TUBERCOLOSI
La tubercolosi è
un’infezione causata da due
specie di micobatteri:
Mycobacterium tuberculosis
e Mycobacterium bovis.
Nonostante questi
microorganismi possano
infettare qualsiasi organo,
in pratica è di gran lunga
preminente la localizzazione
polmonare, caratterizzata
istologicamente dalla
formazione del tipico
granuloma.
1
MICOBATTERI
Bacilli molto sottili
Immobili, non sporigeni, aerobi
obbligati
alcune specie producono forme
filamentose con ramificazioni 
mico-batteri : simili ai funghi
peculiari involucri esterni ricchi di
lipidi  difficilmente penetrabili
dai coloranti e una volta colorati
difficilmente decolorabili anche
con l’uso di acidi  acidoresistenza
rallentamento negli scambi di
nutrienti- rallentamento crescita
(t. duplicazione 18-24h, colonie
visibili in 3-6 sett.)
2
MICOBATTERI
• Diverse specie innocui saprofiti nel suolo o
commensali nell’uomo (M. smegmatis)
• Mycobacterium tuberculosis complex:
-M. tuberculosis (b. di Koch) tubercolosi umana
-M. bovis  tubercolosi bovina, trasmissibile
all’uomo
-M. africanum, M. canetti  tubercolosi umana
MOTT: (Mycobacterium other than tuberculosis)
micobatteri opportunisti, hanno assunto rilievo
negli ultimi anni: una delle più frequenti cause di
morte nel pz. malato di AIDS es. MAC (Mycobacterium
avium complex)
3
• M. leprae  lebbra
Classificazione dei principali micobatteri
M.tuberculosis complex
M. avium complex
M.scrofolaceum complex
M.gordonae complex
M.tuberculosis
M.bovis
(M. africanum)
M.avium
M.intracellulare
M. xenopi
M.kansasii complex
M.terrae complex
M.terrae
M.nonchromogenicum
M.triviale
M foruitum complex
M. fortuitum
M.chelonae
M.parafortuitum
complex
M.parafortuitum
M.scrofolaceum
M.simie
M.gordonae
M.szulgai
M. kansasii
M.gastri
M.vaccae
4
M.tuberculosis
epidemiologia
• Tubercolosi: ogni anno alcuni milioni di nuovi casi
• Mortalità: 2-3milioni/anno
• patologia riemergente a causa di:
- flussi migratori, nuove sacche di povertà anche in paesi
industrializzati, aumento patologie da immunosoppressione
Caratteri antigeni
• 2 caratteri antigeni: di natura polisaccaridica e proteine
citoplasmatiche
• cere (acidi micolici + glicolipidi fenolici) con azione adiuvante
l’immunogenicità dei 2 tipi di Ag  favoriscono la risposta
cellulo-mediata
5
PATOGENICITA’
Questo microorganismo non produce esotossine, quindi
l’azione patogena sembra imputabile ad una sua tossicità
intrinseca legata ad alcuni lipidi della parete cellulare
presenti in grande quantità.
Questi lipidi risultano essere in parte vere e proprie cere,
in parte glicolipidi, questi ultimi denominati micosidi dei
quali uno in particolare è considerato essere direttamente
correlato con la virulenza: il fattore cordale.
