KIT AFLATOXIN B1 EIA (Cod. ED 19)
1. INDICAZIONI
Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di Aflatossina B1 in matrici
alimentari e zootecniche.
Ditta produttrice:
EUROPROXIMA B.V. – (NL)
Tipo di test:
Test immunoenzimatico competitivo diretto, quantitativo
Confezione:
96 pozzetti sensibilizzati con anticorpo, in strip da 8
Tempo richiesto:
Esecuzione del test: 1 h. 30 minuti
N° determinazioni effettuabili:
96
N° di analisi effettuabili:
Dipende da quante volte si utilizza il kit: ogni volta che si
allestisce un test si utilizzano 6 pozzetti per gli standard
Limite di rilevabilità (LOD):
0.5 - 1 ng/g in funzione delle matrici
Range di linearità:
0.03 – 1 ng/mL
Standard forniti:
pronti: 1; 0.5; 0.25; 0.125; 0.0625; 0.0313 ppb
Valori di cross-reattività:
Aflatossina
Aflatossina
Aflatossina
Aflatossina
Validità del kit:
10 mesi dalla data di produzione
B1
B2
G1
G2
100 %
20 %
17 %
4%
2. CONTENUTO DEL KIT
Q.TÀ
DESCRIZIONE
Micropiastra da 96 pozzetti, in 12 strip da 8
pozzetti separabili, sensibilizzati con anticorpi
Standard Aflatossina B1 pronti
FORMATO
busta di alluminio
Coniugato Aflatossina-HRP (liofilizzato)
vial - tappo blu - pos 5
Anticorpi anti-Aflatossina (liofilizzato)
Buffer di diluizione conc 4x
vial - tappo giallo - pos 6
vial da 20 mL - pos 1
Stop Solution
Substrato (TMB)
Soluzione di lavaggio concentrata (20×)
vial da 15 mL - pos 4
boccetta marrone da 12 mL - pos 3
vial - tappo nero
boccetta bianca da 30 mL - pos 2
Libretto di istruzioni
3. CONSERVAZIONE
1. Conservare il kit a 2 - 8 °C al buio. Non congelare.
2. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza, oltre la quale non è garantito il corretto
funzionamento.
3. Prima di aprire la busta sigillata con i pozzetti, assicurarsi che sia portata a temperatura
ambiente, per evitare eventuali formazioni di condensa.
4. Portare i reagenti a temperatura ambiente prima di ricostituirli
5. I componenti ricostituiti possono essere utilizzati al massimo per 1 settimana,
conservandoli a 2 - 8 °C al buio. Per la conservazione a lungo termine (fino ad un
anno) dei reattivi ricostituiti si consiglia di congelarli a –20 °C in piccole aliquote.
6. Conservare il substrato al riparo dalla luce a 2-8°C
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Nel caso in cui si osservino i seguenti fenomeni, il kit potrebbe risultare difettoso o inefficace:
- colorazione blu del substrato prima di aggiungerlo nei pozzetti
- una debole o assente colorazione dello standard 0 (E450nm <0.8) al termine della reazione
4. AVVERTENZE
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Le aflatossine sono cancerogene. Evitare contatto con la pelle, non bere né inalare.
La Stop Solution contiene acido solforico 0.5 M. Usare indumenti e protezioni da laboratorio.
I campioni potrebbero essere contaminati, usare i guanti.
Il Substrato è tossico per inalazione e per contatto con la pelle: maneggiare con cura, usare i
guanti.
Usare pipette, puntali, vetreria pulita fra un campione e l’altro per evitare crosscontaminazioni.
Non usare assieme parti di kit di lotti differenti. Non usare il kit dopo la data di scadenza.
I reattivi devono essere completamente disciolti, prima dell’utilizzo. Prestare particolare
attenzione al substrato, che cristallizza a 4 °C.
I pozzetti sono di fatto usati come cuvette ottiche: non toccare la superficie inferiore della
piastra, né sporcarla o rigarla.
5. PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Portare i reagenti a temperatura ambiente (20 – 25 °C). Ogni reattivo non utilizzato deve essere
riposto immediatamente a 2 – 8 °C.
MESCOLARE ACCURATAMENTE IL CONTENUTO DELLE BOCCETTE PRIMA DI DILUIRLO
PREPARARE I REAGENTI POCO PRIMA DI UTILIZZARLI
- Piastra da 96 pozzetti: Conservare le strip non utilizzate nella confezione originaria, sigillata
a +2°C - 8°C
- Soluzione di lavaggio (Rinsing buffer) (60 mL): Concentrato 20 volte. Da preparare prima
dell’uso. Si utilizzano 40 mL di Soluzione di lavaggio diluito (2 mL concentrato + 38 mL H2O) per
strip (8 pozzetti)
- Substrate solution TMB (12 mL): Pronta per l’uso. Precipita a 4°C. Assicurarsi che sia a
temperatura ambiente (al buio) e mescolare il contenuto prima di dispensarlo nei pozzetti.
- Soluzione buffer di diluizione conc 4x: Diluire 20 mL in 60 mL acqua dd, conservare in frigo
fino alla scadenza
- Soluzioni standard: Pronte
- Conjugate solution: Aggiungere 4 mL di buffer di diluizione al coniugato liofilizzato, mescolare
e conservare al buio fino all’uso. Dopo l’uso conservare al buio a 2 - 8 °C per una settimana, o
per lungo tempo a –20 °C.
