IDENTIFICAZIONE DEI
MICOBATTERI
Enrico Tortoli
L’approccio tradizionale
• Test biochimici
• Test colturali
Test biochimici
• Accumulo di niacina
• Riduzione dei nitrati
• Catalasi
• a 68°C
• semiquantitativa
•
•
•
•
•
Idrolisi del Tween 80
Ureasi
Riduzione del tellurito
Arilsolfatasi
β-glucosidasi
Niacina
• Prodotto del metabolismo
micobatterico accumulato nel terreno
•
•
•
•
requisiti della coltura
l’estrazione
la rivelazione
24 ore
• Distingue M. tuberculosis
dalle altre specie
• Irregolarmente positiva in M. simiae
• Raramente positiva in altri
micobatteri
Nitrati
• Molte specie
micobatteriche sono
in grado di ridurre i
nitrati a nitriti
• 4 ore
Catalasi a 68°C
• Praticamente tutti i micobatteri producono
catalasi
• In quasi tutte le specie, ad eccezione di
quelle del M. tuberculosis complex la
catalasi è termoresistente
• incubazione a 68°C per 20 min
• rivelazione con H2O2
• 20 min
Idrolisi del Tween 80
• Alcuni micobatteri
possiedono una esterasi,
grazie ad essa sono in
grado di idrolizzare il Tween
80
• Utilizzando Tween legato a
rosso neutro, l’idrolisi è
evidenziata dal viraggio al
rosso
• 10 giorni
Test colturali
• Velocità di crescita
• Temperature di
crescita
• Pigmento
• Morfologia delle
colonie
• Test di inibizione
selettiva
Velocità di crescita
• I micobatteri a crescita rapida formano
colonie visibili ad occhio nudo in meno di
una settimana
• I micobatteri a crescita lenta possono
richiedere anche 6 settimane
• Il test deve essere eseguito utilizzando
un inoculo standardizzato Il tempo
richiesto per la crescita nella coltura
primaria non è indicativo
• Il tempo richiesto per la crescita in
coltura liquida non è indicativo
Temperature di crescita
• Il range delle temperatura che
permettono lo sviluppo delle
varie specie batteriche è ampio
• Oltre all’incubazione a 37°C è
necessario testare almeno
altre due temperature, 25-30°C
e 42-45°C
Pigmento
• I micobatteri si distinguono in:
• non cromogeni
• scotocromogeni
• fotocromogeni
Morfologia delle colonie
• Aspetto macroscopico
• Aspetto microscopico (10x)
Morfologia delle colonie
M. tuberculosis
Morfologia delle colonie
M. xenopi
Morfologia delle colonie
M. avium
Test di inibizione selettiva
• L’aggiunta al terreno di
particolari sostanze permette di
distinguere le specie che ne
tollerano la presenza, da quelle
che ne risultano inibite
•
•
•
•
•
TCH
NaCl
Tiacetazone
Idrossilamina
(MacConkey)
Identificazione
• Confronto dei risultati dei test con i dati
presenti in letteratura (tabelle)
Isoniazide
Idrossilamina
Tiacetazone
TCH
NaCl
MacConkey
Ureasi
Colonie rugose
Arilsolfatasi
Riduzione del tellurito
Crescita a 45°C
Crescita a 25°C
Crescita lenta
Idrolisi del Tween 80
-glucosidasi
Pigmento al buio
Catalasi >45 mm
Catalasi a 68°C
Riduzione dei nitrati
Niacina
Pigmento alla luce
Crescita in presenza di:
Specie
M. africanum
10
10
0
0
0
0
50
10
100
0
0
0
0
100
90
0
0
10
0
0
0
M. asiaticum
0
0
100
100
0
100
10
100
90
100
0
0
0
10
0
50
0
100
100
82
91
M. avium/intracellululare
0
0
70
19
4
4
10
0
90
100
47
76
0
10
0
24
5
100
98
71
98
M. bovis/M. bovis BCG
0
8
0
0
0
0
0
0
100
0
0
0
0
100
100
0
0
0
0
0
0
M. chelonae
3
8
50
97
0
0
10
20
0
96
0
51
90
50
90
90
59
90
90
96
50
50
M. fallax
10
90
10
50
10
10
50
50
0
90
50
50
10
50
10
10
10
90
90
50
M. flavescens
0
100
100
100
100
100
10
100
50
100
17
32
0
50
100
0
100
100
100
0
0
M. fortuitum
7
100
100
98
0
0
85
33
0
90
0
43
100
50
100
100
100
100
100
96
50
M. gastri
0
0
0
0
0
0
90
100
90
100
0
0
0
50
100
16
0
100
9
0
8
M. gordonae
0
0
100
96
100
100
10
91
90
100
0
0
0
0
8
0
0
100
100
35
87
M. haemophilum
0
0
0
0
0
0
50
0
90
90
0
0
0
90
0
0
0
90
50
50
90
M. kansasii
0
97
100
100
0
97
30
100
100
100
0
0
0
50
100
0
0
100
9
11
15
M. malmoense
0
13
25
0
0
0
10
100
90
100
0
50
0
0
71