Un altro micoside di notevole importanza è la cera D,
sostanza localizzata nello strato basale della parete
formata da acidi micolici e da un glicopeptide. Ha il
potere di aumentare l’immunogenicità
6
M.tuberculosis
Glicolipidi fenolici
cere
7
M.tuberculosis
fattori di patogenicità
produzione di emolisine e lipasi, ma non vere tossine
Catalasi, perossidasi e lipoarabinomannani aiutano a
resistere alla risposta cell-ossidativa capacità di
resistere al killing intracellulare:
-inibizione fusione fagosoma-lisosoma
-inibizione
acidificazione
contenuto
del
fagolisosoma
Acidi micolici + glicolipidi, cere D, trealoso 6,6
dimicolato (fattore cordale) causano la formazione di
granulomi nei tessuti animali
fattore cordale tossico per i macrofagi
8
Patogenicità
Le lesioni istopatologiche caratteristiche della
malattia possono essere di tipo essudativo o
produttivo. Le prime sono presenti nelle fasi
iniziali del contagio o quando il
microorganismo prolifera in carenza di
risposta immune adeguata da parte
dell’organismo infettato, mentre le seconde
sono tipiche della fase in cui il soggetto
infettato ha sviluppato una ipersensibilità alle
proteine tubercolari.
9
10
11
M.tuberculosis
patogenesi
• trasmesso per via aerogena  si deposita negli
spazi alveolari  infiammazione essudativa e
accumulo di macrofagi  macrofagi fagocitano
micobatteri  uccisione bacilli e presentazione
antigene  innesco risposta immune
CD4 
CD8 citotossico
lisi e liberazione micobatteri
macrofagi attivati


 fagocitosi e processo
infiamm. di tipo granulomatoso

tubercolo,
circondato
da connettivo e porzione centrale in necrosi, segue precipitazione
di sali di calcio  complesso primario
13
M.tuberculosis
patogenesi
sterilizzazione
complesso primario


infezione cronica paucibacillare
asintomatica, che richiede
macrofagi attivati, CD4 e CD8
diminuita efficienza del sistema immunitario

riattivazione, moltiplicazione,
lesioni granulomatose confluenti, necrosi e colliquazione della
parte centrale contenuto in circolo e diffusione dell’infezione
in sede polmonare ed extrapolmonare (tubercolosi miliare,
meningea, renale, ossea)- espettorato +  trasmissione ad altri
individui
• Rischio di riattivazione più grande entro 2 anni dalla infezione
primaria
14
Diagnosi
Primo passo nella diagnosi laboratoristica consiste
nell’allestimento del preparato microscopico:
strisci colorati con metodiche che evidenzino
l’alcool-acido resistenza tipica dei Micobatteri
come la metodica di Ziehl-Neelsen
La sensibilità dell’esame microscopico è purtroppo
bassa e richiede perché sia positiva una carica di
10.000 bacilli/ml,
15
Diagnosi
La diagnosi definitiva si ottiene però tramite
l’esame colturale ostacolato dall’esasperante
lentezza di crescita dei micobatteri. Primo
passo è la liquefazione e decontaminazione
del campione, che solitamente viene eseguita
utilizzando N acetil cisteina come mucolitico
in soluzione con idrossido di sodio all’ 1%:
quest’ultimo garantisce l’uccisione di tutti gli
altri microorganismi, mentre i micobatteri
risultano protetti grazie alla particolare
ricchezza in acidi grassi.
16
M.tuberculosis
diagnosi microbiologica
ricerca microscopica
• ricerca di bacilli acido-resistenti in espettorato, liquor, materiale
bioptico, urine (possibilità di confondere con M.smegmatis
saprofita dell’apparato genito-urinario)
ricerca colturale
il materiale deve essere decontaminato dalla popolazione microbica
accessoria (NAC + NaOH 2-3% poi HCl)- incubazione 2-3
settimane a 37°C  colonie con leggera pigmentazione giallastra
apparecchiature automatizzate: terreno liquido con palmitato(14C)
che viene metabolizzato dai micobatteri con liberazione di CO2
17
radioattiva
Colorazione di Ziehl-Neelsen
Organismo acidoresistente
Organismo non acido-resistente
Batteri sospesi in SF e
fissati sul vetrino
Carbol-fucsina
e
fenolo 3 min e
sciacquare con H2O
Decolorare con HCl 3%
in alcool 70% 2min e
sciacquare con H2O
Blu di metilene 30 sec
sciacquare con H2O e
asciugare
18
Colorazione di Ziehl-Neelsen
19
DIAGNOSI
Per la ricerca di M. tuberculosis
nell’espettorato si consiglia di
raccogliere il campione del mattino per
tre giorni consecutivi, mentre in presenza
di una sospetta localizzazione alle vie
urinarie sarà opportuno raccogliere la
totalità di urine emesse nelle 72 ore.
