Il piano nazionale e regionale di selezione genetica per la resistenza alle TSE ovine Marco Tamba Centro Emiliano-Romagnolo di Epidemiologia Veterinaria Ferrara, 11/11/05 Scopo della presentazione • Conoscere la “filosofia” del piano di selezione genetica per la resistenza alle TSE • Presentare il piano regionale (Del. 1356/04 del 12/07/04) • Presentare il piano nazionale (DM 17/12/2004) Focolai di scrapie in Italia: curva epidemica 1995-2005 50 attiva 45 211 focolai passiva 2 in corso di conferma 40 24 28 >87.000 animali coinvolti 24 35 30 13 25 19 20 14 15 13 15 21 9 10 10 8 10 5 1 1 1995 1996 0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Focolai di Scrapie denunciati in Emilia-Romagna (dati al 31/10/05) Dal 1991 ad oggi in Emilia-Romagna sono stati denunciati complessivamente 12 focolai di Scrapie. 6/9 province hanno registrato almeno un focolaio. 5 passiva 4 attiva 3 2 1 0 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Distribuzione geografica: (1995-2005) 16,3 It alia Incidenza di allevamenti colpiti Toscana 66,3 Emilia R. 40,5 incidenza cumulativa focolai/10.000 allevamenti 35,8 Sardegna 26,9 Sicilia 21,6 Puglia Marche 19,4 Lazio 19,1 Umbria 14,1 6,4 Piemont e Abruzzo 5,3 Basilicat a 4,8 3,8 Liguria Campania 3,7 Molise 2,7 Lombardia 0,0 (4) (4) (1) (2) (3) (3) (3) 16,1 Venet o Calabria >=25 >=15 <25 >=10 <15 >=5 <10 >=3 <5 <3 no focolai Ovini: 8,1 milioni* Caprini: 978 mila* INCIDENZA CUMULATIVA 1,6 N° Focolai / 10.000 allevamenti 1,1 10,0 20,0 30,0 40,0 *Dati Eurostat dicembre 2004 Obiettivi del piano Obiettivo generale del Piano è quello di incrementare la frequenza dei caratteri di resistenza genetica alle TSE nella popolazione ovina al fine di: a) contribuire alla tutela della salute umana ed animale; b) concorrere al controllo delle TSE degli ovini; c) concorrere alla creazione di aziende ovine a “basso rischio” di TSE. Obiettivi del piano Obiettivi specifici del piano sono: a) eliminazione dell’allele VRQ dagli allevamenti aderenti al piano; b) incremento della frequenza dell’allele ARR negli allevamenti aderenti al Piano. c) aumento della disponibilità di montoni con genotipo resistente (ARR/ARR), utili anche per il ripopolamento degli allevamenti infetti; d) progressiva diminuzione della frequenza dell’allele ARQ negli allevamenti aderenti al piano. Basi del piano Il piano si basa sull’osservazione del fatto che solamente determinati genotipi ovini sembrano ammalarsi di scrapie. Malattia # Infezione La Scienza dietro la Genetica della Scrapie ci dice: • Alcune pecore si ammalano più facilmente di altre • La Genotipizzazione è usata per identificare i geni che controllano la suscettibilità o la resistenza alla scrapie ? ? La Scrapie e i montoni… • I montoni prendono la scrapie • I montoni infetti non sembrano in grado di trasmettere la scrapie • La genetica del montone influenza la suscettibilità alla scrapie dei propri figli e le Capre? Ad oggi non sono stati identificati genotipi resistenti nelle capre. Pertanto, tutte le capre devono essere considerate suscettibili alla Scrapie. Cos’è la Genotipizzazione? • La Genotipizzazione è un test del DNA • Un semplice esame del sangue o di tessuti permette di determinare il genotipo degli ovini – il genotipo non cambia mai. Un solo esame basta per tutta la vita. – Può essere definito a qualsiasi età Genotipizzazione • E’ preferibile usare un sistema di identificazione permanente (microchip o 2 marche) sui capi da esaminare • Il