Cromatografia 1
30,00
percentuale
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
numero porzioni
Cromatografia1
1
La cromatografia
La cromatografia è un insieme di metodi che,
sfruttando fenomeni chimico-fisici, consentono
di separare e identificare i diversi componenti
di un miscuglio.
La tecnica cromatografica nacque dall’esigenza
di separare i singoli costituenti di miscele
anche molto complesse. Pertanto, i metodi cosi
detti cromatografici si sono rivelati tra i più
efficienti e versatili, tanto che il loro campo
d'applicazione si estende a tutti i rami delle
scienze naturali e della chimica.
Cromatografia1
2
Il termine cromatografia, è dovuto
al fatto che le prime separazioni
venivano effettuate su composti
colorati (alcuni coloranti naturali
tra cui la clorofilla), e che le
sostanze, una volta separate,
venivano identificate attraverso il
loro colore. In alcune semplici
tecniche cromatografiche, i metodi
di rilevazione sono ancora basati
sull’esame del colore delle
sostanze separate o, per le
sostanze incolori, sulla
formazione di sostanze colorate,
mediante l’impiego di opportuni
reattivi chimici.
Fra i primi ricercatori che si
dedicarono a questo tipo di analisi
occupa un posto di assoluta
preminenza Tsweet, botanico
russo, che formulò
l’interpretazione corretta del
fenomeno ed ebbe la chiara
intuizione dei suoi sviluppi futuri.
Cromatografia1
3
Il meccanismo di base
Supponiamo di avere una singola sostanza sciolta
in una data quantità di un determinato solvente.
Se
a
questa
soluzione viene
affacciato
un
uguale volume di
un altro solvente,
immiscibile
nel
primo,…
Cromatografia1
…la
sostanza
si
distribuirà tra i due
solventi arrivando a
concentrazioni che
dipendono
dalle
caratteristiche
dei
solventi
e
della
sostanza.
4
Le concentrazioni di equilibrio rimangono costanti, pur
essendo le molecole in continuo passaggio da una fase
all’altra. Si tratta di un equilibrio dinamico caratterizzato dalla
relazione
Krip= [A]mob/ [A]sta
Cromatografia1
5
Se ora entrambe le porzioni
sono affacciate a nuovi
volumi
di
solvente
differente…
…tenendo cioè fissa la
posizione della porzione
sottostante
(fase
stazionaria), e spostando
quella
superiore
(fase
mobile)…
…in ciascuna coppia ottenuta la
sostanza si distribuirà secondo
lo stesso rapporto che era stato
rispettato
nella
prima
equilibrazione.
Cromatografia1
6
Ripetendo ora il
processo
di
affacciamento
con volumi puliti
degli
stessi
solventi…
…mantenendo
sempre fissa la fase
stazionaria
e
spostando la fase
mobile…
…in
ciascuna
coppia
ottenuta la sostanza si
distribuirà secondo lo
stesso
rapporto
già
osservato
nella
prima
Cromatografia1
equilibrazione
7
Ripetendo ora più e più volte il processo di affacciamento con
volumi freschi di fase stazionaria e fase mobile
…in
ciascuna
coppia ottenuta
la sostanza si
distribuirà
secondo
il
solito rapporto.
Cromatografia1
8
Dopo molti affiancamenti/equilibrazioni, le distribuzioni che si instaurano
mostrano che la sostanza:
• si sposta seguendo la direzione della fase mobile,
• si accumula preferenzialmente nelle porzioni centrali
Le concentrazioni che si realizzano in ciascuna porzione dipendono
ovviamente da quale è la “preferenza” che la sostanza mostra per le due fasi.
Nelle diapo successive sono indicate le distribuzioni percentuali nelle
porzioni di fasi mobili dopo 5, 10, e 25 spostamenti e relative equilibrazioni
per quattro diverse sostanze che presentano rapporti di distribuzione pari a
• 1 (le due fasi sono in equilibrio quando contengono le stesse
concentrazioni)
• 2,33 (equilibrio con una concentrazione nella f.m. 2,33 volte quella della f.s.)