20
MICOBATTERI
terreni di coltura
3 tipi di terreni:
• al tuorlo d’uovo (sorgente di
lipidi)
(IUTM,
LowensteinJensen),
verde
malachite,
glicerolo
(M.tubercolosis),
piruvato (M.bovis)
• a composizione chimica sol.
tampone
+
acido
oleico
(sorgente di lipidi), albumina
bovina, destrosio e catalasi
(Middelbrook)
• liquidi formazioni cordali: bacilli
allineati in file parallele a causa
della idrofobicità batterica
21
M.tuberculosis
diagnosi microbiologica
sonde molecolari
amplificazione con PCR e ibridizzazione con sonde:
identificazione definitiva a livello di specie (1-2gg)
ricerca di anticorpi non affidabile
Biologia molecolare anche per ricerca di antibioticoresistenza
22
M.tuberculosis
reazione di Mantoux -tubercolina
•
•
•
•
Utile a fini epidemiologici
accerta la presenza di immunità-cellulo mediata
tubercolina: proteine micobatteriche purificate
si inietta tubercolina per via intradermica (0.1 ml
di opportuna concentrazione) nella faccia volare
dell’avambraccio
• è
possibile
anche
utilizzare
cerotti
per
l’assorbimento percutaneo
• si osserva dopo 24-48h di incubazione allergia
ritardata ( papula eritematosa) nei pz che hanno
subito un’infezione  reazione positiva
• non ha senso diagnostico a meno che non si
dimostri un passaggio da reazione negativa a
positiva nello stesso soggetto in un breve periodo 23
M.tuberculosis
reazione di Mantoux -tubercolina
24
M. tuberculosis
Il test cutaneo alla tubercolina presenta problemi di scarsa
sensibilità, la bassa specificità, il rischio di inadeguato
follow-up del paziente per la lettura (esame standard per la
diagnosi)
Falsopositivi con micobatteri non-tubercolotici, vaccinazioni
con il bacillo di Calmette-Guérin (BCG) (in particolare se
recenti), errate interpretazioni soggettive
Saggi basati sull’interferone gamma antigenespecifico
individuano il rilascio di interferone gamma da parte di
cellule T “di memoria” precedentemente sensibilizzate
mediante stimolazione in vitro con proteine specifiche del
M. tuberculosis. Questi esami non generano risultati falsopositivi in pazienti precedentemente vaccinati con BCG o
affetti dalla maggior parte delle infezioni micobatteriche
non-tubercolotiche; ciò consente una maggiore specificità
dell’identificazione del M. tuberculosis.
25
Infezioni Latenti
Circa un terzo della popolazione mondiale,
compresi 11 milioni di pazienti negli Stati Uniti,
presentano un’infezione latente da
Mycobacterium tuberculosis.
Pazienti provenienti da paesi in cui la malattia è
endemica.
Popolazioni economicamente svantaggiate e nei
pazienti immunodepressi.
Ritardi nell’individuazione e nel trattamento
dell’infezione ne facilitano la trasmissione.
Rilascio di interferone gamma e
sull’amplificazione degli acidi nucleici consentono
un’identificazione più rapida e specifica,
rispettivamente, dell’infezione da M. tuberculosis
26
e della presenza di una malattia attiva.
27
28
Resistenze e terapie
La terapia della tubercolosi si protrae
usualmente per periodi molto lunghi (6-9
mesi), questo perché le molecole
utilizzate necessitano per agire di
organismi metabolicamente attivi,
mentre M. tuberculosis cresce molto
lentamente.
