Multicolor labeling - CGH
Lezione 2
By NA
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Aberrazioni numeriche
Aberrazioni strutturali
traslocazioni, inserzioni
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Il primo esperimento di FISH multicolore è stato descritto nel 1992 da
Ried e coll. con l’impiego delle sette combinazioni ottenibili miscelando
tre differenti fluorocromi, FITC, TRITC e IR680, per marcare fino a
sette sonde genomiche.
Sistema combinatoriale:
n=3 fluorocromi
2n-1=7 combinazioni
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MARCATURA COMBINATORIALE
RAPPORTO DI MARCATURA (percentuali diverse di fluorocromi)
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• M- FISH: multiplex FISH, 5 fluorocromi (Speicher et al 1996);
SKY: Spectral karyotyping FISH, 7 fluorocromi (Schrock et al 1996);
COBRA FISH: combinatorial binary ratio labelling, 4 fluorocromi
(Tanke et al 1999);
• Rx-FISH: rainbow cross species colour banding, cariotipo a bande
colorate (Muller et al 1997);
• MCB: multicolor banding con 24 cocktail di painting parziali per
pseudobandeggio (Chudoba et al 1999);
• cenM-FISH: multicolor FISH con 23 sonde centromeriche (Nietzel et al
2001);
• M-TEL: multicolor FISH con 41 sonde telomeriche (Brown et al 2000).
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M-FISH, SKY & COBRA
(Multiplex-FISH,
Spectral KarYotyping
& COmbined Binary RAtio labelling) :
finalità
•analisi simultanea di tutto il corredo cromosomico con un
approccio rapido (come le bandeggiature Q, G e R):
un singolo esperimento per lo studio dell’intero cariotipo;
•sistema affidabile di caratterizzazione simultanea di tutti
i riarrangiamenti cromosomici;
•strumento di screening per l’identificazione di nuovi
riarrangiamenti tumore-specifici e nuove regioni bersaglio.
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M-FISH, SKY & COBRA:
applicazioni
• Identificazione di cromosomi marker, ring, hsr e
double minutes;
• Corretta identificazione di traslocazioni quando il
pattern di bandeggiatura non è ottimale, o
in metafasi di scarsa qualità;
• Caratterizzazione di traslocazioni complesse.
• Identificazione di inserzioni cromosomiche.
• Individuazione di riarrangiamenti ‘criptici’.
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M-FISH, SKY & COBRA:
limiti
- Necessita’ di cellule in metafase con cromosomi non sovrapposti
perche’ possano essere rivelati riarrangiamenti(piccole
duplicazioni/delezioni, traslocazioni criptiche) che coinvolgono
regioni di dimensioni >3Mb
- Non e’ possibile evidenziare inversioni paracentriche ed alcune
pericentriche
- E’ difficile valutare la presenza di riarrangiamenti a carico dei
telomeri
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A = Rodamina
B = Texas Red
C = Cy 5
D = FITC
E = Cy 5.5
Esempio
Si ottiene così una specifica fluorescenza, o spettro, per ciascun cromosoma
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Sistema combinatoriale:
n=5 fluorocromi
2n-1=31 combinazioni
methodology
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M-FISH
Si ottiene infine l’immagine totale combinando le informazioni delle
acquisizioni effettuate con i sei filtri.
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Cariotipo con M-FISH
Cariotipo complesso
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Cariotipo con SKY
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Marker cromosomico
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Traslocazione complessa
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RATIO IMAGE
FIRST BINARY
IMAGE
conclusioni
M-FISH/SKY/COBRA
Vantaggi
Limiti
M-TEL-FISH
singolo esperimento
singolo esperimento
riarrangiamenti tra
più cromosomi
identificazione piccoli
marcatori (<17p)
due esperimenti
sequenziali
risoluzione:
riarrangiamenti
submicroscopici
telomerici
identificazione piccoli
marcatori (<17p)
riarrangiamenti tra
più cromosomi
riarrangiamenti
intracromosomici
risoluzione: 3Mb
marcatori con
neocentromeri o
privi di centromero
riarrangiamenti
intracromosomici
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cen-M-FISH
Conventional CGH
Test Genomic DNA
Reference
Cot-1 DNA
Genomic DNA
Normal
Tumour
gain
deletion
Position on Chromosome
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0.8
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1
1.2
RAPPORTO DI FLUORESCENZA VERDE/ROSSO
Software per l’analisi delle immagini digitali
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Small cell lung carcinoma
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Array CGH
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Northern Blot
G3PDH
Sequenza ibridatata su mRNA
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Espressione genica
Northern Blot
30,000 Geni
30,000 Northerns
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CGH su microarrays
Reference
Test Genomic DNA
Cot-1 DNA
(Tumour DNA)
gain
deletion
Position on Chromosome
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Genomic DNA
Position on Sequence
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Chip fabrication
Conditioni controllate, chips identici si possono comparare facilemente e
con precisione.
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SNP array
SNP
AA
AB
BB
1
2
3
5
*
6
7
*
*
*
*
Chromosome
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4
*
*
SNP array genoma maschile normale
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SNP array genoma esempio patologico?
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SNP array 3 delezioni?
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Condivisione genoma
genitore - figlio
1/2
fratelli 1/2
zio - nipote 1/4
cugini primi 1/8
cugini secondi 1/16
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Ricombinazione mitotica(MR)
Descritta in Drosophila da Curt Stern (1936)
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Ricombinazione mitotica(MR)
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Ricombinazione mitotica(MR)
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Ricombinazione
mitotica(MR)
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Ricombinazione mitotica(MR) origina una
popolazione a mosaico
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SNP array nei tumori
UPD segnalata in alcuni tumori:
Breast Cancer
Retinoblastoma
Ulveal melanoma
Wilms tumour
Myeloproliferative disorders (9p)
Haematopoietic malignancies
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SNP array AML
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SNP array AML
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+
+
UPD