6WDQGDUGL]]D]LRQH
LQWUDRVSHGDOLHUDGHL
PHWRGLDQDOLWLFL
/DIRVIDWDVLDOFDOLQD
$XWULFH
&KLDUD6LODFFL
Anno scolastico 2003-2004
Lavoro pubblicato il 1° giugno 2004
Lavoro di diploma per l’ottenimento del diploma di ODERUDWRULVWDPHGLFR svolto
presso il Laboratorio ospedaliero dell’Ospedale Regionale Bellinzona e Valli
Responsabile del posto di stage:
Tutor:
Roberto Francesconi
Luigi Fraschini
,QGLFH
pag.
Riassunto
3
1. Introduzione
4
2. Materiali e metodi
8
1.1
2.1
2.2
2.3
2.4
La fosfatasi alcalina
Reflotron Sprint
Pipetta Eppendorf (32 mL)
Hitachi 912
Trattamento dei campioni
3. Risultati
3.1
3.2
Calibrazione della pipetta Eppendorf (32 mL)
Riproducibilità degli apparecchi
3.3
Test per il fattore di conversione
3.2.1 Hitachi 912
3.2.2 Reflotron Sprint
5
8
10
10
13
14
14
15
15
16
17
4. Discussione
20
5. Conclusioni
22
6. Ringraziamenti
23
7. Bibliografia
24
Allegato 1 - Risultati dei test eseguiti
Allegato 2 - Morbo di Paget
5LDVVXQWR
Nei laboratori dell’ORBV (Bellinzona, Acquarossa, Faido) alcune analisi vengono svolte con
apparecchi diversi. Per lo stesso paziente vengono rilevati dei valori che presentano delle
differenze soprattutto dovute al fatto che gli apparecchi sono di generazioni diverse e
lavorano con princìpi diversi. A Bellinzona l’attività della fosfatasi alcalina (fosfoidrolasi di
un monoestere fosforico) viene misurata con l’Hitachi 912, mentre ad Acquarossa con il
Reflotron Sprint. L’obiettivo del presente lavoro è stato quello di determinare un fattore di
conversione che permettesse di rendere le analisi, svolte nell’uno e nell’altro laboratorio,
comparabili. Mediante una serie di test effettuati sui medesimi campioni nei laboratori di
Bellinzona e di Acquarossa è stato possibile definire un fattore di conversione di 2.18 per
la fosfatasi alcalina. I valori ottenuti ad Acquarossa devono essere divisi per questo fattore
di conversione, mentre, ovviamente, quelli di Bellinzona devono essere moltiplicati. Il
medico avrà perciò a disposizione un valore calcolato come se l’analisi fosse avvenuta con
i criteri, con i quali egli è abituato a formulare una diagnosi.
L’analisi dell’attività della fosfatasi alcalina è quella che dava maggiori problemi di
comparabilità. I risultati ottenuti a Bellinzona, e considerati nella norma, potevano essere,
se l’analisi veniva effettuata con l’apparecchio di Acquarossa, patologici. Per questa
ragione è stata scelta per questo lavoro di ricerca. In seguito lo stesso tipo di lavoro dovrà
essere svolto anche con altri tipi di analisi.
3DUROHFKLDYH
analisi – diagnosi – conversione – test – comparabile – fosfatasi alcalina.
2
,QWURGX]LRQH
Ho scelto di approfondire il tema “Standardizzazione intraospedaliera dei metodi
analitici: la fosfatasi alcalina.” perché nell’istituto (ORBV) dove ho svolto il mio lavoro di
diploma, costituito da tre sedi (Bellinzona, Acquarossa e Faido), si è potuto constatare
che vi sono delle importanti differenze nella determinazione di diversi parametri,
eseguiti su apparecchi differenti e con tecniche differenti. Lo scopo del lavoro è quindi
quello di determinare se è possibile applicare dei fattori di conversione dei risultati
dell’uno o dell’altro test, affinché i dati ottenuti possano diventare comparabili.
I test scelti per lo sviluppo del lavoro sono eseguiti con due apparecchi:
- Hitachi 912
- Reflotron Sprint.
Il primo viene utilizzato a Bellinzona, mentre il secondo è in uso ad Acquarossa. Le
analisi comuni svolte con questi due apparecchi sono:
œ Glucosio
œ Urea
œ Creatinina
œ
JOXWDPLOWUDVIHUDVL *7
œ Fosfatasi alcalina (ALP)
œ Aspartato-aminotrasferasi (ASAT)
œ Alanina-aminotrasferasi (ALAT)
œ Creatinchinasi (CK)
œ Amilasi
œ Bilirubina
œ Potassio
In tutte le analisi indicate vi sono dei problemi di corrispondenza dei risultati. Per
ragioni diagnostiche invece i risultati dovrebbero essere facilmente confrontabili.
L’analisi che pone maggiori problemi è la fosfatasi alcalina. Per questa ragione ho
deciso, in accordo con il sig. Luigi Fraschini, tutor per il mio lavoro di diploma, di
concentrarmi sulla determinazione di un fattore di conversione per quest’ultima.
Come mai i risultati di queste analisi ottenuti su un apparecchio semi-automatico, il
Reflotron Sprint (pipettaggio manuale) non possono essere confrontati con i risultati
ottenuti su un apparecchio automatico, l’Hitachi 912?
Questa è la domanda che mi sono posta quando ho conosciuto il tema del mio lavoro
di diploma.
Ho dapprima supposto che ci fossero degli errori in fase di preparazione dell’analisi,
ossia nella preanalitica. Nell’apparecchio semi-automatico la preparazione è manuale:
l’operatore esegue il pipettaggio del campione e quindi è possibile che una
manipolazione non perfetta possa comportare degli errori. Si trattava perciò di
eseguire l’analisi adottando con la maggiore precisione possibile le tecniche di
laboratorio apprese. Naturalmente la possibilità di errore in questa manipolazione non
è esclusa, soprattutto se le analisi vengono effettuate da più persone.
