GENOMICA DEL BACILLO TUBERCOLARE
Laura Rindi
Dipartimento di Patologia Sperimentale, Biotecnologie Mediche
Infettivologia ed Epidemiologia - Università di Pisa
GENOMICA
 branca della biologia molecolare che si occupa
dello studio del genoma degli organismi
 studio della struttura, contenuto, funzione ed
evoluzione del genoma
 Genomica comparativa → approccio che consente
l’identificazione di variazioni genetiche tra gli
organismi che possono spiegare differenze nella
fisiologia, biochimica e virulenza
Nature 393, 537-544, 1998
Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the
complete genome sequence
S. T. Cole, et al.
…….The genome comprises 4,411,529 base
pairs, contains around 4,000 genes, and has
a very high guanine + cytosine content that
is reflected in the biased amino-acid
content of the proteins. M. tuberculosis
differs radically from other bacteria in
that a very large portion of its coding
capacity is devoted to the production of
enzymes involved in lipogenesis and lipolysis,
and to two new families of glycine-rich
proteins with a repetitive structure that
may represent a source of antigenic
variation.
Circular map of the chromosome of M. tuberculosis H37Rv
Positions of stable RNA genes (tRNAs are
blue, others are pink) and the direct repeat
region (pink cube);
PPE family
members (green);
Scale in Mb, with 0 representing
the origin of replication.
coding sequence by
strand (clockwise, dark
green; anti-clockwise,
light green);
PE family members
(purple, excluding
PGRS);
PGRS sequences
(dark red)
G + C content, with <65% G + C in
yellow, and >65% G + C in red.
repetitive DNA
(insertion sequences,
orange; 13E12 REP
family, dark pink;
prophage, blue);
Nature 393, 537-544, 1998
Deciphering the biology of Mycobacterium
tuberculosis from the complete genome sequence
S. T. Cole, et al.
+ 82 geni
Microbiology 148, 2967-2973, 2002
Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium
tuberculosis H37Rv
J. C. Camus, et al.
... Here the complete re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis
strain H37Rv is presented almost 4 years after the first submission. Eighty-two new proteincoding sequences (CDS) have been included and 22 of these have a predicted function. .. The
functional classification of 643 CDS has been changed based principally on recent sequence
comparisons and new experimental data from the literature. More than 300 gene names and
over 1000 targeted citations have been added and the lengths of 60 genes have been modified.
Presently, it is possible to assign a function to 2058 proteins (52% of the 3995 proteins
predicted) and only 376 putative proteins share no homology with known proteins and thus could
be unique to M. tuberculosis.
CARATTERISTICHE DEL GENOMA DI M. TUBERCULOSIS H37Rv
 4.411.532 bp
 G+C 65.6%
  4.000 geni codificanti proteine
 50 geni codificanti RNA stabile
52% funzione definita
48% funzione ipotetica o sconosciuta
 Oltre il 51% dei geni è derivato dalla duplicazione genica
 Il 3.4% del genoma è composto da sequenze di inserzione e profagi
CLASSIFICAZIONE FUNZIONALE DEI GENI DI M. TUBERCULOSIS H37Rv
CLASSE
FUNZIONE
NUMERO
DI GENI
0
Virulence, detoxification, adaptation
99
1
Lipid metabolism
233
2
Information pathways
229
3
Cell wall and cell processes
708
4
Stable RNAs
50
5
Insertion sequences and phages
149
6
PE and PPE proteins
170
7
Intermediary metabolism and respiration
894
8
Proteins of unknown function
272
9
Regulatory proteins
189
10
Conserved hypothetical proteins
1051
METABOLISMO LIPIDICO
8% del genoma è dedicato al metabolismo lipidico
(oltre 200 enzimi rispetto ai 50 di E.coli)
Lipid metabolism.
Degradation of host-cell lipids is vital in the intracellular life of M. tuberculosis. Host-cell membranes
provide precursors for many metabolic processes, as well as potential precursors of mycobacterial cellwall constituents, through the actions of a broad family of b-oxidative enzymes encoded by multiple
copies in the genome. These enzymes produce acetyl CoA, which can be converted into many different
metabolites and fuel for the bacteria through the actions of the enzymes of the citric acid cycle and the
glyoxylate shunt of this cycle.