• 4 (equilibrio con una concentrazione nella f.m. 4 volte quella della f.s.)
• 9 (equilibrio con una concentrazione nella f.m. 9 volte quella della f.s.)
Cromatografia1
9
rapporto 1
20,00
18,00
dopo 5
dopo 15
16,00
dopo 25
percentaule
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
1
2
3
Cromatografia1
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
posizione
10
rapporto 2,33
35,00
30,00
dopo 5
dopo 15
dopo 25
percentuali
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
1
2
3
Cromatografia1
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
porzione
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
11
rapporto 4
35,00
30,00
dopo 5
dopo 15
dopo 25
percentuali
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
1
2
3
Cromatografia1
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
porzione
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
12
rapporto 9
70,00
60,00
dopo 5
dopo 25
50,00
percentuali
dopo 15
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
1
2
3
Cromatografia1
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
porzione
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
13
30,00
confronto tra sostanze con diversa “preferenza”
rapporto 1
rapporto 2,33
rapporto 4
rapporto 9
25,00
percentuali
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
1
2
3
Cromatografia1
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
posizione
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
14
25
Come si vede dal grafico, questa particolare miscela non può
essere risolta, cioè separata nei suoi componenti in soli 25
passaggi.
Per semplicità consideriamo una miscela formata dalle due
sostanze con comportamento estremo.
Il grafico della diapo successiva mostra che dopo 35
spostamenti esse sono state risolte.
Cromatografia1
15
due sostanze diverse dopo 30 spostamenti
25,00
rapporto 1
rapporto 9
20,00
percentuale
15,00
10,00
5,00
0,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Cromatografia1
porzione
16
Si può pensare che l’operazione venga effettuata da volumi di
solventi che non siano divisi fisicamente. Un flusso di fase mobile
che scorra sulla fase stazionaria può essere considerata la
versione continua del processo discontinuo che abbiamo appena
analizzato.
Anche in questo caso la sostanza, viene trascinata in avanti dalla
fase mobile presentando concentrazioni maggiori nella zona
centrale della banda occupata.
Cromatografia1
17
40,00
Cromatografia1
35,00
percentuale
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
1
2
3
4
5
numero porzioni
30,00
25,00
percentuale
Al
diminuire
delle
dimensioni delle porzioni di
soluzioni studiate cresce il
loro
numero.
Contemporaneamente,
il
grafico che rappresenta
l’andamento
della
concentrazione
sarà
caratterizzato
da
barre
sempre più ravvicinate.
All’aumentare del numero
delle porzioni in cui è stata
suddivisa
la
soluzione,
congiungendo gli estremi
delle barre si otterrà una
curva il cui andamento
diventa
sempre
più
prossimo a quello di una
gaussiana
(curva
a
campana), coincidendo con
essa
per
un
numero
elevatissimo
di
equilibrazioni.
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
1
2
3
4
5
6
7
numero porzioni
8
9
10
11
18
I meccanismi della separazione
La separazione cromatografica si attua sfruttando, in modo
particolarmente efficiente, la diversa attitudine che ogni
molecola o ione possiede nel distribuirsi fra due differenti
fasi.
Le interazioni che si instaurano tra sostanza e le due fasi
(mobile e stazionaria) sono spesso legami chimici
secondari, sebbene in certi casi si arriva a meccanismi più
complessi come lo scambio ionico.
I meccanismi di separazione cromatografici si basano su
• adsorbimento,
• ripartizione,
• scambio ionico
• esclusione,
• affinità.
Le differenti tecniche cromatografiche vengono classificate
proprio in base a quale è il meccanismo principale della
separazione.
Cromatografia 2
19
Meccanismi chimico-fisici della
separazione cromatografica
Le interazioni che si verificano tra la sostanza e le due
fasi non sonofacilmente descrivibili in quanto di natura
eterogenea
•Legami a idrogeno
•Interazioni dipolo-dipolo
•Interazioni
dipolo-dipolo indotto
•Legami di VdW
•Formazione di composti di coordinazione
•Meccanismi di scambio ionico
•Interazioni steriche
In tutte queste interazioni la polarità gioca di solito un
ruolo decisivo
20
Adsorbimento
L'adsorbimento è quel fenomeno che determina il vincolarsi di
una sostanza a un solido. Ciò perché sul solido ci sono i
cosiddetti "centri attivi" ovvero raggruppamenti di atomi
grazie ai quali esso si lega, con legami chimici secondari, ai
componenti della miscela e ne ritarda il procedere.