10
0
100
100
63
100
M. marinum
0
0
100
33
0
90
50
100
50
100
0
0
6
50
100
0
17
100
67
100
83
M. nonchromogenicum
0
11
100
100
0
0
50
100
90
100
0
0
10
50
0
0
0
100
100
100
100
Conclusioni
•
•
•
•
Non esistono kit commerciali
I tempi sono estremamente lunghi
Non tutti i test sono perfettamente riproducibili
L’affidabilità delle identificazioni è buona solo per le
specie più comuni
• Non permettono di riconoscere i micobatteri rari o
“nuovi”
• Alcuni test possono essere utilizzati, in maniera
mirata, per dirimere ambiguità emergenti da altri
sistemi di identificazione
• Permettono di differenziare M. tuberculosis dalle
altre specie del M. tuberculosis complex
L’analisi dei lipidi
• La parete dei micobatteri è caratterizzata da un
contenuto lipidico elevatissimo
• Acidi micolici
• Acidi grassi saturi ed insaturi
• Alcol
Gli acidi micolici
• Acidi grassi, ramificati in posizione β
• Presenti nella parete batterica dei generi:
•
•
•
•
•
•
Corynebacterium: 22-38 atomi di C
Rhodococcus: 34-52 atomi di C
Nocardia: 44-60 atomi di C
Gordonia: 48-66 atomi di C
Tsukamurella: 64-78 atomi di C
Mycobacterium: 60-90 atomi di C
• Presenza di numerosi gruppi funzionali che
differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici
• alfa-, alfa'-, metoxi-, keto-, epoxi-, wax ester-,
omega' metoxi-mycolati
La parete dei micobatteri
altri lipidi complessi
acidi micolici
arabino-galattano
peptidoglicano
membrana cellulare
Cromatografia su strato
sottile
• Separazione, mediante opportuni solventi, dei
vari acidi micolici presenti nell’estratto
depositato su una piastra di gel di silice
• Evidenziamento degli stessi dopo idonea
colorazione
• Identificazione delle “macchie” in base alla loro
posizione rispetto al fronte di avanzamento del
solvente (fase mobile)
• Identificazione del microorganismo in base al
pattern di acidi micolici
Cromatografia su strato
sottile



  



   
  
  
  
Gas-cromatografia
• Pirolisi degli acidi micolici in esteri
metilici saturi di 22, 24 e 26 atomi di C
• Separazione gas-cromatografica dei
prodotti di clivaggio nonché degli acidi
grassi saturi ed insaturi (fra i quali l’acido
tuberculostearico) e degli alcol
• Identificazione delle catene di C
preferibilmente usando la spettrometria
di massa
• Identificazione del microorganismo in
base al pattern di acidi grassi
2
4
6
2-OH 16:0
8
10
22:0
20:0
17:0
20:0
14:0
2-OH 20:0
24:0
TBS
18:1
16:1
16:0
Gas-cromatografia
12
14
16 min
Il principio della HPLC
• La fase mobile è spinta ad elevata
pressione attraverso la fase stazionaria
(particelle paccate) contenuta nella
colonna
• Il campione viene iniettato direttamente
all'interno del flusso della fase mobile
• La separazione delle varie frazioni del
campione è determinata dalla diversa
polarità delle due fasi
• Le frazioni eluite vengono quantificate in
base alla loro assorbanza
Le componenti del sistema
colonna
iniettore
pompe
detector
solventi
cromatogramma
recorder
Preparazione del campione
• Saponificazione
• un’ansata di colonie in potassa alcolica per 1h a 121°C
• Estrazione
•
•
•
•
aggiunta di cloroformio dopo acidificazione
evaporazione dello strato non acquoso
aggiunta di bicarbonato ed ulteriore evaporazione
solubilizzazione del residuo secco in cloroformio
• Derivatizzazione
• esterificazione con bromofenacil bromuro, in presenza
di catalizzatore, per 40 min a 80°C
• evaporazione e aggiunta al residuo secco di
cloroformio, ac. cloridrico e metanolo
• recupero ed evaporazione dello strato di cloroformio
Identificazione dei picchi 1
TRR=5,3/9,6
SI
5,3
9,6
Identificazione dei picchi 2
SI1
SI2
Esempi di profili HPLC
M. tuberculosis
M. simiae
Conclusioni
• TLC: il numero di specie con pattern
sovrapponibili è molto elevato
• GLC: difficile standardizzazione della