PROTEINE PE E PPE
7% dei geni codifica per due nuove famiglie di proteine ricche in glicina
Ruolo immunologico
SEQUENZE DI DNA RIPETUTE
 Duplicazioni di geni/famiglie di geni
 Sequenze di inserzione
 Sequenze non codificanti disperse
Sequenze di DNA ripetute: SEQUENZE DI INSERZIONE
 Le sequenze di inserzione (IS) sono piccoli segmenti di DNA
(<2.5kb) in grado di inserirsi in siti multipli del genoma.
transposasi
 Il genoma di M. tuberculosis H37Rv contiene 56 copie di
elementi IS appartenenti ad almeno 9 famiglie.
FAMIGLIA IS
MEMBRI IN M. TUBERCULOSIS
IS3
IS6110 (16), IS1540, IS1604
IS5
IS1560, IS1560’, IS-like (2)
IS21
IS1532, IS1533, IS1534
IS30
IS1603
IS110
IS1547 (2), IS1558, IS1558’, IS1607, IS1608’ (2)
IS256
IS1081 (6), IS1552’, IS1553, IS1554
IS1535
IS1535, IS1536, IS1537, IS1538, IS1539, IS1602, IS1605’’
ISL3
IS1555, IS1557 (2), IS1557’, IS1561’, IS1606’’
ignota
IS1556
 Ad eccezione di IS6110, che traspone “frequentemente”,
gli elementi IS sono stabili in H37Rv e in altri isolati.
Sequenze di DNA ripetute: SEQUENZE NON CODIFICANTI DISPERSE
 Locus DR : direct repeat.
Sequenze ripetute di 36 bp
separate da sequenze non
ripetute (spacers) di 36-41
bp
 MIRU : mycobacterial
interspersed repetitive unit.
41 loci
dimensioni 40-100 bp
http://genolist.pasteur.fr/TubercuList
ORGANISM
SIZE
GC CONTENT
PUBLICATION
Mycobacterium tuberculosis H37Rv (lab strain)
4411 Kb
4060 orfs
65.6
Nature 393,537-544
1998-06-11
Mycobacterium leprae TN
3268 Kb
2749 orfs
57.8
Nature 409, 1007-1011
2001-02-22
Mycobacterium tuberculosis CDC1551 (Oshkosh)
4403 Kb
4346 orfs
65.6
J Bacteriol 184, 5479-90
2001-10-02
Mycobacterium bovis AF2122/97(spoligotype 9)
4345 Kb
4012 orfs
65.6
PNAS 100, 7877-7882
2003-06-24
Mycobacterium avium paratuberculosis K-10
4829 Kb
4415 orfs
69.3
PNAS 102, 12344-9
2004-01-30
Mycobacterium sp MCS
5705 Kb
5752 orfs
68
Unpublished
2006-06-09
Mycobacterium smegmatis MC2 155
6988 Kb
6978 orfs
67.4
Unpublished
2006-11-20
Mycobacterium avium 104
5475 Kb
5339 orfs
69
Unpublished
2006-11-20
Mycobacterium ulcerans Agy99
5631 Kb
4291 orfs
65.5
Genome Res 17, 192-200
2006-12-01
Mycobacterium sp KMS
5737 Kb
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68.4
Unpublished
2006-12-20
Mycobacterium vanbaalenii PYR-1
6491 Kb
6092 orfs
67.8
Unpublished
2006-12-27
Mycobacterium bovis BCG Pasteur 1173P2
4374 Kb
4033 orfs
65.6
Unpublished
2007-01-08
Mycobacterium sp JLS
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5899 orfs
68
Unpublished
2007-02-27
Mycobacterium flavenscens (gilvum) PYR-GCK
5619 Kb
5723 orfs
67
Unpublished
2007-04-12
Mycobacterium tuberculosis H37Ra
4419 Kb
4132 orfs
65.6
PLoS ONE 3, e2375
2007-06-01
Mycobacterium tuberculosis F11 (ExPEC)
4424 Kb
4050 orfs
65.6
Unpublished
2007-06-07