Cromatografia 2
21
Vari sono i fattori che influenzano il fenomeno
dell'adsorbimento:
• Struttura reticolare del solido;
• Stato fisico del solido adsorbente: si intende praticamente la
superficie di reazione che deve essere la massima
possibile;
• Struttura molecolare dell'adsorbito: la polarità di una
molecola influisce sulla sua attrazione con i "centri attivi" del
solido. Le molecole con gruppi polari (–OH, –NH2, ecc...)
saranno più trattenute dal solido che quelle apolari;
• Temperatura e pressione: sono fattori contrastanti a
riguardo dell'adsorbimento. Mentre l'aumento di temperatura
causa un aumento dell’agitazione molecolare con
conseguente rottura dei legami adsorbente/adsorbito, un
aumento della pressione favorisce l'addensarsi di un
componente gassoso sul solido.
L'adsorbimento quindi si basa sulla selettività del trattenimento
dell'adsorbente nei confronti di adsorbiti diversi in base alle
caratteristiche del solido adsorbente e alle condizioni interne
(T e P) alla
colonna.
Cromatografia
2
22
Le interazioni che intercorrono tra le differenti sostanze e il
solido con i suoi centri attivi sono paragonabili a ciò che succede
quando due diverse palline scorrono su una tavola irta di chiodi.
La diversa superficie delle palline, così come la diversa polarità
delle molecole, assicurerà un maggior o minore trattenimento
da parte delle punte dei chiodi, paragonabili ai centri attivi del
solido.
Cromatografia 2
23
Ripartizione
Quando la fase stazionaria è un liquido, si verifica una vera e
propria solubilizzazione in essa dei componenti della
miscela. Quando anche la fase mobile è liquida, i processi
cromatografici sono governati dalla legge di ripartizione di
Nernst.
Esse pertanto si ripartiscono fra le due fasi (immiscibili fra loro)
in condizioni di equilibrio secondo un rapporto costante che
dipende dalla solubilità del campione nei due solventi:
in cui:
K = CX / CY
K = coefficiente di
ripartizione: è costante a
temperatura costante,
CX = concentrazione del
soluto nel solvente X,
CY = concentrazione del
soluto nel solvente Y.
I valori di K variano da
sostanza a sostanza ma
anche a seconda della
coppia di liquidi usata e
della temperatura.
24
Scambio ionico
Si utilizza una resina con
funzioni cariche bilanciate da
ioni di segno opposto (1), per
esempio -COO- H+.
Queste funzioni sono in grado di
scambiare i propri controioni
(H+ nell’esempio citato) con
altri di segno uguale (Na+,
Ca2+, K+, etc ) provenienti
dalla soluzione (2).
Facendo passare il controione
originale della resina (H+ nel
caso illustrato) in elevata
concentrazione, gli ioni
provenienti dalla soluzione
sono restituiti in modo
differenziato, in funzione di
carica e dimensioni, e quindi
eluiti separatamente.
Cromatografia 2
25
Esclusione
La fase stazionaria è un gel con pori di varie dimensioni. I
componenti della miscela vengono separati in funzione
delle loro dimensioni: quelli più piccoli possono
penetrare in tutti i pori dei granuli e quindi sono trattenuti
a lungo, mentre quelli più grandi possono solo “girare
attorno” ai granuli di gel e quindi usciranno velocemente.
grande
piccola
Cromatografia 2
26
La tecnica è usata soprattutto per separare
molecole organiche ad alto peso
molecolare come proteine, acidi nucleici,
carboidrati. Trova applicazione in campo
biologico quando detti composti sono
presenti in matrici complesse facilmente
degradabili per altre vie.