- Antibody solution: Ricostituire con 4 mL di buffer di diluizione, mescolare e conservare al buio
fino al momento dell’uso. Dopo l’uso conservare al buio a 2 - 8 °C per una settimana o per lungo
tempo a –20 °C.
6. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
1. Macinare con accuratezza 50 - 100 g di campione in modo da ottenere una polvere o miscela
fine.
2. Prelevare 3 g di campione macinato ed aggiungere 9 mL di metanolo 80% in acqua distillata.
3. Agitare bene per qualche minuto, quindi centrifugare (10 min, 2000 g) oppure filtrare.
4. Prelevare un’aliquota di 50 µl di surnatante (se si è centrifugato) o di filtrato ed aggiungere
150 µl di buffer di diluizione, in modo da ottenere una soluzione al metanolo 20%.
5. Usare 50 µl di quest’ultima soluzione nel test ELISA.
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7. ESECUZIONE DEL SAGGIO
Mescolare il contenuto dei reagenti prima di dispensarlo nei pozzetti.
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente.
Prelevare le strip con i pozzetti necessari, inserirle sul supporto e conservare le rimanenti nel
sacchetto, a 4 °C.
Si consiglia di testare i campioni e gli standard in doppio.
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Dispensare 100 µl di buffer di diluizione in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (bianco)
Dispensare 50 µl di buffer di diluizione in duplicato nei pozzetti B1 e B2 (B max)
Dispensare 50 µl di ciascuno standard in duplicato nei pozzetti da C1,2 a H1,2
Dispensare 50 µl di campione in duplicato nei restanti pozzetti.
Dispensare 25 µl di coniugato (Aflatossina-HRP) in tutti i pozzetti tranne in A1 e A2.
Dispensare 25 µl di antibody solution in tutti i pozzetti tranne in A1 e A2.
Coprire e agitare delicatamente la piastra per 1 min.
Incubare per 1 ora a 37 °C al buio.
Vuotare completamente i pozzetti. Lavare la piastra con la soluzione di lavaggio (3 volte).
Dispensare 100 µl di substrate solution in tutti i pozzetti.
Incubare a temperatura ambiente (25 °C) per 30 minuti.
Dispensare 100 µl di stop solution in tutti i pozzetti.
Misurare immediatamente la densità ottica al lettore di micropiastre con filtro a 450 nm.
8. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Sottrarre la media dei valori di OD dei pozzetti A1 e A2 dai valori di OD dei campioni e degli
standard.
Dividere i valori di OD degli standard e dei campioni per la media del segnale massimo (pozzetti
B1 e B2) e moltiplicare per 100. Lo standard 0 sarà cosi uguale a 100% (assorbanza massima) e
le altre OD vengono quotate in valori percentuali rispetto a tale massimo.
Assorbanza standard (o campioni)
--------------------------------------------- x 100 = % assorbanza massima (% max OD)
Assorbanza standard zero
Curva di calibrazione:
Riportare i valori calcolati (% max OD) per gli standard sull’asse lineare delle Y contro la
concentrazione (ng/mL) sull’asse logaritmico X.
La curva dovrebbe essere lineare nel range 0.03 - 1 ng/mL.
Calcoli:
I risultati ottenuti dai diversi campioni possono essere ottenuti per interpolazione sulla curva di
calibrazione. La quantità di Aflatossina nei campioni viene espressa come equivalenti di
Aflatossina B1. In campioni di alimenti o mangimi, preparati come da procedura al punto 6, i
valori di equivalenti di Aflatossina per g di campione ottenuti dalla curva devono essere
moltiplicati per il fattore 12.
(Ad. es. 3 mL di filtrato equivalgono a 1 g di campione; un’ulteriore diluizione di 4 volte per
ottenere una soluzione al metanolo 20 %, comporta un fattore di 12).
9. BIBLIOGRAFIA
1. J.E. Smith, C.W. Lewis and J.G. Anderson. Mycotoxins in human nutrition and health. EU
Directorate-General XII, Science, Research and Development, 1990.
2. J.L. Richard, G.A. Bennett, P.F. Ross and P.E. Nelson. Analysis of naturally occurring
mycotoxins in feedstuffs and food. J. Anim. Sci. 71, 2563-2574, 1993.
3. Council Directive 1999/29EC of 22 April 1999 on the undesirable substances and products in
animal nutrition. Off. J. European Commun. L115 (1999) 32-46.
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Commission Regulation (EC) No 466/2001 of 8 March 2001 setting maximum levels for certain
contaminants in foodstuffs. Off. J. European Commun. L77 (2001) 1-13.
Commission Regulation (EC) No 472/2002 of 12 March 2002 amending Regulation (EC) No
466/2001 setting maximum levels for certain contaminants in foodstuffs.
Commission Regulation (EC) No 2174/2003 of 12 December 2003 amending Regulation (EC) no
466/2001 as regards aflatoxins. Off. J. European Commun. L326 (2003) 12-15.
4. Commission Regulation (EC) No 683/2004 of 13 April 2004 amending Regulation (EC) No
466/2001 as regards aflatoxins and ochratoxin A in foods for infants and young children. Off. J.
European Commun. L106 (2004) 3-5
I campioni risultati positivi con il kit vanno confermati con le metodiche ufficiali.
Istruzioni Originali 5121AFB1p[12]01.08
N.B.: Le presenti istruzioni NON sostituiscono le istruzioni originali d’uso del kit
che vanno comunque consultate prima di iniziare il test.
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