Mycobacterium abscessus CIP 104536
5067 Kb
5041 orfs
64
Unpublished
2008-03-01
Mycobacterium marinum M, ATCC BAA-535
6636 Kb
5550 orfs
65
Genome Res. Epub
2008-04-15
http://www.genomesonline.org/gold.cgi
34 ceppi micobatterici
completamente
sequenziati
47 ceppi del complesso
tubercolare in corso di
sequenziamento
M. tuberculosis complex
M. africanum M. canettii M. microti
M. tuberculosis
H37Rv
CDC1551
H37Ra
in corso
in corso
in corso
M. bovis
AF2122/97
4.32 Mb
M. bovis BCG
BCG-Pasteur
4.31Mb
4.41 Mb
Tutti i micobatteri appartenenti al complesso
tubercolare condividono il 99.9% di identità a livello
nucleotidico, ma differiscono ampiamente in termini di
spettro d’ospite e di patogenicità
PLASTICITA’
DEL GENOMA
polimorfismi di
singoli nucleotidi
eventi di inserzione e
delezione
J. Bacteriol, 184, 5479-90, 2002
PNAS, 100, 7877-82, 2003
Whole-Genome Comparison of
Mycobacterium tuberculosis
Clinical and Laboratory Strains
The complete genome sequence
of Mycobacterium bovis
R. D. Fleischmann et al.
T. Garnier et al.
Caratteristiche
M. tuberculosis H37Rv
M. tuberculosis CDC1551
M. bovis AF2122/97
4.411.532
4.403.836
4.345.492
65.6
65.6
65.6
3.995
4.249
3.951
polimorfismi singoli
-
1135
2348
delezioni
-
72
117
inserzioni
-
63
108
Dimensioni del genoma, bp
G+C, %
Geni codificanti per proteine
Rispetto a Mtb H37Rv:
 Il genoma di M. bovis AF2122/97 (identico per oltre il 99.5% a quello di M tuberculosis
H37Rv) rispetto a quelli dei due ceppi tubercolari è più piccolo di 70 kb e contiene circa 60
geni in meno.
 Il 55% delle inserzioni e delezioni tra i due ceppi tubercolari riguardano geni, soprattutto
quelli codificanti per le proteine PE e PPE.
 La variabilità tra M. bovis e Mtb riguarda prevalentemente componenti della parete
cellulare e proteine di secrezione.
Regioni genomiche che differiscono tra M. tuberculosis H37Rv e M. bovis BCG Pasteur
(Esat-6, CFP-10)
(phiRv2)
(fosfolipasi C)
(phiRv1)
(invasina)
Brosch et al. 2002
PNAS 99:3684-9.
Scheme of the proposed evolutionary pathway of
the tubercle bacilli illustrating successive loss of
DNA in certain lineages (gray boxes). The scheme
is based on the presence or absence of conserved
deleted regions and on sequence polymorphisms in
five selected genes. Note that the distances
between certain branches may not correspond to
actual phylogenetic differences calculated by other
methods. Blue arrows indicate that strains are
characterized by katG463. CTG (Leu), gyrA95 ACC
(Thr), typical for group 1 organisms. Green arrows
indicate that strains belong to group 2 characterized
by katG463 CGG (Arg), gyrA95 ACC (Thr). The red
arrow indicates that strains belong to group
3, characterized by katG463 CGG (Arg), gyrA95 AGC
(Ser), as defined by Sreevatsan et al.
