SCHIZOMICETI BATTERI • Microrganismi unicellulari, più piccoli complessi, capaci di autoreplicazione ( ca 1µ) e meno – Thiomargarita nabimiensis 10-300 µm • Procarioti • DNA ed RNA • Parete batterica eccetto micoplasmi e batteri che vivono in habitat ad alta conc salina • • • • Replicazione per scissione binaria Molto abbondanti in natura cicli biologici Per lo più autonomi Simbiosi con altre forme di vita – parassiti facoltativi, parassiti obbligati • patogeni (virulenza e patogenicità) 1 Metodi di studio in microbiologia Tradizionali visualizzazione microscopia • Gram, Ziehl-Neelsen forma, dimensioni, disposizione, caratteristiche tintoriali • IF forma, dimensioni, disposizione, sede intracellulare, identificazione coltivazione • terreni artificiali in vitro – agarizzati colonie coltura pura – brodi sospensione cellulare • in vivo (animali, da esperimento, colture cellulari) analisi antigene Innovativi metodiche biomolecolari • analisi proteine, lipidi, acidi nucleici 2 Batteri colorazione di Gram Gram pos blu-violetto Gram neg rossi 3 Batteri • Eccetto se parassiti obbligati, si possono coltivare su terreni artificiali, solidi o liquidi • esigenze nutrizionali • temperatura ottimale • tensione O2 • aerobiosi, microaerofilia, anaerobiosi 4 Anaerobi Batteri incapaci di svolgere in presenza di ossigeno i processi catabolici necessari alla produzione di energia, ATP, da utilizzare nelle reazioni anaboliche, biosintetiche Meccanismi molteplici • Catalasi • scindono perossidi formati in presenza di ossigeno • Superossido-dismutasi • protezione dall’azione nociva del radicale superossido libero Stretti -O2 0.5%- e meno stretti -O2 2-8%- Gram pos Clostridium Gram neg Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Treponema, … 5 Schema di cellula procariota 6 Batteri Il citoplasma batterico spicca per l’alta concentrazione salina • Salvo eccezioni, i batteri si trovano in ambiente ipo-osmotico richiamo di acqua lisi osmotica I batteri devono resistere alla lisi osmotica 7 Batteri Membrana citoplasmatica • Simile per struttura e funzioni alla membrana delle cellule eucariotiche • barriera di permeabilità • trasporto di soluti • Assenza di steroli • Maggior contenuto proteico • proteine non glicosilate • Sede di funzioni appannaggio, nella cellula eucariotica, di organuli intracitoplasmatici • sistema trasporto elettroni 8 Strutture ACCESSORIE Capsula [strato mucoso] protezione Appendici filiformi • Pili, Fimbrie adesività • Ciglia, flagelli, filamenti assiali [o endoflagelli] movimento Granuli 9 Capsule e strati mucosi • Esterni alla parete • ben strutturati: capsula • non ben strutturati: strato mucoso, glycocalix • Polimerici, per lo più polisaccaridici • talvolta poliaminoacidici (non proteine) • Tendenza a essere persi nei passaggi in coltura • Importanti se fattori di virulenza • Antigeni anticorpi protettivi 10 Pili (fimbrie) Proiezioni filiformi dalla superficie •Pili sessuali •coniugazione ricombinazione genetica •Adesine •importanti se fattori di virulenza •antigeni anticorpi protettivi 11 Parete batterica Involucro rigido al di sopra della membrana citoplasmatica • Anti lisi osmotica • Forma • Bastoncini, cocchi, a virgola, a spirale • Caratteristiche tintoriali • Gram, alcool-acido resistenza • Virulenza e patogenicità • Sede di antigeni 12 Peptidoglicano o Mureina componente strutturale della parete • singola macromolecola • lunghissimo polimero lineare, stabilizzato da fitti legami trasversi • avvolge la cellula, formando un astuccio rigido e resistente determina la forma impedisce il rigonfiamento 13 Peptidoglicano o Mureina Il monomero •Due aminozuccheri (NAM e NAG) legati da legame glucosidico •Polipeptide (4 o5 aa) legato al NAM 14 Peptidoglicano o Mureina 15 Peptidoglicano Sintesi 16 Peptidoglicano Sintesi 17 Peptidoglicano Sintesi 18 Parete batterica La parete batterica nella sua componente del peptidoglicano costituisce il bersaglio di molti antibiotici • Tali antibiotici agiscono impedendo la sintesi del peptidoglicano • Antibiotici diversi agiscono su momenti diversi del processo sintetico •assemblaggio finale transpeptidizzazione •passaggio trans-membrana •sintesi del monomero 19 Parete Gram neg e Gram pos 20 VIRULENZA probabilità che • si instauri il rapporto infettivo PATOGENICITA’ probabilità che • si instauri la malattia 21 Virulenza caratteristica propria e qualificante degli agenti di infezione in quanto tali Capacità di superare le difese dell’ospite Probabilità che si instauri il rapporto infettivo •Variabile estrinseca o relativa –dipende dall’ospite che si considera •Variabile quantitativa –misurabile Dose Infettante 50 •Generalmente multifattoriale –fattori di virulenza cellulari o