucose della bocca, sulla faringe,
sui genitali e sull’occhio. Le infezioni che interessano neonati
o individui immunocompromessi, si possono diffondere più
ampiamente interessando organi, quali polmone, cervello,
fegato, milza, ecc.
L’antigene dell’HSV può essere presente e il virus può essere
cresciuto in coltura da liquido delle lesioni vescicolari, saliva o
secrezioni da altri siti infetti, ad es. occhi, faringe o genitali. Inoltre
è possibile crescere in coltura l’HSV da tessuti infetti con herpes
disseminati, ad es. biopsia cerebrale di pazienti con encefalite da
herpes simplex.
La probabilità di rilevare l’HSV diminuisce con il tempo trascorso
dall’insorgenza della malattia e lo sviluppo delle lesioni. La
probabilità di isolamento virale si riduce quando le lesioni si
ulcerano, si forma la crosta e guariscono. I campioni devono
essere raccolti quanto prima possibile dopo l’insorgenza di
lesioni5,6. In uno studio il virus è stato recuperato dal 94% delle
lesioni vescicolari, dall’87% delle lesioni pustolose, dal 70% delle
ulcere e dal 27% delle lesioni con crosta7.
14.
CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI SPECIFICHE
Tutti i risultati assumono che i metodi di coltura cellulare
presentino una sensibilità e una specificità del 100%.
14.1. STUDI CLINICI
Il test IDEIA HSV è stato valutato contro sistemi di coltura cellulare
accettati in 4 laboratori diagnostici indipendenti.
Sono stati valutati un totale di 1375 campioni clinici mediante il test
IDEIA HSV e i risultati sono stati confrontati con quelli dei sistemi
di coltura cellulare impiegati nei centri della sperimentazione
(Tabella 14.1). In questi studi l’incidenza di infezione da HSV
(secondo la coltura cellulare) variava dal 12,7% al 36,9%.
Ogni campione era considerato positivo con il test IDEIA HSV,
quando la sua lettura dell’assorbanza a 492 nm era superiore
al valore del cut-off consigliato (consultare la sezione 11.1). Un
campione era considerato positivo in coltura cellulare quando
presentava il caratteristico effetto citopatico dell’HSV.
Le colture cellulari positive erano tipizzate mediante
immunfluorescenze diretta in 2 dei centri della sperimentazione.
Dei 37* campioni positivi tipizzati al centro 1, 15/37 (40,5%) erano
di tipo 1 e 22/37 (59,5%) erano di tipo 2. Al centro 4 14/71 (19,7%)
erano di tipo 1 e 57/71 (80,3%) erano di tipo 2.
*(4 campioni positivi non erano disponibili per la tipizzazione).
I risultati del test IDEIA HSV corrispondevano a quelli della coltura
cellulare in 1302 su 1375 campioni, con una concordanza totale
del 94,7%.
La risoluzione di 29 risultati “falsi positivi” discrepanti del test
IDEIA HSV dopo riferimento ai dettagli clinici disponibili dà una
concordanza totale finale del 96,8% (1331/1375).
14.2. PRESTAZIONE
Sensibilità*
Complessivamente la sensibilità del test IDEIA HSV era del 93,6%
(307/328).
Specificità*
Complessivamente la specificità del test IDEIA HSV era del 97,8%
(1024/1047).
Valori attesi*
Complessivamente i valori attesi positivi e negativi del test
IDEIA HSV erano del 93,0% (307/330) e del 98,0% (1024/1045)
rispettivamente.
*Dolo la risoluzione di 29 risultati “falsi positivi” discrepanti del
test IDEIA HSV (vedere la tabella 14.2).