prelievo deve essere eseguito sotto il controllo di un veterinario riconosciuto • Usare provette con EDTA e farle arrivare al Laboratorio prima possibile (o congelate) • Il Genotipo rimane lo stesso per tutta la vita dell’animale Genotipizzazione Una genotipizzazione viene riconosciuta ufficialmente se: – il sangue è prelevato da un veterinario AUSL o riconosciuto – Il capo è identificato ufficialmente – Il campione è inviato al lab accompagnato dall’allegato IV del DM 17/12/2004 – Il lab è stato riconosciuto dal Min.Salute Laboratori che effettuano le genotipizzazioni • Laboratorio Gruppi sanguigni di Cremona – solo per allevamenti iscritti a libro genealogico • IZSLER - Sezione di Modena – Ovini della Regione Emilia-Romagna Cos’è la Genotipizzazione? (cont.) Può capitare che un ovino già genotipizzato debba essere ricampionato: – Problemi di identificazione dell’animale o del campione – Campione non idoneo per l’esame (degradato) – Errori nell’identificazione dell’animale – Verifica sul genotipo effettuata per sorveglianza da parte della A.USL • Il test del genotipo misura solo la suscettibilità e non se l’animale ha la scrapie Basi del piano La tipizzazione genetica rileva solamente il grado di suscettibilità del soggetto esaminato alla malattia clinica. Genotipo sensibile # Animale infetto Dettagli di Genetica • Gli ovini hanno un paio di geni che influenzano la suscettibilità alla scrapie • Questi geni sono conosciuti come geni PRNP (PrioN Protein) • Ogni ovino ha due copie (un paio) di geni PRNP — Una copia da ciascun genitore Dettagli di Genetica (cont.) • Negli ovini, il gene PRNP produce una c proteina prionica normale PrP c • Negli ovini infetti da scrapie la PrP viene modificata in: sc – PrP , proteina prionica scrapie, la forma patologica e infettiva della proteina prionica La teoria del prione c • La PrP esiste in tutti gli animali con piccole differenze di specie sc • PrP produce più copie di sé stessa, provocando una modificazione strutturale della proteina prionica normale. Dettagli sul Gene PRNP • Tutti i geni, PRNP compreso, sono composti da codoni • Ciascun codone dice alla cellula di mettere uno specifico aminoacido in un punto particolare di una proteina che sta costruendo • La proteina prionica PrPc (prodotta dal gene PRNP) ha 254 aminoacidi • I punti dei 254 aminoacidi sono numerati da 1 a 254 Geni e Scrapie • Nel gene PRNP, tre codoni influenzano la suscettibilità alla scrapie – Codone 171 – Codone 154 – Codone 136 – Codone 141 (141F correlata a infezione con ceppo atipico Nor98) Genetica & Suscettibilità alla Scrapie • Codone 136 - Influenza la suscettibilità negli ovini esposti ad alcuni ceppi di scrapie • Codone 154 - Gioca un ruolo minore • Codone 171 - E’ il maggiore determinante della suscettibilità alla scrapie Codoni 136 & 171 e i loro polimorfismi • Il Codone 136 codifica per l’aminoacido Valina (V), Alanina (A) o Treonina (T) • Il Codone 171 codifica per l’aminoacido Glutamina (Q), Arginina (R), Istidina (H), o Lisina (K): Si considera che Q, H, K al 171 abbiano la stessa suscettibilità e vengono refertati come Q dalla maggior parte dei laboratori Come si scrivono i Genotipi I genotipi ovini possono essere scritti in due modi: – Lettere degli aminoacidi: ARQ/ARR, ARR/VRQ, etc. (l’ordine delle lettere è quello numerico dei codon 136, 154 e 171), oppure – Il numero del Codone seguito dall’ amino acido corrispondente: 171QR, 171RR, etc. Geni Ovini: Uno da ciascun