29
Resistenze e terapie
Nel paziente affetto da tubercolosi è verosimile
suddividere i bacilli in tre differenti
sottopopolazioni:
• microorganismi che si sviluppano attivamente in
ambiente extracellulare.
• una seconda sottopopolazione intracellulare si
riproduce più lentamente della precedente nel
contesto della necrosi caseosa.
• la terza, anch’esse a lenta crescita, si riproduce
in ambiente intracellulare ed è quella presente
all’interno dei macrofagi e dei monociti
30
Resistenze e terapie
Non tutti i farmaci antitubercolari dimostrano la
stessa efficacia nei confronti di queste tre
sottopopolazioni, infatti isoniazide, streptomicina
ed etambutolo risultano essere particolarmente
attivi nei confronti delle popolazioni extracellulari
metabolicamente attive; la rifampicina
sembrerebbe attiva unicamente nei confronti della
porzione di bacilli extracellulari. I micobatteri
intracellulari sono invece sensibili alla
pirazinamide che sperimentalmente si è dimostrata
molto efficace
31
Meccanismo d’azione
Isoniazide: inibizione sintesi ac micolici
Rifampicina: RNA polimerasi
Etambutolo: sintesi arabinofuranosilgalattosio
componente della parete micobatterica.
Pirazinamide abbassa il pH citoplasmatico e
disabilita alcuni sistemi di captazione attiva
di nutrienti (quali basi pirimidiniche ed
aminoacidi).
32
M.tuberculosis
terapia
terapia iniziale:
isoniazide
300mg
rifampicina
600mg
pirazinamide
2000mg
etambutolo
1200mg
giornalmente per 2 mesi
terapia di mantenimento:
isoniazide
600mg
rifampicina
600mg
3 volte alla settimana per 4 mesi
33
Vaccinazione
La vaccinazione contro la tubercolosi
utilizzando vaccini preparati utilizzando
vari ceppi dei bacilli di Calmette e Guèrin
ha dato risultati controversi. Recenti studi
hanno infatti dimostrato come il grado di
protezione conferito possa variare
notevolmente. Molto probabilmente la
vaccinazione è utile nel prevenire le forme
più aggressive evitando la disseminazione.
34
M.tuberculosis
resistenza ai farmaci antitubercolari
• emergono facilmente varianti farmaco-resistenti
(necessità multi-terapia)
• resistenza naturale: M.bovis e pirazinamide
• resistenza acquisita: durante la replicazione
batterica, le mutazioni avvengono con frequenza
nota 10-7-10-10 es. R alla rif 10-8, R all’isoniazide 10-6
Il trattamento con gli antibiotici favorisce la
pressione selettiva, i ceppi possono accumulare più
resistenze e una volta resistenti come tali possono
essere trasmessi ad altri soggetti (R primaria il pz
non è mai stato trattato con anti-tubercolari)
la farmaco-resistenza è molto variabile nelle diverse
aree geografiche
35
Best drug treatment for multidrug-resistant
and extensively drug-resistant tuberculosis
José A Caminero, Giovanni Sotgiu,
Alimuddin Zumla, Giovanni Battista
Migliori
Lancet Infect Dis 2010;
10: 621–29
36
Best drug treatment for multidrug-resistant
and extensively drug-resistant tuberculosis
José A Caminero, Giovanni Sotgiu,
Alimuddin Zumla, Giovanni Battista
Migliori
Lancet Infect Dis
2010;
10: 621–29
37
Nanotecnologie
Per inviare ai macrofagi
I farmaci direttamente
Resa >3,5 volte
DDS, drug delivery systems
38
Nuovi antibiotici
Delamanid (OPC-67683) is a novel mycolic acid biosynthesis inhibitor active against
Mycobacterium tuberculosis
Bedaquiline affects the proton pump for ATP synthase. This mechanism is unlike that of the
quinolones, whose target is DNA gyrase. (on combination with moxifloxacin)
PA-824 is a new chemical entity and a member of a class of compounds known as nitroimidazooxazines, with significant antituberculosis activity and a unique mechanism of action ,
nitroimidazopyrans inhibited the synthesis of protein and cell wall lipid. In contrast to current
antitubercular drugs, nitroimidazopyrans exhibited bactericidal activity against both replicating and
static M. tuberculosis. Lead compound PA-824 showed potent bactericidal activity against
multidrug-resistant M. tuberculosis and promising oral activity in animal infection models.
