corso di Genomica a.a. 2010-2011
lezione 29-30
• laurea magistrale Biotecnologia
Industriale
Giovedì 20 Gennaio 2011
aula 6A
orario : Martedì ore 14.00 - 16.00
Giovedì ore 13.00 - 15.00
Esami: 24 Febbraio, 3 Marzo, 23 Marzo
Lezioni fino al 10 Febbraio
D. Frezza
La immunoprecipitazione
Procedura di base per isolare una proteina tramite il suo
anticorpo,
È un metodo di purificazione quando la proteina che si cerca
non è molto abbondante
È un metodo per isolare complessi proteici quando non si
conoscono gli altri componenti ma solo quello di cui abbiamo
l’anticorpo
Si usa per co-precipitare complessi che si formano anche
con acidi nucleici
procedura della Imm.precipitaz.
L'immunoprecipitazione è quel fenomeno che si verifica in una soluzione in cui si ha la
concomitante presenza di antigene/i (formati da uno o più determinanti antigenici) e di
anticorpi (Ig) diretti contro di essi. Se si hanno questi presupposti, si avrà la possibilità di
ottenere la formazioni di aggregati antigene-anticorpo (Ag-Ig) multpli, che però non portano
obbligatoriamente ad un'immunoprecipitazione. Infatti se l'Ag o l'Ig sono troppo diluiti (cioè
hanno un rapporto di concentrazione che si discosta troppo dall'unità), questo fenomeno
non si verifica. In questi casi avremo o un eccesso di Ig, o di Ag che non permetteranno la
formazione di un aggregato abbastanza grande, che non avrà le dimensioni adatte alla
precipitazione.
L'immunoprecipitazione avviene solo quando si forma un reticolo di Ag-Ig insolubile al punto
di equivalenza. In altre parole l'immunoprecipitazione avviene solo a concentrazioni ottimali
dei reagenti, ovvero quelle condizioni in cui non abbiamo né una sovrabbondanza di Ag (ciò
provocherebbe una condizione in cui avremmo solo anticorpi circondati da antigene), né un
eccesso di Ig (in questo caso avremmo molecole di antigene completamente circondate da
anticorpi).
A ciò va aggiunto che, poiché quando parliamo di anticorpi parliamo di proteine, dobbiamo
tener conto dell'importanza del ruolo che svolgono temperatura, PH ed affinità nel fenomeno
dell'immunoprecipitazione. Generalmente la reazione di precipitazione avviene in due fasi:
prima si ha la formazione di molti complessi Ag-Ig solubili (reazione rapida), in seguito si
verifica l'aggregazione di questi micro-complessi per arrivare alla formazione di un
aggregato reticolare più grande, insolubile e visibile nel precipitato (reazione più lenta).
1° schema ChIP
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2° schema ChIP
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3° schema di ChIP
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4° schema
ChIP
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5° schema ChIP
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6° schema ChIP
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Metodo ChiP on Chip
Briefly describe the Chromatin immunoprecipitation (ChIP)-chip and ChIP-PET (paired-end ditag)
methods.
Chromatin immunoprecipitation methodology (ChIP) allows the identification of the sites in a
genome that are occupied in vivo by a gene regulatory protein. The principle underpinning this
assay is that DNA-bound proteins (including transcription factors) in living cells can be cross-linked
to the chromatin on which they are situated. Following fixation, the cells are lysed and the DNA is
broken into pieces 0.2-1 kb in length by sonication. Once the proteins are immobilized on the
chromatin and the chromatin is fragmented, whole protein-DNA complexes can be
immunoprecipitated using an antibody specific for the protein in question. The DNA from the
isolated protein/DNA fraction can then be purified. The identity of the DNA can then be determined
by PCR.
By using a ChIP-chip, the methods of chromatin immunprecipitation and microarray are combined.
Therefor the identification of binding-sites of DNA-binding proteins can be made in a much larger
scale and more efficient way (up tp 3.5 mio probes).
The DNA-microarrays can either comprise cDNA or PCR-products, artificial oligonucleotides or
oligonucleotides that are synthesized in situ.
ChIP-chip experiments can be divided in three major steps (http://en.wikipedia.org/wiki/ChIP-onchip):
1. Setting up a biological question
2. Wet-lab protion of the workflow
First of all, the ChIP is undertaken and the identified DNA-sequences are purified. The fragments
are then poured over the surface of the DNA microarray which is spotted with short, single-stranded
sequences that cover the genomic portion of interest. Whenever a labeled fragment "finds" a
complementary fragment on the array, they will hybridize and form again a double-stranded DNA
fragment.
Figura metodo ChIP on Chip
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Metodo 4C
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diagramma di flusso per l’analisi
ChiA PET (pair end tag)
l’architettura del metodo prevede 6 moduli
- filtro dei linkers
- mappaggio dei PETs
- classificazione dei PETs
- confronto dei “binding sites”
- confronto dei siti di interazione della cromatina
- visualizzazione dei ChiA PET
modulo di filtraggio linkers
si separano le sequenze con i linkers dei PET con il barcode
(seq con barcodes non leggibili vanno tra gli ambigui)
PETs buoni sono divisi per evere i linkers AA,BB ed AB
modulo mappaggio dei PETs
le sequenze PET sono mappate in corrispondenza alla
sequenza di riferimento
Riconoscimento dei PETs secondo la lunghezza genomica
della localizzazione dei due tags: dimensione corta con
legame intramolecolare, dimensione lunga con legame
intermolecolare.
- Intramolecolare identifica siti di legame del fattore
- intermolecolare identifica siti di interazione della cromatina