3
La seconda ipotesi è che la pipetta sia imprecisa, cioè che ad un valore nominale non
corrisponda l’effettiva quantità di sostanza pipettata. Ho perciò eseguito una
calibratura della pipetta, secondo le indicazioni contenute nelle modalità d’uso della
pipetta, prodotta dalla ditta Eppendorf 1.
Con la tecnica della riproducibilità (20-30 misurazioni dei risultati ottenuti sullo stesso
campione) ho verificato che gli apparecchi fossero precisi. Verificata l’assenza di
problemi in queste tre prime ipotesi ho pensato che fosse possibile determinare un
fattore di conversione. Questo dovrebbe facilitare i medici a meglio comprendere i
valori ottenuti in un ospedale piuttosto che in un altro.
Per ragioni di lettura immediata del testo ho preferito introdurre le abbreviazioni in
corrispondenza della prima citazione dell'
elemento di testo a cui si riferiscono, invece di
aggiungere un lessico finale.
/DIRVIDWDVLDOFDOLQD
Figura 1: modello molecolare della fosfatasi alcalina2
La fosfatasi alcalina è un enzima non organo-specifico, che interviene nel metabolismo
dei composti fosforici organici presenti in tutti i tessuti e particolarmente abbondanti
nel fegato, nelle ossa, nell’intestino e nei reni, catalizzando l’idrolisi a pH alcalino di
parecchi fosfomonoesteri. È associata a membrane citoplasmatiche e microsomi delle
cellule della mucosa dell’intestino tenue, del tubulo convoluto prossimale del rene, degli
osteoblasti, degli epatociti e del sinciziotrofoblasto placentare. L'
esatto ruolo fisiologico
dell'
enzima non è stato stabilito ma si pensa che esso intervenga nel processo di
calcificazione dell'
osso. Utilizzata per la prima volta nella diagnostica delle malattie
ossee da Robinson nel 1923, la AP venne in seguito largamente studiata ed applicata.
Una svolta essenziale per l'
interpretazione del significato clinico di questo enzima fu il
riconoscimento della sua eterogeneità molecolare e la possibilità di applicare l'
analisi
isoenzimatica per identificare le varie forme in cui può presentarsi nel siero in diverse e
specifiche situazioni anatomo-cliniche. Si sa ora che tale eterogeneità è in parte dovuta
a fattori genetici (DNA) ed in parte a modificazioni post-translazionali. Nel siero è
composta da quattro genotipi strutturali: il tipo fegato-ossa-reni, il tipo intestinale, il
tipo placentare e la variante derivante dalle cellule germinali. Il tipo fegato-ossa-reni è
1
2
Eppendorf-Netheler – Hinz GmbH, Hamburg
Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) - Protein Data Bank - http:/ / www.rcsb.org/ pdb/
4
particolarmente importante per le numerose patologie riscontrate in caso di variazione
rispetto ai valori normali.
Figura 2: Modalità di detezione dell’attività dell’enzima fosfatasi alcalina nei tessuti3
3
Constance Cepko, Elizabeth Ryder, Donna M. Fekete, and Suzanne Bruhn, Harvard Medical School and the Howard
Hughes Medical Institute Boston, MA 02115 - DETECTION OF ß-GALACTOSIDASE AND ALKALINE PHOSPHATASE
ACTIVITIES IN TISSUE - http:/ / axon.med.harvard.edu/ ~ cepko/ protocol/ xgalplap-stain.htm
5
La tabella seguente4 indica le variazioni della fosfatasi alcalina per diverse patologie:
',0,18=,21(
$80(172ILQRDYROWHL
YDORULQRUPDOL
$80(172ILQRDYROWH $80(172ILQRDYROWHL
LYDORULQRUPDOL
YDORULQRUPDOL
Iperparatiroidismo
Cirrosi biliare primitiva
Cachessia
Epatiti virali
Metastasi ossee
Acondroplasia
Epatiti croniche
Rachitismo, osteomalacia
Atresia congenita delle vie
biliari
Colestasi extraepatica
Scorbuto
Cirrosi epatiche
Morbo di Paget 5
Sarcoma osteogenico
Plasmocitoma
Osteite deformante
Ipotiroidismo
Epatite alcolica
Ipofosfatasia ereditaria Mononucleosi infettiva (3a
sett.)
Carenza di Mg
Colangite
Anemie gravi
Fratture ossee
Morbo di Cushing
Ittero ostruttivo
incompleto
Intossicazione da vitamina D
Displasia fibrosa
Gravidanza
Colestasi iatrogena
Nei bambini e nei giovani (16-18 anni), l’aumento considerevole della fosfatasi alcalina
è causata dall’aumento dell’attività osteoblastica in seguito ad una crescita ossea
accelerata.
Inoltre nella donna in gravidanza la fosfatasi alcalina aumenta in seguito alla crescita
del feto e alla formazione della relativa placenta.
Figura 3: sito attivo dell’AP.
Per attivarsi la molecola di AP deve avere in corrispondenza del sito attivo due atomi di zinco (azzurre)
4
5
Laboratorio di analisi chimiche Brusca, Roma, http:/ / web.tiscali.it/ labanalisibrusca/
Negli allegati è inserito un testo di presentazione che ho utilizzato per le lezioni di inglese ALP su Hitachi 912 (U/ L)
6
0DWHULDOLHPHWRGL
Come già anticipato i due apparecchi a confronto sono il Reflotron Sprint, che viene
utilizzato presso il Laboratorio ospedaliero dell'
Ospedale di zona di Blenio ad
Acquarossa e l’Hitachi 912, che viene invece utilizzato presso il Laboratorio ospedaliero
dell'
Ospedale San Giovanni di Bellinzona. In questo capitolo li presenterò, aggiungendo
un capitolo importante per il Reflotron, ossia la pipetta utilizzata, prodotta dalla ditta
Eppendorf.
5HIORWURQ6SULQW
Figura 4: Reflotron Sprint
Il sistema Reflotron Sprint utilizza la
tecnologia della dry chemistry (chimica
secca), ossia una tecnica che permette la
determinazione dei parametri senza
utilizzare reagenti allo stato liquido.
L'
operatività è facilitata dalla presenza dei
reagenti già essiccati sulla striscia reattiva e
dal codice magnetico per la trasmissione allo
strumento dei dati relativi all'
analisi da
effettuare e al lotto di reagenti utilizzati.
