KIT PROGESTERONE EIA (Cod. ED 11)
1. INDICAZIONI
Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di progesterone in campioni di latte
e siero.
Ditta produttrice:
EUROPROXIMA B.V. – (NL)
Tipo di test:
Test immunoenzimatico competitivo diretto, quantitativo
Confezione:
96 pozzetti sensibilizzati con anticorpo, in strip da 8
Tempo richiesto:
Esecuzione del test: 1 h. 30 minuti
N° determinazioni effettuabili:
96
N° di analisi effettuabili:
Dipende da quante volte si utilizza il kit: ogni volta che si
allestisce un test si utilizzano 6 pozzetti per gli standard.
Range di linearità:
0.1 – 5 ng/ml
Standard forniti:
Liofilizzato progesterone
Valori di cross-reattività :
Progesterone
100 %
Idrossiprogesterone < 0,1 %
17-Beta Testosterone < 0,1 %
Validità del kit:
12 mesi dalla data di produzione
2. CONTENUTO DEL KIT
Q.TÀ
DESCRIZIONE
Micropiastra da 96 pozzetti, in 12 strip da 8
pozzetti separabili, sensibilizzati con anticorpi
Standard liofilizzato Prog
FORMATO
busta di alluminio
Coniugato Prog-HRP (liofilizzato)
Anticorpi anti-Prog (liofilizzato)
vial - tappo blu
vial - tappo oro
Buffer di diluizione pH 7
Stop Solution
vial da 40 ml - pos 1
vial da 15 ml - pos 4
Substrato (TMB)
Soluzione di lavaggio concentrata (20×)
boccetta marrone da 12 ml - pos 3
vial - tappo nero
boccetta bianca da 30 ml - pos 2
Libretto di istruzioni
3. CONSERVAZIONE
1. Conservare il kit a 2 - 8 °C al buio. Non congelare.
2. Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza, oltre la quale non è garantito il corretto
funzionamento.
3. Prima di aprire la busta sigillata con i pozzetti, assicurarsi che sia portata a temperatura
ambiente, per evitare eventuali formazioni di condensa.
4. Portare i reagenti a temperatura ambiente prima di ricostituirli
5. I componenti ricostituiti possono essere utilizzati al massimo per 1 settimana, conservandoli a
2 - 8 °C al buio. Per la conservazione a lungo termine (fino ad un anno) dei reattivi ricostituiti
si consiglia di congelarli a –20 °C in piccole aliquote.
6. Conservare il substrato al riparo dalla luce a 2-8°C
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Nel caso in cui si osservino i seguenti fenomeni, il kit potrebbe risultare difettoso o inefficace:
- colorazione blu del substrato prima di aggiungerlo nei pozzetti
- una debole o assente colorazione dello standard 0 (E450nm <0.8) al termine della reazione
4. AVVERTENZE
1. La Stop Solution contiene acido solforico 0.5 M. Usare indumenti e protezioni da laboratorio.
2. I campioni potrebbero essere contaminati, usare i guanti.
3. Il Substrato è tossico per inalazione e per contatto con la pelle: maneggiare con cura, usare i
guanti.
4. Usare pipette, puntali, vetreria pulita fra un campione e l’altro per evitare crosscontaminazioni.
5. Non usare assieme parti di kit di lotti differenti. Non usare il kit dopo la data di scadenza.
6. I reattivi devono essere completamente disciolti, prima dell’utilizzo. Prestare particolare
attenzione al substrato, che cristallizza a 4 °C.
7. I pozzetti sono di fatto usati come cuvette ottiche: non toccare la superficie inferiore della
piastra, né sporcarla o rigarla.
4. PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Portare i reagenti a temperatura ambiente (20 – 25 °C). Ogni reattivo non utilizzato deve essere
riposto immediatamente a 2 – 8 °C.
MESCOLARE ACCURATAMENTE IL CONTENUTO DELLE BOCCETTE PRIMA DI DILUIRLO
PREPARARE I REAGENTI POCO PRIMA DI UTILIZZARLI
- Piastra da 96 pozzetti
Conservare le strip non utilizzate nella confezione originaria, sigillata a +2°C - 8°C
- Soluzione di lavaggio (Rinsing buffer) (30 ml)
Concentrato 20 volte. Da preparare prima dell’uso.
Si utilizzano 40 ml di Soluzione di lavaggio diluito (2 ml concentrato + 38 ml H2O) per strip (8
pozzetti)
- Substrate solution TMB (12 ml)
Pronta per l’uso. Precipita a 4°C. Assicurarsi che sia a temperatura ambiente (al buio) e
mescolare il contenuto prima di dispensarlo nei pozzetti.
- Soluzione buffer di diluizione: Pronta all’uso
- Soluzioni standard
Aggiungere 2 ml di diluition buffer allo std liofilizzato (conc. Soluzione 5 ppb), prelevare 100 µl di
tale soluzione e diluire con 400 µl di diluition buffer in modo da ottenere una concentrazione pari
a 1 ppb. Continuare a fare diluizioni in modo da avere: 1, 0.5; 0.25; 0.125; 0.0625 ppb.
Tenere queste soluzioni al buio fino all’utilizzo.
- Conjugate solution
Aggiungere 4 ml di buffer di diluizione al coniugato concentrato, mescolare e conservare al buio
fino all’uso. Dopo l’uso conservare al buio a 2 - 8 °C, o per lungo tempo a –20 °C.
- Antibody solution
Ricostituire con 4 ml di buffer di diluizione, mescolare e conservare al buio fino al momento
dell’uso. Dopo l’uso conservare al buio a 2 - 8 °C o per lungo tempo a –20 °C.
5. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
LATTE:
1. Campioni congelati sono scongelati e mantenuti a 45°C per un’ora
2. Campioni di latte fresco sono incubati per un’ora a 45°C
3. Centrifugare a 2000g per 20 min. in condizioni refrigerate in posizione invertita per facilitare
la decantazione del latte dopo centrifuga
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4. Usare 50 µl di quest’ultima soluzione nel test ELISA.
SIERO:
- Incubare per 30min. a 50°C
- Diluire 1ml di siero con 1ml di sample diluition buffer preparato come segue (ricetta per 1 litro
d’acqua)
Na2HPO4 0.77g
KH2PO4 0.18g
NaCL 8.94
pH 7.4
- aggiungere ai 2 ml di prima 2 ml di dietil etere
- Centrifugare 5min. a 4°C 2000G
- Evaporare 1 ml della fase organica sotto corrente d’azoto
- Sciogliere il residuo in 0.5ml di diluition buffe ed usare 50 µl di tale soluzione nel test
6. ESECUZIONE DEL SAGGIO
Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente.
Prelevare le strip con i pozzetti necessari, inserirle sul supporto e conservare le rimanenti nel
sacchetto, a 4 °C.
Si consiglia di testare i campioni e gli standard in doppio.
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Dispensare 100 µl di diluition buffer in duplicato nei pozzetti A1 e A2
Dispensare 50 µl di diluition buffer in duplicato nei pozzetti B1 e B2
Dispensare 50 µl degli standard in duplicato nei pozzetti da C1,2 a H1,2
Dispensare 50 µl di campione in duplicato nei restanti pozzetti.
Dispensare 25 µl di coniugato (DON-HRP) in tutti i pozzetti tranne in A1 e A2.
Dispensare 25 µl di antibody solution in tutti i pozzetti tranne in A1 e A2.
Coprire e agitare delicatamente la piastra per 1 min.
Incubare per 1 ora a 4 °C al buio.
Vuotare completamente i pozzetti. Lavare la piastra con la soluzione di lavaggio (3 volte).
Dispensare 100 µl di substrate solution in tutti i pozzetti.
Incubare a temperatura ambiente (25 °C) per 30 minuti.
Dispensare 100 µl di stop solution in tutti i pozzetti.
Misurare immediatamente la densità ottica al lettore di micropiastre con filtro a 450 nm.
7. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Sottrarre la media dei valori di OD dei pozzetti A1 e A2 dai valori di OD dei campioni e degli
standard.
Dividere i valori di OD degli standard e dei campioni per la media del segnale massimo (pozzetti
B1 e B2) e moltiplicare per 100. Lo standard 0 sarà cosi uguale a 100% (assorbanza massima) e
le altre OD vengono quotate in valori percentuali rispetto a tale massimo.
Assorbanza standard (o campioni)
------------------------------------------------- x 100 = % assorbanza massima (% max OD)
Assorbanza standard zero
Curva di calibrazione:
Riportare i valori calcolati (% max OD) per gli standard sull’asse lineare delle Y contro la
concentrazione (ng/ml) sull’asse logaritmico X.
La curva dovrebbe essere lineare nel range 0.1 - 5 ng/ml.
Calcoli:
I risultati ottenuti dai diversi campioni possono essere ottenuti per interpolazione sulla curva di
calibrazione. La quantità di progesterone nei campioni viene espressa come equivalenti di
progesterone.
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Latte e siero:
Gli equivalenti di progesterone letti dalla curva di calibrazione corrispondono ai ng/g di
progesterone nel campione.
I campioni risultati positivi con il kit vanno confermati con le metodiche ufficiali.
N.B.: Le presenti istruzioni NON sostituiscono le istruzioni originali d’uso del kit
che vanno comunque consultate prima di iniziare il test.
8. BIBLIOGRAFIA
1. Hoffman, B., Günzler, O., Hamburger, R. and Smidt, W. Milk-Progesterone as a parameter for
fertility control in cattle; methodological approaches and present status of application in
Germany. Br. Vet. J., 132
(1976) 469-476.
2. Bulman, D.C. and Lamming, G.E. Milk Progesterone levels in relation to conception, repeat
breeding and factors influencing acyclicity in dairy cows. J. Reprod. Fertil., 54 (1978) 447-458.
3. Foote, R.H., Oltenacu, E.A.B., Kimmerfeld, H.L., Smith, R.D., Riek, P.M. and Braun, R.K. Milk
Progesterone as a diagnostic aid. Br. Vet. J., 135 (1979) 550-558.
4. Claus, R., Karg, H., Zwiauer, D., Butler, I.V., Pirchner, F. and Rattenberger, E. Analysis of
factors influencing reproductive performance of the dairy cow by Progesterone assay in milk fat.
Br. Vet. J., 139 (1983)
29-37.
5. Schwalm, J.W. and Tucker, H.A. Glucocorticoids in mammary secretions and blood serum
during reproduction and lactation and distributions of glucocorticoids, Progesterone and estrogens
in fractions of milk. J. Diary Sci.,
61 (1978) 550-560.
6. Prakash, B.S., Meyer, H.H.D. and van de Wiel, D.F.M. Sensitive enzyme immunoassay to
Progesterone in skim milk using second-antibody technique. An. Rprod. Sci., 16 (1988) 225-235.
7. Eissa, H.M., Nachreiner, R.F. and Refsal, K.R. Effects of sample handling temperatures on
bovine skim milk Progesterone concentrations. Acta.Vet. Hung 43 (1995) 79-87.
8. Faller, C., Podestat, U., Hädrich, J., Senn, J and Diehl, Y. Immunoenzymatischer Nachweis von
Progesteron aus Serum. Dtsch. Lebensm. Rdsch. 94 (1998) 9-12.
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