genitore • Ogni genitore dà una copia del gene all’agnello. Il gene è in genere uno di questi tre: ARQ (wt), VRQ, ARR, • Quindi, ogni agnello porta due copie del gene. Le combinazioni possibili sono: ARQ/ARQ, ARR/ARQ, ARR/ARR, ARQ/VRQ, ARR/VRQ, VRQ/VRQ. • I genotipi rari AHQ, ARH, ARK, TRQ, ecc. sono considerati equivalenti all’ARQ. Combinazioni dei genotipi e suscettibilità alla scrapie • • • • ARR/ARR - sono resistenti (Classe I) ARR/ARQ - sono semi-resistenti (Classe II) ARQ/ARQ - sono suscettibili (Classe III) ARQ/VRQ - sono molto suscettibili (divieto di impiego come riproduttori) VRQ/VRQ - sono molto suscettibili (divieto di impiego come riproduttori) ARR/VRQ - sono poco suscettibili (divieto di impiego come riproduttori) Schema di selezione Classificazione dei riproduttori • La selezione avviene per linea maschile; • per accelerare la selezione possono essere testate anche le femmine (gruppi di monta). Classe Riproduttori 1° Classe 2° Classe 3° Classe Divieto d'impiego Genotipi ARR/ARR ARR/ARQ ARR/AHQ ARR/ARH ARQ/ARQ ARQ/AHQ ARQ/ARH ARH/AHQ AHQ/AHQ ARH/ARH VRQ/ARQ VRQ/AHQ VRQ/ARH ARR/VRQ VRQ/VRQ Note Genotipo resistente Genotipo semi-resistente Genotipi sensibili o rari Portatori allele VRQ La ricerca ha dimostrato che: la Scrapie si diffonde alle pecore suscettibili (171QQ) e alle capre attraverso il contatto con la placenta ed i liquidi fetali infetti. ? ? • Tutte le placente 171QR di pecore infette 171QQ esaminate sono risultate negative per scrapie, mentre le placente 171QQ di pecore infette 171QQ sono risultate positive. • Pertanto, le placente ed i liquidi fetali 171QR di pecore infette non dovrebbero essere in grado di trasmettere la scrapie alle altre pecore suscettibili. L’importanza del genotipo della placenta nella trasmissione della scrapie Gli agnelli hanno una combinazione del DNA della pecora e del montone; una pecora 171QQ accoppiata ad un montone 171RR produrrà un agnello 171QR con fluidi e placenta 171QR. una pecora 171QQ accoppiata ad un montone 171QQ produrrà un agnello 171QQ con fluidi e placenta 171QQ. Come l’allevatore può usare la Genotipizzazione per prevenire la Scrapie • Selezionando montoni resistenti (171RR / I Classe) o semi-resistenti (171QR / II Classe) – Ogni individuo riceve un gene da ciascun genitore. – Montoni resistenti produrranno solamente agnelli resistenti (171RR) o semi-resistenti (171QR). – Montoni semi-resistenti (171QR) produrranno agnelli resistenti, semi-resistenti o suscettibili a seconda del genotipo della pecora coperta. Tabella di suscettibilità degli agnelli Montone Pecora I Classe I Classe I Classe II Classe II Classe III Classe x x x x x x x x Pecora Montone I Classe II Classe III Classe II Classe III Classe III Classe dà dà dà dà dà dà dà I Classe 100% 50% 0% 25% 0% 0% Agnello II Classe III Classe 0% 0% 50% 0% 100% 0% 50% 25% 50% 50% 0% 100% Schema di selezione Utilizzo dei riproduttori • La Regione, su parere della Commissione, definisce se una razza ha frequenza di ARR superiore al 40%. Classe Riproduttori 1° Classe 2° Classe 3° Classe Divieto d'impiego Ignota Rimonta interna Rimonta esterna o fecondazione artificiale Da allevamenti con da allevamenti senza qualifica qualifica Autorizzato Autorizzato Autorizzato Autorizzato Autorizzato Autorizzato Autorizzato Autorizzato Vietato Vietato Vietato Vietato Vietato Vietato Vietato • Montoni di 3° classe: – introdotti solo nei primi 5 anni del piano – utilizzabili solo nei primi 7 anni del