Vantaggi:
-
può effettuare analisi singole o in piccole serie direttamente su sangue intero
può essere utilizzato anche da personale non specializzato, grazie alla semplicità
d’uso
fornisce risultati affidabili in tempi brevi (3 minuti ca.).
Applicando una goccia di sangue intero (non centrifugato) sulle cartine che vengono
utilizzate per le analisi di chimica secca, gli eritrociti vi si depositano sopra, mentre il
plasma si diffonde (per capillarità) nello strato sottostante “ zona di raccolta del
plasma.
Questa zona si trova sotto i due strati contenenti i reagenti. La parte magnetica
presente sulla striscia reattiva contiene le seguenti informazioni:
œ
œ
œ
œ
œ
œ
tipo di test
tempo di incubazione e momento di inizio della reazione
lunghezza d’onda utilizzata per la misura
numero di misure e intervalli tra le misure
metodo per il calcolo dei risultati
fattori di conversione tra unità SI e unità convenzionali
I risultati delle analisi possono variare leggermente da lotto a lotto a causa delle piccole
differenze nel materiale usato per ogni zona reattiva. Per questa ragione viene
eseguito un accurato controllo di qualità (CQ) e il calcolo dei risultati viene ripetuto
diverse volte per ciascun lotto. Questo assicura dei risultati sempre più affidabili.
7
La procedura di lavoro con l’apparecchio, una volta pipettato il campione, è la
seguente:
œ
œ
œ
inserire la striscia reattiva e chiudere lo sportello
mentre la striscia viene portata in posizione di misura, lo strumento esegue
automaticamente la prima funzione: lettura del codice. Questa lettura permette
l’esecuzione del procedimento analitico e del calcolo dei risultati
mettere in incubazione
Durante l’incubazione viene separato il plasma e la temperatura deve raggiungere
37°C.
In uno stadio successivo la testina di misura preme i reagenti contro la zona
sottostante, contenente il plasma, in modo da mettere a contatto i campioni di plasma
con i reagenti del test.
“ inizio della reazione.
Il colore sviluppato viene registrato attraverso una pellicola trasparente dal sistema
ottico. La lunghezza d’onda viene scelta fra le tre differenti sorgenti luminose, a
seconda del tipo di test (567 nm, 642 nm, 951 nm).
La zona reattiva viene illuminata dalla luce diffusa emessa dai LED e riflessa dalle
pareti bianche della sfera di Ulbricht. Questo tipo di misura elimina ogni possibilità di
errore.
Figura 5: Schema della striscia reattiva
Valori di riferimento6:
Pz þ: 106-265 U/L
Pz €: 83-223 U/ L
CQ: 133-163 U/ L
6
Per la fosfatasi alcalina
8
Principio del test 7
Il campione applicato sulla striscia reattiva, penetra nella zona di reazione.
La fosfatasi alcalina (ALP) idrolizza il fosfato di o-cresoftaleina in o-cresolftaleina
trasferendo il gruppo fosfato alla molecola di metilglucamina. Il prodotto colorato
derivato dall’idrolisi o-cresoftaleina è prodotto per unità di tempo in ambiente alcalino
in quantità direttamente proporzionale dell’attività delle fosfatasi alcaline.
o-cresoftaleina fosfato + metilglucamina
ALP
“ o-cresolftaleina+ metilglucamina fosfato
Ad una temperatura di 37°C il colore sviluppato dalla reazione viene misurato
cineticamente a 567 nm ed il risultato appare sul display dopo circa 135 secondi.
Il campione viene preparato manualmente, con l’ausilio della pipetta Eppendorf, che
descrivo.
3LSHWWD(SSHQGRUIm/
Figura8 6 La gamma di produzione a cui appartiene la pipetta utilizzata (32
L).
La pipetta Eppendorf (32 mL) è uno strumento
che permette di misurare con precisione dei
piccoli volumi, cioè anche il quantitativo
necessario per le analisi con il Reflotron Sprint.
Queste pipette funzionano con un sistema a stantuffo. Se lo stantuffo non è in
posizione corretta, il volume sarà sbagliato e quindi l’analisi potrebbe dare dei risultati
non corretti. È per questo che bisogna calibrare le pipette Eppendorf con una certa
frequenza, ogni 6 mesi (ca.). Per farlo è sufficiente avere una bilancia analitica, e un
po’ di acqua. Calibrare significa pesare il volume che può misurare la pipetta. In questo
caso si peseranno 32 mL.
+LWDFKL
9
Figura 7: Hitachi 912
Hitachi 912 è un sistema analitico che
utilizza la tecnologia della CHIMICA
LIQUIDA, ossia per la determinazione dei
parametri chimico-clinici vengono
utilizzati esclusivamente dei reagenti allo
stato liquido.
L’affidabilità, il consolidamento analitico,
la flessibilità e l’elevata produttività ne
fanno il sistema ideale per piccole-medie
routine. Sono possibili 100 analisi
diverse.
7
idem
Eppendorf-Netheler – Hinz, Amburgo: http:/ / www.eppendorf.com/ en/ index.php
9
Roche Diagnostics – Laboratorio – Prodotti: http:/ / roche-diagnostics.it/ prodotti/ Laboratorio/
8
9
Vantaggi:
-
esecuzione di 720 test all’ora
32 canali in linea
autocalibrazione
prediluizione automatica
pronto all’uso 24 h su 24 h
lettura codice a barre dei campioni
lettura codice a barre dei reagenti
punto finale, cinetica enzimatica e chimica isoenzimatica
ISE
bianco campione automatico
115 posizioni per la routine, per i calibratori, per i CQ e per le soluzioni di
lavaggio
Inoltre l’Hitachi 912 presenta le seguenti altre caratteristiche:
-
robustezza delle parti meccaniche
affidabilità continua
gestione efficiente
minima manualità di gestione
software operativo Windows NT
riconoscimento positivo di campioni e reagenti mediante codice a barre
caricamento di provette primarie e secondarie
aiuto in linea
avviamento entro tre minuti dalla condizioni di stand by
possibilità di selezionare campioni urgenti con esecuzione prioritaria sulla routine
L’Hitachi 912 viene calibrato una volta al giorno (a mezzogiorno, presso l’OSG).