Cromatografia 2
27
Affinità
Il comportamento è molto simile a quello dell’adsorbimento in
quanto i componenti della miscela si legano a “siti attivi” della
fase stazionaria (a e b). A differenza dell’adsorbimento, si
hanno legami veri e propri (primari).
Le reazioni che li hanno formati sono comunque reversibili e
facendo eluire un solvente opportuno è possibile restituire in
modo differenziato i componenti che erano stati trattenuti (C).
Cromatografia 2
28
Anche il meccanismo dell’affinità è legato all’ambito
biochimico
Cromatografia 2
29
Per esempio, si può isolare l'RNA messaggero che si
differenzia dagli altri RNA (RNA transfert e
ribosomiale), per la presenza di una coda di poly A.
Da un estrazione di RNA totale della cellula (lisi,
centrifugazione, DNAsi), si esegue una cromatografia
per affinità usando una resina particolare in cui siano
presenti dei poly T. In questo modo posso estrarre e
purificare i miei RNA messaggeri.
Cromatografia 2
30
A seconda di quale sia il meccanismo
prevalente e di come si presentino la fase
stazionaria e quella mobile si possono
avere più tecniche cromatografiche che
vanno da un semplice foglio di carta
porosa che pesca in una bacinella
contenente il solvente, a strumenti
assistiti da componenti computerizzati.
Cromatografia 2
31
Fase
mobile
Strumentazione
Principio di Tecnica
separazione
ripartizione
LLC cromatografia
liquido/liquido
adsorbimento
LSC cromatografia liquido/solido
colonna
scambio ionico IEC cromatografia a scambio
ionico
liquida
esclusione
GPC cromatografia a
permeazione di gel
ripartizione
TLC cromatografia su strato
sottile
adsorbimento
TLC cromatografia su strato
sottile
strato sottile
cromatografo liquido
gassosa
gascromatografo
Cromatografia 2
scambio ionico TLIEC cromatografia a scambio
ionico su strato sottile
ripartizione
HPLC cromatografia ad alte
prestazioni
ripartizione
GLC cromatografia liquido/gas
adsorbimento
32
GSC cromatografia gas/solido
I parametri del cromatogramma
Abbiamo visto che unendo i punti delle barre che
rappresentano le concentrazioni nelle porzioni
consecutive della fase mobile si ottiene una
gaussiana.
Poiché nella maggior parte dei sistemi
cromatografici destinati a misure quantitative vi è
un sistema di misura che rileva la
concentrazione della sostanza, esso restituirà
tale informazione proprio sotto forma di tale
curva.
Cromatografia 2
33
I segnali si presentano
spesso asimmetrici o
parzialmente sovrapposti
ma tali picchi hanno dei
parametri caratteristici che
derivano appunto dalla
loro natura gaussiana.
Cromatografia 2
34
• Altezza del picco
• Ampiezza a metà altezza
• Larghezza della base
• Distanza tra i punti di flesso
tra loro esistono
le relazioni
• wi = wb/2 = 2 s
• wb = 1,699 wh1/2
• wh = 1,177 wi
h
wh1/2
wb
wi
h
h1/2
Queste relazioni nascono dal
fatto che tutti i picchi sono
delle gaussiane con
equazione
Cromatografia 2
35
Altri parametri importanti sono
• tR tempo di ritenzione
• tR’ tempo di ritenzione
corretto
• tM tempo morto
per evidenziare la relazione
tra il tempo che una
sostanza impiega per
passare e impiega per
mettersi in equilibrio con la
fase stazionaria
tR’ =tR - tM
e il volume di ritenzione
corretto
VR’= tR’ FC
• Area del picco
A  2  h  s  2,51  h  s
Cromatografia 2
36
Cromatografia 3
Grandezze ed equazioni
fondamentali
• Come per la ripartizione, così anche per
qualsiasi altro meccanismo si può definire una
costante che rappresenti il rapporto tra le
concentrazioni di una sostanza nella fase
stazionaria (Cs ) e nella fase mobile (CM). La
chiameremo costante di distribuzione e
dipenderà, oltre che dalla temperatura, dalla
coppia di fasi usate:
Kd= Cs /CM
Cromatografia 3
37
• Vista come è costruita, tanto maggiore è la