piano Come l’allevatore può usare la Genotipizzazione per prevenire la Scrapie (cont.) • Selezionando pecore resistenti (171RR / I Classe) o semi-resistenti (171QR / II Classe) – Una pecora trasmetterà i suoi caratteri di resistenza/suscettibilità allo stesso modo del montone, ma solamente al suo agnello. – La genotipizzazione delle pecore ha un basso costo/efficacia rispetto a quella del montone. – In pratica è utile solo per le madri di montoni o quando si vuole accelerare al massimo la selezione (allevamento a rischio; razze a bassa frequenza allele ARR). Come l’allevatore può usare la Genotipizzazione per prevenire la Scrapie (cont.) • La Genotipizzazione deve essere considerata come “uno” strumento non come “unico” strumento di prevenzione – Il metodo più efficace per evitare l’introduzione della scrapie è quello di non comprare pecore – Se il sistema di allevamento richiede l’acquisto di pecore, comprare pecore resistenti (classe I - ARR/ARR) o semiresistenti (classe II - ARR/***). Possibili conseguenze della selezione genetica • Selezione di portatori sani • Comparsa di nuovi ceppi • Selezione di animali sensibili all’agente della BSE • Selezione di animali maggiormente suscettibili ad altre patologie • Effetti negativi sulle produzioni Chi va piano ... • Dal 01/04/05 il piano è obbligatorio per gli allevamenti iscritti ai Libri genealogici e per i greggi ad alto merito genetico. • Tutti gli altri allevamenti ovini possono aderire volontariamente. Chi va piano ... • Piani alternativi sulla base della situazione epidemiologica e delle frequenze alleliche; • istituzione di una Commissione di coordinamento. Compiti della Commissione La Commissione deve coordinare le attività: 1. di informazione agli allevatori, e di formazione dei veterinari ufficiali e riconosciuti; 2. di identificazione permanente e tipizzazione genetica nelle aziende aderenti al piano; 3. di selezione genetica negli allevamenti aderenti al piano; Compiti della Commissione La Commissione deve coordinare le attività: 4. valutare l'andamento del piano e del suo impatto sulla zootecnia (relaz.annuale); 5. Revisionare il piano e, in base alle valutazioni di cui al punto precedente, all’evoluzione della normativa, delle conoscenze scientifiche sulla malattia e della situazione epidemiologica, proporre eventuali modifiche; Compiti della Commissione La Commissione deve coordinare le attività: 6. rapportarsi con la commissione nazionale di coordinamento e con i diversi enti coinvolti nel piano nazionale; 7. decidere, dietro proposta del servizio veterinario dell’AUSL competente, se un’azienda aderente al piano debba essere esclusa dallo stesso per inadempienza agli obblighi previsti. Compiti dell’allevatore • Allevare e gestire i gruppi di monta • Identificare (ID permanente) tutti i riproduttori ovini e caprini di età >6 mesi • Segnalare alla AUSL i capi con sintomi sospetti e i morti • Segnalare alla AUSL le introduzioni • Introdurre ed utilizzare solamente montoni di genotipi ammessi dal piano Compiti dell’allevatore • Macellare/castrare i riproduttori dichiarati non idonei nei tempi [30 gg.](indennizzo) • Pulizia, disinfezione e raccolta delle placente • Mantenere aggiornato il registro di stalla • Aiutare il Servizio Veterinario A.USL nelle operazioni di verifica del piano • Eseguire test del DNA aggiuntivi Compiti della AUSL • Identificare gli allevamenti aderenti al piano, raccogliere le domande. • Effettuare i prelievi per la