Malgrado lo strumento sia molto affidabile la calibrazione viene controllata una seconda
volta, a mezzanotte.
La calibrazione avviene nel modo seguente:
-
-
lo strumento deve essere in situazione
STOP
a questo punto viene spento
in seguito vengono aperti i due vani
portareagenti refrigerati (1, 2 nella figura
a lato) e sostituiti o rabboccati i reagenti
consumati
vengono chiusi i due vani e lo strumento
viene riavviato
lo strumento legge automaticamente i
codici a barre dei reagenti
Figura 8: Visione della zona operativa dell’Hitachi 912
sullo schermo del computer viene controllato dall’operatore che i barcode siano
stati letti in modo corretto. In caso contrario appare sullo schermo quale analisi
non può essere effettuata
10
-
nell’anello interno refrigerato (3 nella figura sopra) viene immesso uno standard
alto, uno basso e un compensatore per la modalità ISE. Inoltre viene aggiunto
un MT (calibratore) per tutte le altre analisi
quando appare sul monitor del PC “Start up calibration”, allora cliccando si avvia
la calibrazione dello strumento
Immediatamente dopo la calibrazione avvengono i controlli (ripetuti a mezzanotte) con
la seguente procedura:
-
nell’anello delle urgenze (4 nella figura sopra) viene messo un campione con
NaCl
sul monitor si clicca sul pulsante con la scritta corrispondente al campione
inserito (NaCl) e compaiono tutte le analisi che lo strumento deve fare
viene cliccato “Accept/ next” e si passa al campione successivo (PU = Precinorm,
controllo)
viene aggiunto un campione NaCl per l’analisi CK-MB10 per evitare le
interferenze con le altre
si clicca su PU e su “Accept/ next”, come precedentemente, aggiungendo anche
in questo caso il campione PU per l’analisi CK-MB
si prosegue con NaCl due volte, la prima selezionando il pulsante
corrispondente, la seconda selezionando l’analisi PCR11
a questo punto vengono selezionate i due controlli “C1” e “C2” della PCR
si continua con un campione NaCl per l’analisi HDL12 e si seleziona l’analisi
corrispondente
per finire si selezionano i pulsanti corrispondenti MQ113 e MQ3
Valori di riferimento14:
Pz þ : 40-129 U/ L
Pz € : 35-104 U/ L
CQ1 : 36-42 U/ L
CQ3 : 303-318 U/ L
CQ4 : 82-101 U/ L
Principio del test 15
Test colorimetrico conforme ad un metodo standardizzato.
R1: tampone/ attivatori
R2: substrato
p-nitrofenilfosfato + H2O
ALP
“
fosfato + p-nitrofenolo
10
CK-MB = Creatinfosfochinasi per muscoli e cervello
CRP = proteina C-reattiva
12
HDL = High Density Lipoprotein
13
MQ = Multi Qual
14
Per la fosfatasi alcalina
15
idem
11
11
In presenza di ioni magnesio e di zinco, il p-nitrofenilfosfato viene scisso dalle fosfatasi
in p-nitrofenolo e fosfato. Il p-nitrofenolo rilasciato, proporzionale all’attività della
fosfatasi alcalina, viene misurato fotometricamente.
7UDWWDPHQWRGHLFDPSLRQL
Per il test della riproducibilità16 degli apparecchi, ho preso tre sieri di pazienti del giorno
prima (in frigo da 24h), con valori della fosfatasi alcalina attorno al 90 U/ L, e li ho
mescolati tra di loro per fare in modo che ci fosse siero a sufficienza per fare 20
misurazioni.
Dopo aver misurato la riproducibilità dell’Hitachi 912, ho congelato il siero (-30°C). Un
mese dopo circa ho eseguito questo test con il Reflotron Sprint ad Acquarossa. La sera
prima di andare ad Acquarossa, ho preso il campione e l’ho messo in un frigobox in
grado di mantenere la temperatura di congelamento costante per 24h.
Arrivata ad Acquarossa l’ho scongelato (scongelamento spontaneo: circa 90 minuti a
temperatura ambiente- 22°C) ed ho eseguito il test della riproducibilità del Reflotron
Sprint.
Per determinare il fattore di conversione ho invece preso campioni di 30 pazienti con
dei valori della fosfatasi alcalina tra 80-300 U/ L. Ho cercato di prendere dei pazienti del
giorno stesso, ma purtroppo, essendo giovedì, ne ho trovati ben pochi. Ho quindi
deciso di prendere dei campioni del giorno prima. Poiché la fosfatasi alcalina rimane
stabile per la durata di 7 giorni a TA (temperatura ambiente) o in frigorifero (4-8°C)
(Vedi libretto Roche) ho potuto prendere questa decisione.
Il giorno seguente sono andata ad Acquarossa per eseguire il test di confronto. Per il
trasporto i campioni sono stati messi in una scatola di polistirolo con all’interno un
“frigobox” avvolto nella carta da cucina, in modo da non congelare i prelievi. Ho così
eseguito il test, ottenendo i risultati che descrivo nel capitolo seguente.
16
I risultati dei test di riproducibilità per l’Hitachi 912 e per il Reflotron Sprint sono presentati nel capitolo seguente
12
5LVXOWDWL
&DOLEUD]LRQHGHOODSLSHWWD(SSHQGRUIm/
Per questo test ho eseguito 20 misurazioni.
Pesata (g)
Pesata (g)
1
2
0.032
0.032
Media
0.032
11
12
0.032
0.032
3
4
0.033
0.032
DS
0.0004588
13
14
0.032
0.032
5
6
7
8
9
10
0.032
0.032
0.032
0.031
0.031
0.033
CV
1.4338483
15
16
17
18
19
20
0.032
0.032
0.032
0.032
0.032
0.032
Per questa operazione ho usato una bilancia Mettler Toledo PB 153, n° serie
1118011563, con numero di inventario EOC IOS000249.