Kd di una sostanza relativa a una coppia di
fasi e
– tanto più sarà trattenuta dalla fase stazionaria
– tanto più sarà elevato il suo tempo di ritenzione
Kd alta
Cromatografia 3
Kd bassa
38
• Per una data sostanza si ha
tR= tempo di ritenzione, cioè il tempo che una sostanza
deve usare per scorrere attraverso una colonna facendo le
interazioni
tM= tempo morto, cioè il tempo che una sostanza che non
faccia alcuna interazione utilizza comunque per passare
t’R= tempo di ritenzione corretto = tR - tM
• Tenendo conto del flusso (F) della fase mobile, si possono
considerarne anche i volumi usati. Analogamente si avrà
il volume di ritenzione VR= F tR
il volume morto VM= F tM
Cromatografia 3
39
• La relazione tra la costante e i parametri
del picco è espressa dall’equazione
fondamentale della cromatografia
VR= VM+ KdVS
dove
VR= volume di ritenzione di una data sostanza
VM= volume morto (o volume della fase mobile)
VS = volume della fase stazionaria
• Quest’ultima variabile, a
differenza di VR e VM , non
è misurabile facilmente per
cui rende difficile il calcolo
di Kd a partire dal
cromatogramma
Cromatografia 3
40
• Si preferisce allora, invece di Kd, far riferimento al fattore di
ritenzione, espresso come le moli distribuite tra le due fasi
k = ns/nM
• Si può dimostrare che questo parametro è determinabile da
valori del cromatogramma secondo la relazione
k = t’R / tM
Anch’esso dipende dalla temperatura e dalla coppia delle fasi
in uso ma anche dalle caratteristiche dell’impaccamento, dalla
granulometria e dallo spessore della fase stazionaria.
• Buone separazioni si hanno se la prima sostanza eluita ha k
superiore a 1. Quelle successive devono comunque avere k
non superiori a 10-15 onde evitare tempi lunghi per le analisi ed
eccessiva dispersione (i picchi si appiattiscono troppo)
Cromatografia 3
41
• La selettività indica la capacità di un sistema cromatografico
di eluire specie chimiche diverse con velocità tali che escano
separate dalla colonna.
• La selettività verso due
sostanze di un sistema
cromatografico viene
espressa dal cosiddetto
fattore di separazione
a = t’’R2/t’’R1
espresso anche come
a = k2/k1 = Kd2/Kd1
• La selettività dipende dal
meccanismo della
separazione cromatografica
ma non dalle caratteristiche
costruttive e deve essere
maggiore di 1,2.
Cromatografia 3
42
• La qualità di una separazione cromatografica non dipende
solo da a ma anche dalla capacità di un sistema di eluire
tutte le particelle di una data specie chimica con la stessa
velocità
• La capacità di formare picchi molto stretti è l’ efficienza
• Il parametro più semplice
con cui esprimere
l’efficienza è la larghezza
alla base del picco (wb),
che in genere è diversa
per ogni specie chimica in
un dato sistema
cromatografico.
• L’efficienza di una colonna
verso una data sostanza
viene espressa anche con
N, detto numero dei
piatti teorici.
Cromatografia 3
43
• Il numero dei piatti teorici di una colonna
cromatografica è ricavabile da
N = 16 (tR/wb)2
mentre facendo riferimento al tempo di ritenzione
corretto, si definisce il numero dei piatti effettivi
Neff = 16 (t’R/wb)2
• E’ importante precisare che N non è un parametro
caratteristico per una data colonna, poiché dipende
anche dalla sostanza eluita.
Ciò significa che una stessa colonna attraversata da due
sostanze mostra due diversi valori di piatti teorici.
• Il concetto di piatto teorico è stato preso a prestito dalla
teoria della colonna di distillazione. Si può immaginare
che una colonna cromatografica, come una di
distillazione, sia suddivisa appunto in tante zone in cui si
instaura l’equilibrio di ripartizione dell’analita tra fase
stazionaria e fase mobile (vedi CROMATOGRAFIA 1).