tipizzazione genetica dei montoni (veterinario riconosciuto). • Assegnare le qualifiche sanitarie agli allevamenti aderenti al piano. • Eseguire ispezioni semestrali per la verifica dell’ andamento del piano. Controlli a campione annuali. • Predisporre le pratiche per l’indennizzo dei riproduttori non idonei macellati Schema di selezione Qualifica degli allevamenti • La AUSL sulla base della situazione genetica rilevata e sugli esiti delle ispezioni periodiche assegna una qualifica “di resistenza” all’allevamento. Livello resistenza Qualifica nazionale Criteri Dec.2003/100/CE Tutti i capi ARR/ARR Livello I Livello I Livello II Livello II Livello III Livello IV Livello V Livello II Tutti i montoni ARR/ARR e i restanti capi ARR/*** Tutti i montoni ARR/ARR Non previsto Tutti i montoni ARR/*** Non previsto Greggi aderenti al piano Costi del piano • Il SSN copre le spese relative alle analisi genetiche effettuate nelle aziende aderenti al piano. • Il SSN indennizza (L.218/1988) i riproduttori (portatori dell’allele VRQ) delle aziende aderenti al piano macellati ai sensi del piano nazionale (DM 17/12/04). Sistema informativo • Presso il CEA è istituita la BDNSG; • Presso il CEREV è istituita la BD regionale: – allevamenti aderenti (copia allegato 2) – qualifiche resistenza (elenco al 31 dic.) – ovini tipizzati (da laboratori) – ... Genotipi presenti in Emilia-Rom. Periodo gen.2004-feb.2005 • Nell’ambito di un progetto di ricerca sono stati tipizzati geneticamente oltre 1.000 ovini della Regione. • I soggetti tipizzati appartenevano a 13 razze diverse. • Sono stati rilevati 17 genotipi diversi, alcuni dei quali neppure previsti dal piano nazionale (ARK/***). Genotipi presenti in Emilia-Rom. Periodo gen.2004-feb.2005 Frequenze alleliche rilevate per le razze dell’ER Camp. Razza esam Sarda* 836 Meticci/Non Ind. 32 Berrichonne 24 Bergamasca 43 Appenninica 67 Texel 9 Massese 6 Ile de France 4 Suffolk 52 Lacone 4 Cornella 2 Comisana 3 Totale 1082 ARR 33,0% 37,5% 79,2% 11,6% 25,4% 11,1% 33,3% 87,5% 59,6% 50,0% 25,0% 33,3% 34,1% ARQ 63,3% 57,8% 18,8% 83,7% 70,1% 0,0% 66,7% 0,0% 24,0% 37,5% 75,0% 66,7% 60,7% AHQ 3,6% 4,7% 2,1% 1,2% 0,0% 16,7% 0,0% 0,0% 0,0% 12,5% 0,0% 0,0% 3,2% ARH 0,1% 0,0% 0,0% 3,5% 3,7% 72,2% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 1,0% VRQ 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,7% 0,0% 0,0% 12,5% 16,3% 0,0% 0,0% 0,0% 1,0% Risultati (dati al 4/11/05) • 61 domande di adesione pervenute; • 700 ovini di 64 aziende tipizzati nell’anno corrente. Frequenze alleliche in Emilia-Romagna nel 2005 ARR 44,6% ARQ 48,2% AHQ 3,0% ARK 1,4% ARH 1,2% VRQ 1,6% Riproduttori classificati in Emilia-Romagna Classe riproduttore I II III ARR/ARR ARR/*** 24,4% 39,6% 32,9% Riforma VRQ/*** 3,1% Punti critici • La formazione e l’informazione di allevatori e veterinari; • La motivazione e la collaborazione degli allevatori e delle loro Associazioni; • L’identificazione degli animali; • Il ruolo del veterinario aziendale. Conclusioni 1 • La scrapie è una malattia trasmissibile fortemente influenzata dalla genetica; • I genotipi che controllano la suscettibilità e la resistenza alla malattia sono LA cosa più importante da sapere sul controllo con la genetica della scrapie Conclusioni 2 • Alla tipizzazione genetica non consegue una diagnosi di scrapie; • Il successo del piano deriverà dal numero di adesioni da parte di allevatori motivati; • Risultati apprezzabili in tempi mediolunghi (5-7 anni).