Per la calibrazione della pipetta viene usata acqua alla temperatura di 24°C
(temperatura rilevata con un termometro a mercurio immerso nell'
acqua).
&DOLEUD]LRQHSLSHWWD
9DORULRWWHQXWL
0.034
0.033
0.032
0.031
0.03
0.029
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
QƒPLVXUD]LRQL
13
5LSURGXFLELOLWjGHJOLDSSDUHFFKL
+LWDFKL
Questo test è stato ripetuto 20 volte, per avere dei risultati a sufficienza da
confrontare.
$/3VX+LWDFKL
8/
1
93
2
91
3
93
4
92
5
6
7
8
9
10
92
92
93
92
93
92
Media
92.3
DS
0.7327
CV
0.7938
$/3VX+LWDFKL
8/
11
93
12
91
13
92
14
92
15
92
16
17
18
19
20
92
92
92
93
94
5LSURGXFLELOLWj+LWDFKL
9DORULULVFRQWUDWL
95
94
93
92
91
90
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
QƒPLVXUD]LRQL
14
5HIORWURQ6SULQW
Questo test è stato ripetuto 30 volte perché i risultati ottenuti dopo 20 misurazioni non
erano soddisfacenti. Per una mia maggiore sicurezza, ho pensato che fosse meglio
ripetere questo test più volte. Ho così potuto escludere un mio errore di pipettaggio.
$/3VX5HIORWURQ
6SULQW
8/
Canale
1
193
C1
2
189
C2
3
187
C3
4
188
C2
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
185
187
188
184
180
173
186
195
184
188
193
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
Media
16
188.77
DS
6.4256
CV
3.4040
$/3VX5HIORWURQ
6SULQW
8/
Canale
188
C2
17
183
C3
18
204
C1
19
192
C2
20
187
C3
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
190
184
196
195
185
187
198
185
186
203
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
C2
C3
C1
5LSURGXFLELOLWj5HIORWURQ3OXV
200
190
180
Serie1
170
160
29
27
25
23
QƒPLVXUD]LRQL
21
19
17
15
13
11
9
7
5
3
150
1
9DORULULVFRQWUDWL
210
15
7HVWSHULOIDWWRUHGLFRQYHUVLRQH
Il test è stato effettuato su 30 campioni. Nella tabella riassuntiva ho indicato, come
elemento di influenza sul valore normale della fosfatasi alcalina, anche l’età dei
pazienti, sui quali sono stati effettuati i prelievi. Per ogni campione sono stati registrati
due valori, soprattutto per verificare la precisione della misurazione e quindi per
lavorare su un valore medio. Si noti come con l’apparecchio Hitachi 912 i valori delle
misurazioni doppie sono molto simili, mentre la variabilità dei risultati con il Reflotron
Sprint è molto sensibile fino a una differenza di + 30 U/ L. Queste differenze stanno alla
base della necessità di trovare un fattore di conversione diverso, ma basato
sull’esperienza pratica, da quello fornito dal costruttore.
Hitachi 912
1° valore
Pazienti Età
(U/ L)
1
51
92
2
62
164
3
40
138
4
88
154
5
49
86
6
81
131
7
95
111
8
32
250
9
91
129
10
65
94
11
88
170
12
41
101
13
69
174
14
33
121
15
67
87
16
71
96
17
95
116
18
75
95
19
92
114
20
72
93
21
73
181
22
67
99
23
66
112
24
71
139
25
67
112
26
72
86
27
33
81
28
40
173
29
49
119
30
58
135
Media
125.1
2° valore
(U/ L)
94
167
140
155
87
132
111
256
131
96
176
107
180
128
92
100
121
98
119
96
186
102
116
144
115
89
83
161
124
139
128.2
Media
(U/ L)
93.0
165.5
139.0
154.5
86.5
131.5
111.0
253.0
130.0
95.0
173.0
104.0
177.0
124.5
89.5
98.0
118.5
96.5
116.5
94.5
183.5
100.5
114.0
141.5
113.5
87.5
82.0
167.0
121.5
137.0
Reflotron Sprint
1° valore
(U/ L)
212
404
274
316
245
280
215
509
256
228
321
215
321
225
189
217
241
197
248
232
450
204
216
253
223
240
177
291
236
271
263.5
2° valore
(U/ L)
211
419
257
305
244
262
218
527
277
233
331
204
331
217
159
204
236
193
241
220
443
197
207
261
218
231
182
293
246
288
261.8
Media
(U/ L)
211.5
411.5
265.5
310.5
244.5
271.0
216.5
518.0
266.5
230.5
326.0
209.5
326.0
221.0
174.0
210.5
238.5
195.0
244.5
226.0
446.5
200.5
211.5
257.0
220.5
235.5
179.5
292.0
241.0
279.5
16
Sulla base di questi dati è stato realizzato, con il software Method Validator (1999 by
Philip Marquis, Metz, Francia, [email protected]), il grafico della pagina seguente.
Con questo grafico è possibile determinare il fattore di conversione, che risulta essere
di . I risultati dell’apparecchio Reflotron Sprint sono quindi da dividere per il
fattore di conversione determinato per essere confrontabili con i valori ottenuti con
l’Hitachi 912.
17
600 Reflotron
500
400
300
200
100
0
0
Hitachi 912
100
200
300
400
500
600
&RQIURQWRIRVIDWDVLDOFDOLQD
Unweighted Deming regression N = 30
Slope : 2.177 [ 1.678 to 2.676 ]
Intercept : -12.96 [ -71.14 to 45.22 ]
18
'LVFXVVLRQH
La prima constatazione da fare è che la pipetta Eppendorf (32 mL), utilizzata nello
svolgersi dell’esperienza, è molto accurata e precisa. Ho potuto verificarlo con un
accurato controllo della calibrazione. L’errore di pipettaggio dovuto alla strumentazione
è praticamente da escludere17 (v. tabella a pagina 14) con un buon margine di
sicurezza. La media trovata è di 0.032 g e il coefficiente di variazione (CV) è 1.43 %,
l’errore è praticamente nullo.