metodica; le differenze quantitative sono
difficilmente interpretabili
• HPLC: elevato potere discriminante, ma il
numero delle specie non differenziabili è
in continua crescita
PCR Restriction Analysis
• hsp65: gene altamente conservato
• Digestione con un enzima di restrizione
specifico per un sito di restrizione non molto
frequente
• Determinazione del pattern di restrizione in
base al numero ed alle dimensioni dei
frammenti ottenuti
• Confronto con pattern di restrizione
appartenenti a specie note
Il metodo
• Amplificazione di una porzione di 439 bp all’interno
del hsp65
• Digestione di 2 aliquote di amplificato usando, su
ciascuna, un diverso enzima di restrizione
• Separazione elettroforetica dei prodotti di digestione
presenti in ciascuna aliquota di amplificato
• Determinazione, per confronto con pesi molecolari
noti, delle dimensioni dei frammenti (quelli inferiori a
40 pb vengono ignorati)
• Uso di un algoritmo per raggiungere l’identificazione
di specie
Gli enzimi di restrizione
• BstEII
• nessuna digestione (440 bp)
• produzione di 2-3 frammenti (320-80 bp)
• HaeIII
• produzione di 2-5 frammenti (265-40 bp)
hsp65 PRA: l’algoritmo
• Differenziazione delle specie, all’interno del pattern di restrizione
prodotto da BstEII, in base al pattern prodotto da HaeIII
BstEII
130 bp
320 bp
120 bp
HaeIII
200/60/50 bp
150/105 bp
M. chelonae
M. haemophilum
185/130 bp
M. terrae
145/130/50 bp M. simiae
130/115/60 bp M. gordonae
130/95/75/60 bp M. kansasii
......
Sviluppi
• Determinazione delle dimensioni esatte
dei frammenti mediante sequenziamento
• Presenza di un sito Internet (PRA-Site)
contenente tutti i pattern di restrizione
delle specie batteriche note
Conclusioni
• Di facile esecuzione ed economico
• Svariate specie sono caratterizzate da
più di un pattern (fino a 9)
• Alcune specie hanno pattern
indistinguibili
DNA-probe
• Enorme risparmio di tempo rispetto
all’identificazione tradizionale
• Specificità elevata
• Disponibili per un numero limitato di
specie
• Costose
DNA-probe commerciali
• AccuProbe (GenProbe)
• INNO LiPA Mycobacterium
(Innogenetic)
• GenoType Mycobacteria (Hain)
AccuProbe
• Bersaglio: rRNA 16S
• Reazione: ibridizzazione in fase liquida, direttamente dalle
colonie
• Rivelazione: in chemioluminescenza (HPA)
• Specificità:
•
•
•
•
M. tuberculosis complex
MAC o, in alternativa, M. avium e M. intracellulare separatamente
M. kansasii
M. gordonae
• Limiti:
• test a cascata
• non disponibili per specie comuni in Europa ma rare negli USA
Ibridizzazione inversa
INNO LiPA
Mycobacterium
•
•
•
•
Bersaglio: regione spaziatrice fra i geni codificanti per rRNA 16S e 23S
Reazione: ibridizzazione inversa, con 21 sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa, del
bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati)
Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi)
Specificità:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Mycobacterium genere
M. tuberculosis complex
M. kansasii (differenziazione dei tipi I, II, III-IV-V-M. gastri)
M. xenopi
M. gordonae
M. avium
M. intracellulare
M. chimaera
MAC
M. scrofulaceum
M. fortuitum
M. marinum-M. ulcerans
M. genavense
M. haemophilum
M. chelonae (differenziazione dei tipi I, III, II-IV)
M. smegmatis
M. malmoense
M. celatum
M. simiae
Limiti:
•
alcune reattività crociate con specie rare
GenoType
Mycobacteria
•
•
•
•
Bersaglio: gene codificante per rRNA 23S
Reazione: ibridizzazione inversa del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati)
con varie sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa
Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi)
Specificità:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Mycobacterium genere
M. tuberculosis complex
M. kansasii-M. gastri
M. xenopi
M. gordonae