solubili –antigeni risposta protettiva •Correlata alla patogenicità 22 Fattori di virulenza • Adesine (pili o fimbrie, capsule) • Fattori antifagocitari – uccisione del fagocita (leucocidine) – evasione (capsula) – resistenza al killing intrafagocitario Immunità innata • Invasine • Proteine chelanti il Fe (IBP), siderofori • Fattori istotossici (proteasi) • …… • sIgA proteasi • Mimetismo e variabilità antigene acquisita 23 Patogenicità Capacità di provocare il danno Probabilità che si instauri la malattia • Variabile estrinseca o relativa – dipende dall’ospite che si considera • Variabile quantitativa – misurabile Dose 50 • Generalmente multifattoriale – fattori di patogenicità cellulari o solubili – antigeni risposta protettiva • Non strettamente correlata alla virulenza 24 Patogenesi Replicazione intensa • risposta flogistica Tossicità • mediatori della flogosi • alterazioni funzionali Terapia Prevenzione – sintesi proteica – rilascio neurotrasmettitori – equilibrio idrico 25 Patogenicità microbica prevalentemente, ma non esclusivamente, infettiva Patogenicità svincolata dalla virulenza • alcuni agenti producono delle tossine così potenti che il danno e la patologia possono essere forti e gravi anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo o di reazione infiammatoria • tetano; botulismo classico; colera patologia anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo 26 Fattori di patogenicità classicamente rappresentati dalle esotossine • • • • • tossine rilasciate da Gram pos e Gram neg proteiche buoni immunogeni Vaccini specie-specifiche tossine binarie, citolisine, superantigeni Sieri alcune molto potenti endotossina componente membrana esterna Gram neg • LPS • non buon immunogeno • non specie-specifico • tossicità indiretta rilascio di mediatori cellulari • non molto potente 27 Esotossine • c-AMP alterazione contenuto intracellulare – tossina colerica diarrea – tossina pertussica • Sintesi proteica inibizione – tossina difterica • Citoscheletro alterazioni funzioni – tossina C.difficile • Rilascio di neurotrasmettitori interferenza – tossina tetanica paralisi spastica – tossina botulinica paralisi flaccida • Superficie cellulare – Citolisine • Linfociti T attivazione policlonale – superantigeni stafilococcici 28 LPS endotossina 29 Patogenicità microbica prevalentemente, ma non esclusivamente, infettiva Patogenicità svincolata dalla virulenza • alcuni agenti producono delle tossine così potenti che il danno e la patologia possono essere forti e gravi anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo o di reazione infiammatoria • tetano; botulismo classico; colera patologia anche se il germe è poco virulento, o addirittura in mancanza di rapporto infettivo 30 Disinfectant Selection Table Compound Chlorine IodineIodophor Chlorhexidine Alcohol Oxidizing Phenol 0.01-5% 0.01-5% 0.05-0.5% 0.2-3% 0.1-2% 1-2% Examples Clorox Tincture /Provodine Novalsan VikronS Lysol Roccal-D Wavicide Bactericidal Good Good Very Good Good Good Good Good Very Good Bacterial Spores Fair Fair Poor Fair Fair-Good Poor Poor Good Very Good Good Very Good Good Good Fair Fair Very Good Enveloped Viruses Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Non-Enveloped Viruses Yes Yes No No Yes No No Yes Fungicidal Good Good Fair to Good Fair Fair Good Fair Good Effective in Organic Matter Poor Fair Fair Fair Poor Good Fair Good Inactivated by soap No No&Yes No No No No Yes No Effective in Hard water Yes No Yes Yes Yes Yes No Yes Contact Time (minutes) 5 - 30 10 - 30 5 - 10 10 - 30 10-600 Residual activity Poor Poor Good Viricidal 70-95% 0.2-3% 10 - 30 10 - 30 10 - 30 Fair Poor Poor Quaternary NH4 Aldehyde Fair 31 Fair La spora batterica •Citoplasma povero di H2O •Dipicolinato di Calcio •Rivestimenti costituiti da proteine ricche in legami disulfidrici 32 La spora batterica • Forma di resistenza – temperature estreme – agenti chimico-fisici di disinfezione – mancanza di acqua • Metabolicamente inattiva • Differenziazione della cellula batterica • Caratteristica di alcuni generi – Bacillus, Clostridium • Non legata alla replicazione batterica – cellula vegetativa spora cellula vegetativa • La spora infetta non in quanto tale deve ritornare a cellula vegetativa 33 Cinetica di sviluppo di una popolazione batterica Conta batterica Concentrazione Cellule totali batterica • camera contaglobuli rispetto al tempo • stime correlate col numero di cellule 1. Trapianto in terreni liquido 2. A tempi diversi aliquota fissa 3. Conta – concentrazione proteica – turbidimetria • proprietà ottiche delle sospensioni e loro dipendenza dal numero di particelle Cellule vive • subcoltivazione in agar conta colonie una colonia una cellula34 Fasi della crescita batterica • Latenza – numero costante – attività di sintesienzimi per utilizzazione terreno • enzimi costitutivi/adattativi • Crescita logaritmica – aumento esponenziale – attività sintetica al max • Stasi – numero costante o in diminuizione – esaurimento fattore limitante lo sviluppo • conte totali vs conte vitali Differenze fisiologiche in rapporto alla fase di sviluppo sensibilità agli antibiotici, ai fagi; …. 