Ho in seguito controllato la precisione degli apparecchi, facendo ripetutamente delle
misurazioni di un campione i cui valori erano conosciuti. Come si può vedere dalle
tabelle e dai grafici, Hitachi 912 è molto preciso (CV= 0.79%), mentre la stessa cosa
non si può dire del Reflotron Sprint (CV= 3.40%). Vi possono essere delle spiegazioni:
il Reflotron Sprint è un apparecchio manuale. Quindi tutte le volte che viene effettuata
una misurazione potrebbe essere presente un errore di pipettaggio da parte
dell’operatore, oppure un difetto della pipetta, oppure ancora un errore
dell’apparecchio stesso, che malgrado sia abbastanza nuovo (acquistato circa 2 anni
orsono) può presentare un’imprecisione intrinseca. Per questa ragione ho cercato di
curare al massimo la precisione e la concentrazione, in funzione della costanza del
modo d’uso, nel pipettare il campione.
Un’altra ragione dell’imprecisione” del Reflotron Sprint è da ricercare nel numero dei
canali di lettura, che sono tre. In un canale, piuttosto che in un altro, potrebbero
esserci dei problemi che finirebbero per far deviare il risultato apparso dal valore
effettivo del campione.
Grazie a questo primo test, ho potuto constatare che è necessario determinare un
fattore che semplifichi la comprensione dei risultati e che ne permetta una lettura più o
meno uniforme. Si tratta cioè di trovare un IDWWRUHGLFRQYHUVLRQH, per far sì che i
valori ottenuti ad Acquarossa, possano essere convertiti nei valori di Bellinzona e quindi
confrontati con quelli ottenuti con uno strumento diverso. Per estrapolare il fattore di
conversione ho quindi deciso di eseguire 30 analisi in doppio sia a Bellinzona (Hitachi
912) che ad Acquarossa (Reflotron Sprint). Per far questo ho utilizzato il metodo di
Deming18, che mi permette di vedere, grazie ad un grafico, qual è il fattore risultante,
che posso perciò utilizzare con un buon margine di sicurezza. Questo fattore verrà
utilizzato dal laboratorio di Acquarossa. Naturalmente, come previsto negli obiettivi del
mio lavoro, il fattore di conversione può essere applicato unicamente alla
determinazione della fosfatasi alcalina. In futuro verranno poi eseguiti i test per trovare
i fattori di conversione di tutte le analisi che vengono eseguite con il Reflotron Sprint.
L’applicazione del fattore di conversione dovrebbe facilitare i medici a meglio
comprendere i valori di laboratorio e quindi a elaborare delle diagnosi corrette, sulla
base di valori che non devono prima di tutto essere rielaborati.
17
L’errore è possibile solo in caso di manipolazione imprecisa da parte, soprattutto, di personale non qualificato o poco
abituato all’uso della pipetta.
18
Si tratta di un metodo di analisi di dati applicati in ambito scientifico, anche detta analisi di regressione di Deming, in
casi analoghi a quello trattato in questo lavoro, quando cioè per un identico campione analizzato con due sistemi diversi
è necessario poter rendere i dati comparabili
19
Il fattore di conversione che ho trovato per la fosfatasi alcalina è di 2.18 (2,177 per la
precisione). Questo significa che per confrontare i valori di Acquarossa con i valori di
Bellinzona bisognerà dividere il valore ottenuto con il Reflotron Sprint ad Acquarossa
per il fattore di conversione. Al contrario i valori ottenuti a Bellinzona, per essere
paragonabili a quelli di Acquarossa, dovranno essere moltiplicati per il fattore di
conversione.
Questo fattore verrà, molto probabilmente, inserito nel sistema informatico19
dell’EOLAB.
19
Cortex Quality Software
20
&RQFOXVLRQL
Dunque l’ipotesi iniziale è stata confermata. È cioè possibile trovare un fattore di
conversione che permetta il confronto tra sue sistemi analitici differenti e quindi
rendere i risultati ottenuti con un sistema confrontabili a quelli ottenuti con un altro
sistema.
Il lavoro svolto per giungere a questo risultato non è stato facile. Prima di tutto, come
già illustrato nei capitoli precedenti, la precisione di un sistema e la relativa
“imprecisione” dell’altro rendono le analisi non semplici. Inoltre riuscire a garantire le
condizioni ottimali di analisi non è scontato. La disponibilità di campioni, il loro
trasporto, la disponibilità dei sistemi analitici, l’abitudine a lavorare con uno piuttosto
che con l’altro, la tensione determinata dalla necessità di procedere con la maggior
cura possibile al pipettaggio (per esempio), per evitare ogni possibile fonte di minimo
errore hanno reso il lavoro nel contempo impegnativo e molto istruttivo.
Ciò che più di ogni altra cosa ritengo importante nel lavoro svolto è di essere riuscita a
dimostrare la necessità di rendere le analisi confrontabili. Mi sono resa conto che era
importante poter dare ai medici un supporto uniforme e soprattutto penso che sia
importante ripetere questa esperienza con tutte le altre analisi che vengono svolte dai
due sistemi. Analogamente credo che per altre analisi svolte da altri apparecchi esista
lo stesso problema.
Purtroppo non è sufficiente affidarsi ai valori indicati dai fornitori, occorre verificare con
esperienze la possibilità di determinare questi fattori di conversione. Infatti per valori
normali (fino a 265 U/ L il valore è considerato nella norma per analisi fatte ad
Acquarossa) il fornitore dà un fattore di conversione di 2.05. L’esperienza dimostra che
il fattore di conversione è diverso, in modo sensibile (+ 6.34%). Per la qualità delle
diagnosi è necessaria una maggiore accuratezza nelle analisi. Applicando il fattore di
conversione da me stabilito il valore normale calcolato sarebbe di 281,80, cioè
patologico. Mi sono chiesta come mai questi fattori segnalati dai fornitori non siano
sufficientemente corretti. Volendo provare a dare una risposta, che dovrebbe essere
però verificata, credo che i motivi possano essere:
- l’”invecchiamento” dell’apparecchio
- il fatto che il valore determinato dal fornitore sia stato determinato in condizioni
ottimali e non di laboratorio (un solo operatore, temperatura costante, procedura
con campioni preparati in modo ottimale e standardizzati, ecc.)