Tabella 14.1
Confronto dei risultati ottenuti con il test
IDEIA HSV e la coltura cellulare
TEST IDEIA HSV
STUDIO
% INCIDENZA
PER LA
SENSIBILITÀ
COLTURA
*
1 (UK)
35,3%
(41/116)
90,2%
(37/41)
VALORI ATTESI
SPECIFICITÀ
POSITIVO
*
90,2%
(37/41)
98,7%
(74/75)
NEGATIVO
*
98,7%
(74/75)
*
97,3%
(37/38)
97,3%
(37/38)
94,9%
(74/78)
94,9%
(74/78)
2 (UK)
36,9%
(89/241)
89,9%
(80/89)
90,2%
(83/92)
94,1%
(143/152)
96,0%
(143/149)
89,9%
(80/89)
93,3%
(83/89)
94,1%
(143/152)
94,1%
(143/152)
3 (UK)
12,7%
(98/774)
94,9%
(93/98)
95,5%
97,5%
(106/111) (659/676)
99,4%
(659/663)
84,5%
(93/110)
96,4%
(106/110)
99,2%
(659/664)
99,2%
(659/664)
4 (US)
29,1%
(71/244)
95,8%
(68/71)
96,4%
(81/84)
92,5%
(148/160)
73,1%
(68/93)
87,0%
(81/93)
98,0%
(148/151)
98,0%
(148/151)
Total
85,5%
(148/173)
93,0%
93,6%
95,2%
97,8%
(278/299) (307/328) (1024/1076) (1024/1047)
84,2%
93,0%
(278/330) (307/330)
98,0%
98,0%
(1024/1045) (1024/1045)
*
I dati di questi colonne sono stati ricalcolati dopo la
risoluzione dei 29 risultati “falsi positivi” di IDEIA. Questi
campioni derivavano da pazienti che erano testati positivi
in un sito adiacente, avevano partner HSV positivi o avevano
avuto una precedente storia di infezione da HSV.
Tabella 14.2
Riproducibilità intra- e inter-saggio per il test
IDEIA HSV
Livello di
antigene
Negativo
Intra-saggio (n=3)
GIORNO 1
Media
0,105
DS
0,005
Inter-saggio (n=9)
GIORNO 2
% CV
4,9
Media
0,104
DS
0,006
GIORNO 3
% CV
5,4
Media
0,108
DS
0,005
% CV
4,6
Media
0,106
DS
0,005
% CV
14.4. REATTIVITÀ CROCIATA
Gli organismi dell’elenco seguente alla concentrazione
approssimativa di 107 organismi/ml per colture non virali e di 50100% CPE per colture virali, sono risultati non reattivi con il test
IDEIA HSV.
Acholeplasma laidlawii
Acinetobacter spp
Aeromonas spp
Bacteroides spp
Campylobacter spp
Candida spp
Citrobacter spp
Chlamydia trachomatis
Clostridium spp
Cytomegalovirus
Enterobacter spp
Epstein Barr Virus
Escherichia coli
Gardnerella spp
Haemophilus influenzae
Klebsiella spp
Lactobacillus spp
Listeria spp
15.
0,275
0,010
3,5
0,287
0,010
3,7
0,247
0,003
1,2
0,270
0,019
7,0
Positivo alto
1,279
0,079
6,2
1,205
0,080
6,6
1,100
0,037
3,4
1,195
0,100
8,4
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Stanley CJ, Johannsson A and Self CH (1985)
3.
4.
5.
5,0
Positivo basso
Mycoplasma spp
Neisseria gonorrhoeae
Peptococcus spp
Peptostreptococcus spp
Proteus spp
Pseudomonas spp
Salmonella spp
Serratia spp
Shigella spp
Staphylococcus aureus (cowan 1 strain)
Staphylococcus spp (coag.neg)
Staphylococcus spp (coag.pos)
Streptococcus spp
Trichomonas spp
Ureaplasma urealyticum
Varicella zoster virus
Veillonella spp
6.
14.3. PRECISIONE DEL SAGGIO
La tabella 14.2 mostra i risultati degli studi di precisione per il
test IDEIA HSV.
Sono state valutate in triplo le sospensioni dei controlli di 3
livelli di antigene dell’HSV nell’IDEIA HSV transport medium in 3
occasioni diverse (per un totale di 9 saggi). I risultati sono espressi
in unità di assorbanza a 492nm. Gli intervalli osservati per il CV
intra- e inter-saggio erano 1,2-6,6% e 5,0-8,4% rispettivamente.
7.
8.
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Annals International Medicine 98: 973-83.
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