Cromatografia 3
44
• La sostanza si sposta verso la fine della colonna
attraverso la fase mobile che, in equilibrio su un piatto, si
passa al piatto successivo.
• È importante sottolineare che, a differenza della colonna
di distillazione, i piatti non esistono realmente all’interno
della colonna ma sono solo un modello per facilitare la
comprensione del processo che avviene.
• Se si aumenta N, diminuisce il numero dei piatti teorici su
cui si distribuisce ogni sostanza poiché aumentano gli
equilibri a cui essa è sottoposta; a parità di lunghezza,
pertanto, si accorcia il tratto di colonna su cui si
distribuisce ogni sostanza.
Cromatografia 3
45
Aumentando i piatti
aumentano
gli equilibri
più compatta viaggia
la sostanza
Cromatografia 3
46
• L’efficienza di una colonna aumenta con il numero dei
piatti: tanto maggiore è N, tanto più compatta è la banda
in uscita e quindi tanto più è stretto il picco sul
cromatogramma.
Aumentando
i piatti
i picchi
sono più
stretti
si hanno
migliori
separazioni
• Il modo più semplice per aumentare il numero dei piatti
consiste nell’aumentare la lunghezza della colonna ma ciò
comporta un notevole aumento dei tempi di ritenzione.
• In alternativa si deve trovare un modo di diminuire le
dimensioni di un singolo piatto. A parità di lunghezza una
colonna sarà più efficiente quando viene minimizzata
l’altezza equivalente al piatto teorico
H = L/N
dove L è la lunghezza della colonna. Ancora più adatta è
la formula
Heff = L/Neff
Cromatografia 3
47
• Una colonna è tanto più efficiente (nei confronti di una
determinata specie chimica), e fornisce quindi picchi tanto
più stretti, quanto minore è il valore di H.
• Il parametro H è indipendente dalla lunghezza della
colonna e quindi è più adatto di N per confrontare le
prestazioni di colonne diverse verso una stessa sostanza.
• Il numero di piatti teorici, e quindi la loro altezza, può
essere calcolato esaminando un picco cromatografico dopo
l’eluizione.
Esce dopo ma ha la
2
Neff = 16 (t’R/wb)
stessa ampiezza di
• Come si può
Esce prima ma ha
la stessa ampiezza
osservare
di base: minor
dall’equazione, il
efficienza della
numero di piatti della colonna nei suoi
colonna è diverso per confronti
ciascun componente
del campione.
Cromatografia 3
base: maggior
efficienza della
colonna nei suoi
confronti
48
TLC - Cromatografia
su strato sottile
TLC
Thin Layer Chromatography - Cromatografia su strato sottile
tecnica prevalentemente analitica
separazione di composti contenuti in una miscela
purificazione
identificazione qualitativa e/o quantitativa.
TCL in Fase Diretta
fase stazionaria polare (es. gel di
silice)
fasi mobili non polari per svolgere
l’eluizione.
MECCANISMI DI
ADSORBIMENTO
TLC in Fase Inversa
fase stazionaria modificata
chimicamente (oppure
imbevuta con sostanze non
polari)
fase mobile relativamente
polare
MECCANISMI DI
RIPARTIZIONE.
SUPPORTO
Vetro - Permette di visualizzare meglio le macchie dal dietro della lastra.
Plastica - Alcuni solventi organici possono intaccare tale tipo di lastra.
Alluminio - Tali lastre non possono essere usate in ambienti alcalini o acidi
per acidi minerali.
Analitica: 250μm
Preparativa:50-2000 μm
FASE STAZIONARIA
Fase stazionarie solide
L’interazione (adsorbimento) di questi materiali con la fase mobile dipende dalla
geometria delle particelle che le costituiscono.
L’attività: esprime la capacità di adsorbire le sostanze in termini quantitativi, ma più
spesso è riferita semplicemente all’entità dell’adsorbimento.