- l’evoluzione tecnologica.
21
5LQJUD]LDPHQWL
Desidero ringraziare, al termine di questo lavoro:
- il signor Luigi Fraschini, che mi ha sostenuto nel corso di tutto il periodo, leggendo e
correggendo le diverse versioni che gli ho consegnato e stimolandomi al rigore
scientifico
- il signor Roberto Francesconi, capo Laboratorio a Bellinzona, per il tempo messomi a
disposizione e per gli utili consigli
- il signor Alberto Dellamora, perito chimico presso il Laboratorio di Bellinzona che mi
ha spiegato con dovizia di particolari l’apparecchio Hitachi 912
- le signore Michela Lomazzi e Pamela Vigilante, laboratoriste, che mi hanno aiutato nel
lavoro pratico sia a Bellinzona, che ad Acquarossa
- tutto il personale dei Laboratori di Bellinzona e di Acquarossa per il sostegno
- il signor Andrea Boffini, le signore Daniela Marcacci e Sonja Marci, della Scuola
cantonale superiore medico-tecnica, per l’aiuto nell’allestimento del testo.
22
%LEOLRJUDILD
ALP, Foglietto illustrativo, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim (D), 5-2001
Constance Cepko, Elizabeth Ryder, Donna M. Fekete, and Suzanne Bruhn, Harvard
Medical School and the Howard Hughes Medical Institute Boston, MA 02115 DETECTION OF ß-GALACTOSIDASE AND ALKALINE PHOSPHATASE ACTIVITIES IN
TISSUE - http:/ / axon.med.harvard.edu/ ~ cepko/ protocol/ xgalplap-stain.htm
Cortex Quality Software, Manuale d'
istruzione per Lab/ 400, capitolo 2.1
Eppendorf-Netheler – Hinz GmbH, Hamburg
Eppendorf-Netheler – Hinz, Amburgo: http:/ / www.eppendorf.com/ en/ index.php
Laboratorio di analisi chimiche Brusca, Roma, http:/ / web.tiscali.it/ labanalisibrusca/
Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) - Protein Data Bank http:/ / www.rcsb.org/ pdb/
Roche Diagnostics – Laboratorio – Prodotti: http:/ / roche-diagnostics.it/
prodotti/ Laboratorio/
23
Chiara Silacci, FLM3
may, 2004
24
,QGH[
1. Introduction
1.1
1.2
Why this topic?
History of the disease
2. What is Paget’s Disease?
3. What caused Paget’s Disease?
4. Who is affected?
5. Symptoms
6. Diagnosis
7. Alkaline Phosphatase
8. Treatment
9. Exercise and diet
10. Bibliography
25
,QWURGXFWLRQ
1.1
Why this topic?
I have choose this topic, because in my diploma work, I speak about the alkaline
phosphatase, an enzyme that in the Paget’s disease is elevated. My diploma work is
not easy to explain, it is to technical. So I choose to explain a disease, where the
alkaline phosphatase is increase.
1.2
History of Paget’s Disease
Paget’s Disease was recognized by Sir James Paget approximately 100 years ago.
Initially it was a rather mysterious disease, which caused a variety of deformities as
well as fractures.
This is a collage of pictures from Sir James Paget paper on osteitis deformans published in 1876. The condition is characterized by
uncontrolled osteoclastic bone resorption coupled with increased bone formation. The net result is an increase in bone mass that is
functionally and structurally defective bone.
26
:KDWLV3DJHW¶V'LVHDVH"
The bones commonly affected by Paget’s disease.
Paget’s disease is a disease of the bones. I t is a
chronic disorder and typically produces deformities
and enlargement of the bones due to the excessive
bone breakdown and also bone formation. It creates
density of the bone and makes the bone rather
fragile and tender. Clinically, this disease can create
severe pain, followed by deformities and sometimes
fractures. Almost every bone of the body can be
involved. The major part of the involvement
concentrates and localizes on the long bones; thibia
(shin bone), femur (the thigh bone) and pelvic
bones, skull and spinal column. When the skull is
involved, the patient may experience difficulties with
vision and the nerves of the eyes are affected. Also,
when the neural canal bones of hearing are
involved, the tightness of canal will also create nerve
deafness and loss of hearing results. This can
involve both side and both ears or can involve only
one. It is said that Beethoven, the great musician,
had Paget’s disease which involved his skull and also
his neural canal of hearing and he came deaf.
While the skull is showing the involvement of Paget’s disease, the effect of that can
also be observed on the facial bones and disturbances of the chewing mechanism may
occur when the disease affect the teeth in the upper and lower jaws.
A severe case of Paget’s disease which has caused the right leg to become bowed.
27
:KDWFDXVHG3DJHW¶V'LVHDVH"
A possible slow virus infection of the bone way be the cause. Also, others factors such
as hereditary appears strong since Paget’s disease has been seen in different members
of a family. The hereditary factor may lead to susceptibility among family members.
Isolation of this slow virus and exact nature has not been totally understood or
explained. Research is still being done on this subject. In regard to Paget’s being in
families, it is suggested that after the age of 40, it may be advisable for the siblings
and children of a person with Paget’s disease to have a standard blood test checking
for alkaline phosphatase (an enzyme produced by bone cells) done every two or three
years. If the blood levels of this chemical are high, further tests such as bone scanning
and other tests in regards to the urine need to be initiated.
:KRLVDIIHFWHG"
Paget’s disease is rarely diagnosed in people under 40 years of age. Men and women
are affected equally. Prevalence of Paget’s disease ranges from 1.5 to 8 percent
depending on age and country of residence. Prevalence of familial Paget’s disease
(where more than one family member has the disease) ranges from 10 to 40 percent
in different parts of the world. Because early diagnosis and treatment is important,
after age 40, siblings and children of someone with Paget’s disease may wish to have
an alkaline phosphatase blood test every 2 or 3 years. If the alkaline phosphatase level
is above normal, other tests such as a bone-specific alkaline phosphatase test, bone
scan, or x-ray can be performed.