39
40
41
M.tuberculosis
profilassi
Isoniazide per 9 mesi o rifampicina per 4
mesi
Il vaccino è costituito da una variante
apatogena di M.bovis scoperta da
Calmette e Guerin BCG
inoculazione intracutanea
Vaccinazione di massa non praticata nei
paesi industrializzati
vaccinazione di massa nei paesi in via di
42
sviluppo
M.leprae
Bacillo di Hansen
Si moltiplica nei macrofagi e
nelle cellule di Schwann
Lebbra: malattia cronica a
lungo decorso (incubaz. 57anni) decorso caratterizzato
da
lesioni
granulomatose
cutanee
o
mucose
(noduli
leprosi) che vanno incontro a
ulcerazioni provocando spesso
mutilazioni deformanti LEBBRA
LEPROMATOSA
43
M.leprae
• Lebbra: caratterizzata da
lesioni che coinvolgono varie
terminazioni
nervose
periferiche con comparsa di
vaste aree di ipoestesia e
ipopigmentate
LEBBRA
TUBERCOLARE
44
M.leprae
• Trasmissione interumana mediante inalazione o
contatto diretto con le lesioni
• Lebbra tubercolare: forte reazione cellulomediata (pochi bacilli nelle lesioni)
• Lebbra lepromatosa: forte reazione anticorpale
• Contagiosità:
lebbra t. bassa
Lebbra l. molto alta: numerosi bacilli nelle lesioni
45
M.leprae
• Non coltivabile in vitro (armadillo e zampa di
topo)
• Diagnosi mediante dimostrazione dal reperto
microscopico di bacilli acido-resistenti nei
materiali provenienti dai granulomi cutanei o
mucosi o test cutaneo specifico (forma
tubercolare)
46
M.avium complex
• Comune patogeno ambientale. Almeno 30 tipi: sierotipi 4-8 infez.
nei pz. AIDS, 11-20 nei pz. non-AIDS
• Trasmissione per inalazione o ingestione di H2O o cibo contaminati
• Si lega e invade cellule oro-faringee e gastro-intestinali,
sopravvive nei macrofagi
• Causa:
• 1-tubercolosi polmonare in pz. Con funzione resp.compromessa
(es. BPCO) o in pz.immunocompromessi
• 2- linfoadenite nei bambini
• 3-malattia disseminata nei pz. AIDS: febbre, sudorazione, perdita
di peso, anoressia, dolore addominale, diarrea cronica,
linfoadenite e polmonite, nessun organo è risparmiato. La massa
dei bacilli replicanti compromette la funzionalità dell’organo
• È la più comune micobatteriosi nei pz. AIDS
• Trattamento: claritromicina + altri 2 farmaci (etambutolo,
47 rif.,
cip..) isoniazide non attiva
I micobatteri devono il loro nome (una
risposta):
Alla struttura della parete
x
Alla
loro forma
Al tipo di crescita
Al tipo di metabolismo
48
L’alcool-acido resistenza dei micobatteri
dipende (una risposta):
x
Dall’impermeabilità
degli involucri esterni
Dalla permeabilità degli involucri esterni
Dal tipo di crescita
Dal metabolismo rallentato
49
Sono terreni per la coltivazione dei
micobatteri (risposta multipla):
x
IUTM
McConkey
Mueller Hinton
x
Middlebrook
50
Quali delle seguenti affermazioni sono vere sulle
formazioni cordali dei Micobatteri (risposte
multiple):
x
Si
formano nei terreni liquidi
Si formano nei terreni solidi
x
Dipendono
dall’idrofobicità batterica
x
Sono
formate da batteri
Sono formate da materiale mucopolisaccaridico