Evoluzione del complesso tubercolare
M. bovis
X
M. tuberculosis
Evoluzione del complesso tubercolare
M. bovis
M. tuberculosis
bacillo progenitore
Identificazione rapida del bacillo tubercolare
RDcan
M. canettii
“ancestral”
RD 9
TbD 1
katG 463 CTGCGG
RD9
+
gyrA 95AGCACC
eg. Beijing cluster
“modern”
eg. Haarlem cluster
M. tub.
eg. H37Rv
RD 7
TbD1
-
RD 8
RD 10
M. africanum
mmpL6 551AACAAG
RDmic
M. microti
RDseal
seal
oxyR n285 GA
RD 12
oryx
RD 13
pncAc57CACGAC
goat
RD 4
RD 1
RD 2
“classical”
BCG Tokyo
RD 14
BCG Pasteur
M. bovis
Identificazione rapida del bacillo tubercolare
RDcan
M. canettii
RD 9
TbD 1
katG 463 CTGCGG
RD9
-
gyrA 95AGCACC
“modern”
“ancestral”
M. tub.
RD 7
RD 8
RD 10
M. africanum
mmpL6 551AACAAG
RDmic
M. microti
RDseal
seal-isolates
oxyR n285 GA
RD 12
oryx-isolates
RD 13
pncAc57CACGAC
goat-isolates
RD 4
RD 1
RD 2
“classical”
BCG Tokyo
RD 14
BCG Pasteur
M. bovis
Identificazione rapida del bacillo tubercolare
RDcan
M. canettii
RD 9
TbD 1
katG 463 CTGCGG
RD9
-
mmpL6
551
gyrA 95AGCACC
AAG
“modern”
“ancestral”
M. tub.
RD 7
RD 8
RD 10
M. africanum
mmpL6 551AACAAG
RDmic
M. microti
RDseal
seal-isolates
oxyR n285 GA
RD 12
oryx-isolates
RD 13
goat-isolates
pncA 57CACGAC
RD 4
RD 1
RD 2
“classical”
BCG Tokyo
RD 14
BCG Pasteur
M. bovis
Identificazione rapida del bacillo tubercolare
RDcan
M. canettii
RD 9
TbD 1
katG 463 CTGCGG
RD9
-
gyrA 95AGCACC
“modern”
“ancestral”
M. tub.
RD 7
RD4
-
RD 8
RD 10
M. africanum
mmpL6 551AACAAG
RDmic
M. microti
RDseal
seal
oxyR n285 GA
RD 12
oryx
RD 13
goat
pncA 57CACGAC
RD 4
“classical” M.
RD 1
RD 2
BCG Tokyo
RD 14
BCG Pasteur
bovis
Identificazione rapida del bacillo tubercolare
RDcan
M. canettii
RD 9
TbD 1
katG 463 CTGCGG
RD9 -
gyrA 95AGCACC
“modern”
“ancestral”
M. tub.
RD 7
RD1
-
RD 8
RD 10
M. africanum
mmpL6 551AACAAG
RDmic
M. microti
RDseal
seal
oxyR n285 GA
RD 12
oryx
RD 13
goat
pncA 57CACGAC
RD 4
“classical” M.
RD 1
RD 2
RD 14
BCG
bovis
J. Clin. Microbiol. 41, 1637-1650, 2003
PCR-Based Method To Differentiate the Subspecies of the
Mycobacterium tuberculosis Complex on the Basis of Genomic
Deletions
R. C. Huard, et al.
The composite MtbC PCR
typing panel. Illustrated
are the typical MtbC PCR
panel typing results for a
single representative of
each MtbC subspecies as
well as MOTT (M. avium
subsp. avium is shown).
Lanes:
1, 16S rRNA;
2, Rv0577;
3, IS1561';
4, Rv1510 (RD4);
5, Rv1970 (RD7);
6, Rv3877/8 (RD1);
7, Rv3120 (RD12).
EVOLUZIONE DI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Gagneux S. et.al. PNAS 2006;103:2869-2873
ERA POST-GENOMICA
CARATTERIZZAZIONE
GENOMICA




GENOMICA
COMPARATIVA
Identificazione di fattori di virulenza (confronto
genoma Mtb/BCG) e di antigeni (proteine PE/PPE)
→comprensione dei meccanismi di patogenicità e
sviluppo di nuovi vaccini
Allestimento di test diagnostici rapidi
(identificazione delle specie del complesso
tubercolare; diagnosi immunologica di infezione
latente)
Identificazione di molecole essenziali, potenziali
bersagli per nuovi farmaci
Studi evoluzionistici e di epidemiologia molecolare
Sviluppo di migliori strategie di controllo
dell’infezione tubercolare