6\PSWRPV
Many patients do not know they have Paget’s disease because they have a mild case of
the disease with no symptoms. Sometimes, symptoms may be confused with those of
arthritis or other disorders. In other cases, the diagnosis is made only after
complications have developed. Symptoms can include:
œ
%RQHSDLQ: the most common symptom. Bone pain can occur in any bone
affected by Paget’s disease. It often localizes to areas adjacent to the joints.
œ
+HDGDFKHVDQGKHDULQJORVV: may occur when Paget’s disease affects the
skull.
œ
3UHVVXUHRQQHUYHV: may occur when Paget’s disease affects the skull or the
spine.
œ
,QFUHDVHGKHDGVL]HERZLQJRIOLPERUFXUYDWXUHRIVSLQH: may occur in
advanced cases.
28
œ
+LSSDLQ: may occur when Paget’s disease affect the pelvis or thighbone.
œ
'DPDJHWRFDUWLODJHRIMRLQ: may lead to arthritis.
'LDJQRVLV
Paget’s disease may be diagnosed using one or more of the following test:
œ
;UD\V: Pagetic bone has a characteristic appearance on x-rays.
œ
$ONDOLQHSKRVSKDWDVHEORRGWHVW: An elevated level of alkaline
phosphatase in the blood can be suggestive of Paget’s disease
œ
%RQHVFDQ: Useful in determining the extent and the activity of the
condition. If a bone scan suggests Paget’s disease, the affected bone(s)
should be x-rayed to confirm the diagnosis.
The structure of normal bone. This diagram shows a cross section through part of the thigh bone (femur).
29
$ONDOLQHSKRVSKDWDVH
Alkaline phosphatase is an enzyme found
throughout the body. Like all enzymes, it
is needed, in small amounts, to trigger
specific chemical reactions.
When it is present in large amounts, it
may signify bone or liver disease or a
tumor. Medical testing of alkaline
phosphatase is concerned with the
enzyme that is found in liver, bone,
placenta, and intestine.
In a healthy liver, fluid containing
alkaline phosphate and other substances
is continually drained away through the
bile duct. In a diseased liver, this bile
duct is often blocked, keeping fluid within the liver. Alkaline phosphatase accumulates
and eventually escapes into the bloodstream.
The alkaline phosphatase of the liver is produced by the cells lining the small bile
ducts (ductoles) in the liver. Its origin differs from that of other enzymes called
aminotransferases. If the liver disease is primarily of an obstructive nature
(cholestatic), i.e. involving the biliary drainage system, the alkaline phosphatase will be
the first and foremost enzyme elevation. If, on the other hand, the disease is primarily
of the liver cells (hepatocytes), the aminotransferases will rise prominently.
Thus, these enzymes are very useful in distinguishing the type of liver disease- cholestatic or hepatocellular. Growing bones need alkaline phosphatase. Any condition
of bone growth will cause alkaline phosphatase levels to rise. The condition may be
normal, such as a childhood growth spurt or the healing of a broken bone; or the
condition may be a disease, such as bone cancer, Paget’s disease, or rickets.
During pregnancy, alkaline phosphatase is made by the placenta and leaks into the
mother’s bloodstream. This is normal. Some tumors, however, start production of the
same kind of alkaline phosphatase produced by the placenta. These tumors are called
germ cell tumors and include testicular cancer and certain brain tumors.
Alkaline phosphatase from the intestine is increased in a person with inflammatory
bowel disease, such as ulcerative colitis.
30
7UHDWPHQW
Paracetamol and/ or non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) help the pain in
some people although they may not always be very helpful or effective. Simple
physical measures are sometimes useful. For example, in a case where one leg has
effectively been shortened because the thigh and shin bones have grown curved, a
built-up insole in the shoe can make a great difference to the feeling of “lopsidedness”. Once the diagnosis has been made, most patients will be referred to a
specialist clinic for assessment and treatment. There is a choice of 3 main forms of
treatment.
Etidronate (“Didronel”)
Etidronate is a bisphosphonate drug – one of the earlier ones of this type produced. I t
is taken by mouth in courses of up to 6 months. There are usually no side effects,
although minor stomach upsets can occur. One course of etidronate can sometimes
start a remission in the disease for up to several years. If it is taken in a high dose for
too long etidronate can further weaken the bone. However, if you are prescribed this
drug your doctor will be aware of this risk and pay special attention to it.
Newer bisphosphonates
Newer, more powerful bisphosphonates have now been developed which act without
the risk of weakening the bone. Pamidronate is the most widely udes of these.
Pamidronate has to be given as an injection, either as a series of 6 weekly injections
or, more usually, as a series of 3 injections given at intervals of 2 weeks. Some doctors
give an additional reduced dose before the series of 3 full doses. Such courses can be
repeated if necessary. The pain in the bone is often relieved and sometimes more
quickly than this. Pamidronate is well tolerated and side-effects are usually mild and do
not require treatment.
Tiludronate and risedronate are alternatives, effective treatments. Both these drugs
can be taken by mouth.
Calcitonin
Calcitonin in an hormone which is produced naturally from glands in the neck. Large
doses have been found to reduce the turnover of bone cells and reduce the pain in
Paget’s disease. However, at present it is only available by injection (although it may
become available as a nasal spray in the future). Many patients learn to give their own
injections and have intermittent courses of calcitonin for up a year. Calcitonin has no
serious side effects but can often cause relatively minor side effects such as a flushed
face, nausea, vomiting and diarrhoea.
31
([HUFLVHDQGGLHW
In general, patients with Paget’s disease should receive 1000-1500 mg of calcium,
adequate sunshine, and at least 400 units of vitamins D daily. This is especially
important in patients being treated with bisphosphonates. Patients with a history of
kidney stones should discuss calcium and vitamin D intake with their physician.
Exercise is very important in maintaining skeletal health, avoiding weight gain, and
maintaining joint mobility. Since undue stress on affected bones should be avoided,
patients should discuss any exercise program with their physician before beginning.
%LEOLRJUDSK\
1. http:/ / www.osteo.org/ pdibone.html
2. http:/ / www.aanos.org/ edctn_paget.htm
3. http:/ / www.arc.org.uk/ about_arth/ booklets/ 6031/ 6031.htm
32