35 infezione acuta vs infezione cronica Specie batterica: insieme di ceppi con alcune caratteristiche a comune che li differenziano da altri ceppi Tipo Specie Genere Famiglia Ordine Classe Philum Regno Denominazione linneiana Genere e specie • • • • • • Escherichia coli Treponema pallidum, Treponema denticola Clostridium tetani, Clostridium botulinum Streptococcus pyogenes, Streptococcus mutans Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis Helicobacter pylori Differenze al di sotto della specie tipi • • • E.coli O157H7 Str. pyogenes M12 Str. mutans c 36 I farmaci antibatterici Prodotti naturali di miceti o batteri, antibiotici (competizione vitale) o composti sintetici, chemioterapici • che uccidono [battericidi] o inibiscono [batteriostatici] la crescita dei batteri • MBC Concentrazione Minima Battericida • MIC Concentrazione Minima Inibente 37 I farmaci antibatterici bersaglio e meccanismi azione Acidi nucleici • sintesi precursori acidi folici sulfamidici, trimethroprim • sintesi DNA novobiocina, chinolonici, metronidazolo • sintesi RNA rifampicina Parete • sintesi peptiglicano – sintesi dei precursori cicloserina – passaggio trans-membrana bacitracina ristocetina – assemblaggio –lattamici, vancomicina • sintesi composti tipici dei micobatteri – acidi micolici isoniazide – arabinogalattano etanbutolo Sintesi proteica – subunità 30S aminoglicosidi, tetracicline – subunità 50S macrolidi, cloramfenicolo – fattori extraribosomiali acido fusidico Membrana membrana esterna Gram neg • disorganizzazione polimixine 38 I farmaci antibatterici farmaco-resistenza Resistenza innata o intrinseca • • caratteristica di un gruppo, specie, genere nota a priori Meccanismi • assenza del bersaglio – lattamici, altri micoplasmi • ostacolo alla entrata nella cellula batterica – aminoglicosidi O2-dipendente anaerobi – vancomicina gram-neg • non attivazione nella cellula batterica – metronidazolo aerobi Resistenza estrinseca o acquisita • cambiamento del genoma • pochi ceppi di un gruppo, specie, genere selezione non nota a priori sotto i nostri occhi • – evoluzione Meccanismi • sul batterio – modificazione del bersaglio – impedimento al raggiungimento del bersaglio – aumento dell’efflusso • sul farmaco – modificazione enzimatica – distruzione enzimatica 39 I farmaci antibatterici Antibiogramma • saggio in vitro per guidare la terapia antibatterica • il ceppo isolato viene saggiato contro un pannello di antibiotici – verranno non impiegati quello/quei farmaci verso i quali si ha resistenza – per gli altri si sceglierà quello più adatto • • • • sede di infezione e farmacocinetica condizioni del soggetto costo tossicità 40 Antibiogramma - M. diffusione in piastra Sensibile Multiresistente 41 Adattabilità ad un nuovo ambiente • • ambiente inanimato ambiente animato sedi diverse nell’ospite Regolazione • Sequenza DNA – amplificazione del gene – riarrangiamento del gene espressione coordinata dei fattori di virulenza e • Trascrizione patogenicità – attivatori – repressori • controllata da fattori ambientali • Post-trascrizione – temperatura, fonti carbonio, osmolatrità, conc Fe, nutrienti … – modificazione covalente – clivaggio proteolitico – legame a proteine della cellula ospite 42 Genoma batterico informazione replicazione sincrona con divisione cellulare • Cromosoma unico e Unità genetiche accessorie (plasmidi) – assenza di istoni – unità trascrizionali multicistroniche – quasi tutta la sequenza per • codificazione proteine • regolazione trascrizione • Aploidia – espressione fenotipica immediata di un qualsiasi cambiamento – controllo • attivazione/disattivazione promoters 43 Batteri Plasmidi • DNA extracromosomico • copie multiple • informazione per • fattori di virulenza & patogenicità • antibiotico-resistenza…. • trasferibili • coniugazione batterica 44 Adattabilità variazioni fenotipiche • tutta la popolazione si adatta fisiologicamente al nuovo ambiente nell’ambito del potenziale genomico – cambia il fenotipo non il genotipo espressione del gene/i variazioni genotipiche • la cellula mutata viene selezionata perché meglio si adatta all’ambiente – mutazione – ricombinazione • trasformazione, coniugazione, transduzione elementi genetici di trasposizione 45
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