M. avium
M. intracellulare
M. scrofulaceum-M. parascrofulaceum-M. paraffinicum
M. malmoense-M. haemophilum-M.palustre-M. nebraskense
M. peregrinum-M. alvei-M. septicum
M. chelonae-M. immunogenum
M. fortuitum-M. mageritense
M. abscessus-M. immunogenum
M. interjectum
M. marinum-M. ulcerans
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Mycobacterium genere
M. simiae
M. mucogenicum-M. ratisbonense
M. celatum I, III
M. phlei
M. szulgai-M. intermedium
M. immunogenum
M. haemophilum-M. nebraskense
M. ulcerans
M. gastri
M. lentiflavum
M. heckeshornense
M. shimoidei
M. genavense-M. triplex
Limiti:
•
•
•
incorretta identificazione dei MAC non-M. avium, non-M. intracellulare
alcune reattività crociate con specie rare
numerose identificazioni non univoche
GenoType Mycobacteria MTBC
• Bersaglio
• gene codificante per rRNA 23S
• gene girB
• regione RD1
• Reazione: ibridizzazione inversa, con 9 sonde immobilizzate su una
striscia di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer
biotinilati)
• Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi)
• Specificità:
•
•
•
•
•
•
•
M. tuberculosis complex
M. tuberculosis
M. africanum tipo I
M. microti
M. bovis
M. bovis BCG
M. caprae
• Limiti:
•
mancato riconoscimento di M. africanum tipo II, di M. canettii e di M. pinnipedii
Identificazione mediante
sequenziamento genico
Prima del sequenziamento
• Scelta del bersaglio
• Presente in tutti gli organismi
• Conservato ma contenente regioni variabili
• Disponibilità di un database contenente le
sequenze con cui si vuol confrontare il
bersaglio
• Scelta dei primer
• Estrazione del DNA dalle cellule
Le fasi del sequenziamento
• Amplificazione del
bersaglio
• Verifica dell’amplificato
• Purificazione
• PCR di
sequenziamento
• Purificazione
dell’amplificato
Miscela di sequenziamento
• Primer
• Due amplificazioni parallele usando in
ciascuna un solo primer (per il filamento
forward o reverse)
•
•
•
•
Tampone
Polimerasi
Nucleotidi
Nucleotidi terminator
Nucleotidi terminator
• Nucleotide (A) che
blocca
l’allungamento del
filamento di ac.
nucleico poiché la
mancanza del
gruppo ossidrile in 3’
impedisce l’attacco
all’ac. fosforico del
nucleotide
successivo
PCR di sequenziamento
(metodo manuale)
• Si esegue in quattro provette diverse
• Tutte e quattro le provette contengono: polimerasi, nucleotidi
normali e primer
• Ciascuna delle quattro provette contiene inoltre un diverso tipo di
nucleotide terminator (adenina-terminator, guanina-terminator, . . .)
• Annealing del primer
• Allungamento del primer:
• Legame di un nucleotide normale: l’allungamento prosegue
• Legame di un nucleotide terminator: l’allungamento si blocca
• In ciascuna delle 4 provette contenente nucleotidi terminator con
una diversa base azotata si formano soltanto filamenti che
terminano con tale base. Tali filamenti avranno tutte le
lunghezze possibili a seconda che il nucleotide terminator si sia
legato alla 1°, 2°, . . , ennesima, posizione possibile
Separazione dell’amplificato
(metodo manuale)
• Si esegue una elettroforesi disponendo i prodotti di amplificazione
delle 4 provette in 4 corsie parallele così che in ognuna di esse
siano presenti filamenti che terminano con una diversa base
• Si usa un gel ad altissima risoluzione, capace di separare
frammenti di DNA che differiscono fra loro per un solo nucleotide. Il
gel (0,3-0,4 mm di spessore) è interposto fra due lastre di vetro di
notevole lunghezza (40 cm circa ).
Il principio del
sequenziamento (metodo manuale)
• La migrazione è inversamente
proporzionale alla lunghezza
del filamento
• La posizione della banda
indica la posizione occupata
all’interno della sequenza,
mentre il tipo di base è
indicato dalla corsia in cui tale
banda si trova
A TAC A G C T G T T . . . . . .