51
Sono tutte caratteristiche dei micobatteri
tranne una:
Sono bacilli molto sottili
Sono alcool-resistenti
x
Sono
cocchi molto allungati
Crescono lentamente
Crescono in terreni ricchi di lipidi
52
I micobatteri possono essere definiti (una
risposta):
Saprofiti
Commensali
Patogeni
Opportunisti
x
Tutte
le precedenti
53
Sono tutti micobatteri tranne uno:
M.smegmatis
x
M.influenzae
M.tubercolosis
M.bovis
M.leprae
54
Il termine Bacillo di Koch è sinonimo di (una
risposta):
x
M.tubercolosis
M.avium
M.bovis
M.leprae
M.smegmatis
55
La tubercolosi è una patologia (una risposta):
Scomparsa in Europa
x
Riemergente
in Europa
Molto diffusa in Europa
56
Contribuiscono ad aumentare l’incidenza della
tubercolosi (risposta multipla):
x
Flussi
migratori
x
Terapie
immunosopprimenti
x
Denutrizione
e condizioni igieniche
scadenti
Uso degli antibiotici
57
Sono tutte caratteristiche delle cere tranne una:
Sono lipidi degli involucri esterni
Sono costituite da acidi micolici e glicolipidi
fenolici
Coadiuvano l’azione immunogena degli antigeni
Stimolano la risposta cellulo-mediata
x
Conferiscono
termo-resistenza
58
Il
principale fattore di virulenza di
M.tubercolosis è (una risposta):
La produzione di una potente tossina
La produzione di enzimi idrolitici
x
La
capacità di resistere al killing
intracellulare
La capsula
59
Sono tutti fattori di virulenza di
M.tubercolosis tranne uno:
Emolisina
Lipasi
Fattore cordale
x
Invasina
60
La tubercolosi si trasmette (una risposta):
Per via oro-fecale
Per via sessuale
x
Per
via aerogena
Per via ematica
61
Quali cellule del sistema immunitario sono
implicate nella patogenesi della tubercolosi
(risposta multipla):
x
Linfociti
TCD4
x
Macrofagi
x
Linfociti
TCD8
Linfociti B
62
Il complesso primario è (una risposta):
Il primo micobatterio che instaura
l’infezione
Il primo alveolo polmonare infettato
x
Un
tubercolo con sali di calcio precipitati
63
Sono materiali utili per la ricerca di
M.tubercolosis tutti tranne uno:
Espettorato
Liquor
Materiale bioptico
Urine
x
Feci
64
La diagnosi microbiologica di M.tubercolosis
può essere di tipo (risposta multipla):
x
Microscopica
x
Colturale
Ricerca anticorpi
x
Ricerca
acidi nucleici
65
Queste caratteristiche della reazione di
Mantoux sono tutte vere tranne una:
È utile a fini epidemiologici
Si esegue con proteine micobatteriche
purificate
Si ha reazione positiva nei pazienti che
hanno subito un’infezione
x
È
sempre utile a fini diagnostici
66
Contro M.tubercolosis si usa una multiterapia
perché (una risposta):
L’infezione è spesso polimicrobica
x
Emergono
facilmente varianti resistenti
Occorrono dosi massicce di antibiotico
Non si conoscono i tassi di resistenza alle
varie molecole
67
Tutte le affermazioni seguenti sulla terapia
sono vere tranne una:
La terapia iniziale è giornaliera
La terapia iniziale dura 2 mesi
x
La
terapia iniziale dura 4 mesi
La terapia di mantenimento è Isoniazide e
Rifamicina
68