Nucleotidi terminator marcati
(metodo automatico)
• I nucleotidi
terminator sono
marcati con un
fluorocromo
• Si usa un
fluorocromo diverso
per ciascuno dei
quattro tipi di
terminator
PCR di sequenziamento
(metodo automatico)
• Si esegue in una singola provetta
• Tutte le provette contengono: polimerasi, nucleotidi
normali, nucleotidi terminator e primer
• Annealing ed allungamento del primer:
• Legame di un nucleotide normale: l’allungamento prosegue
• Legame di un nucleotide terminator: l’allungamento si blocca
• Si formano, nella stessa provetta, filamenti che avranno
tutte le lunghezze possibili a seconda che il nucleotide
terminator si sia legato alla 1°, 2°, . . , ennesima,
posizione della sequenza. Si avranno quindi filamenti
terminanti con ciascuna delle quattro basi
Il prodotto della PCR
(sequenziamento automatico)
• Se il bersaglio è composto da n nucleotidi si
avranno filamenti di tutte le lunghezze
possibili, da 1 ad n
• Indipendentemente dalla lunghezza, tutti i
filamenti terminanti con adenina
emetteranno fluorescenza di tipo A ; quelli
terminanti con citosina, di tipo B; quelli
terminanti con guanina, di tipo C, e quelli
terminanti con timina, di tipo D
L’elettroferogramma
•
•
•
•
•
•
Il sequenziatore automatico è un apparecchio che, dopo aver prelevato il prodotto della
PCR di sequenziamento, lo sottopone ad elettroforesi all’interno di un capillare
Durante l’attraversamento del capillare i vari spezzoni di DNA vengono colpiti da un
raggio laser
Il raggio laser eccita i vari fluorocromi che marcano i singoli spezzoni
Ciascuno dei quattro fluorocromi emette una diversa lunghezza d’onda
Una cellula fotoelettrica rileva sequenza, tipo ed intensità delle varie emissioni luminose
ed il tutto viene registrato in forma grafica
La sequenza dei picchi corrisponde alla sequenza dei nucleotidi; il tipo (colore del picco)
corrisponde al tipo di base azotata mentre l’intensità (altezza del picco) è irrilevante
L’elettroferogramma
• Normalmente il sistema interpreta automaticamente
l’elettroferogramma
• Quando l’interpretazione non è ovvia, il sistema inserisce una N al
posto della base azotata mancante, questa può essere corretta
manualmente, dopo lettura visiva dell’elettroferogramma, anche
alla luce della sequenza del filamento complementare
G
Il sequenziamento in
microbiologia
• Identificazione
• Sequenziamento di regioni specie-specifiche
• Antibiogramma
• Sequenziamento di regioni in cui possono aversi
mutazioni associate alla resistenza ai farmaci
• Filogenesi
• Confronto della sequenza della medesima regione in
specie diverse, per ricostruirne la storia evolutiva
Identificazione mediante
sequenziamento
• Scelta della regione da sequenziare
•
•
•
•
•
16S rDNA
Internal transcribed spacer
23S rDNA
hsp65
rpoB
• Sequenziamento
• Confronto della sequenza con quelle
presenti in un database
GenBank
• Banca dati pubblica (in Internet) contenente
circa 50 milioni di sequenze geniche delle più
varie regioni di praticamente tutti gli organismi
viventi
• Chiunque può depositare sequenze in
GenBank
• Chiunque può confrontare la propria sequenza
con tutte quelle presenti in GenBank
• Un motore di ricerca individua e restituisce le
sequenze presenti in GenBank che hanno il più
elevato grado di somiglianza con la sequenza
in esame
GenBank BLAST
GenBank BLAST
GenBank, risultati
GenBank, risultati
GenBank, risultati
Le varie possibilità
• Identità 100% con una specie nota (ceppo di
riferimento)
• Identità 100% con un ceppo (non di riferimento)
appartenente ad una specie nota
• Identità 100% con una sequenza non
appartenente a specie conosciute
• Identità <100%
• Verifica delle discordanze ed eventuale correzione
della sequenza e, se confermate:
• Nuovo sequevar
• Nuova specie
Conclusioni
• Sequenziamento:
• Metodo di riferimento
• Sistema aperto
• Problematiche legate ai database
• La scelta fra le identificazioni proposte