Fase stazionarie liquide
Impiegate nella cromatografia a fasi inverse.
sostegno inerte (lastrine di gel di silice G oppure Kieselguhr) rivestito di un liquido più o
meno lipofilo (idrocarburi, oli e grassi vegetali, glicoli, siliconi…)
Gel di silice
È costituito da acido silicico
(H4SiO4) amorfo altamente poroso
ottenuto, sotto forma di particelle
dure e leggermente opache,
trattando il vetro solubile, silicato di
sodio (2Na2O SiO2), con acido
solforico. Il gel ha una struttura
amorfa simile a quella del vetro.
Ossidi di alluminio o allumina
allumina di tipo basico
l’attività dipende dalla quantità di acqua presente in esso;
Cellulosa in polvere
evoluzione della cromatografia su carta
tempi di esecuzione più brevi
la preparazione di strati più omogenei
minore diffusione delle macchie;
Kieselguhr
acido silicico amorfo di origine fossile ( terra di diatomee);
FASE MOBILE
Miscele o solventi puri
composizione
Benzene
Benzene/cloroformio
La polarità è fondamentale per la scelta
dell’eluente è da essa che dipende
l’entità del trascinamento delle
sostanze lungo la lastrina in una TLC
Polarità
serie eluotropa: Il potere eluente
dei più comuni solventi organici, puri
ed in miscele, ordinato secondo
polarità crescente
Cloroformio
-
potere eluente: capacità relativa dei
vari solventi di far muovere una
sostanza su una fase stazionaria
1+1
+
Cicloesano/acetato d’etile
8+2
Cloroformio/acetone
95+5
Benzene/acetone
9+1
Benzene/acetato d’etile
8+2
Cloroformio/dietiletere
9+1
Benzene/metanolo
95+5
Benzene/dietiletere
6+4
Cicloesano/acetato di etile
1+1
Cloroformio/dietiletere
8+2
Benzene/acetone
8+2
Cloroformio/metanolo
99+1
Benzene/metanolo
9+1
Cloroformio/acetone
85+15
Benzene/dietiletere
4+6
Benzene/acetato di etile
1+1
Cloroformio/dietiletere
6+4
Cicloesano/acetato d’etile
2+8
Acetato di butile
Cloroformio/metanolo
95+5
Cloroformio/acetone
7+3
Benzene/acetato di etile
3+7
Acetato di butile/metanolo
99+1
serie eluotropa su gel di silice.
Quando la fase mobile sale lungo la silice, i composti in essa disciolti sono in
grado di interagire con i gruppi polari della silice. Le interazioni in gioco sono
principalmente dipolo-dipolo e formazione di legami ad idrogeno e dunque
quanti più polari sono i composti, tanto più verranno trattenuti dalla fase
stazionaria.
Fase Mobile
SCELTA DELLA FASE MOBILE E DELLA FASE STAZIONARIA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Le due fasi devono necessariamente interferire tra loro il meno
possibile;
In qualche misura i componenti della miscela da separare devono
interagire con le due fasi;
Il campione deve essere solubile nell’eluente;
Con le comuni fasi stazionarie solide gli idrocarburi non sono affatto
adsorbiti e sono i primi ad essere eluiti, l’affinità per tali tipi di fasi
stazionarie decresce nel seguente ordine: acidi, alcoli, ammine, tioli,
aldeidi, chetoni, esteri, eteri, alcheni, alcani;
Per la scelta dell’eluente si fa riferimento alla serie eluotropa;
L’attività dell’adsorbente è determinante per la cromatografia in fase
diretta, mentre, per quella in fase inversa sono determinanti anche
piccole differenze nella polarità del materiale scelto.
Rf ≤0,5; DRf ≥0,1; il DRf tra due componenti della miscela deve essere il
più alto possibile.
Come operiamo?
Deposizione del campione
Il campione deve essere deposto alla base della
lastrina,con l’aiuto di un capillare come macchia
(deposizione a goccia) o come striscia (deposizione
lineare), nel modo più compatto possibile.
Il campione deve essere deposto senza intaccare lo strato
di fase stazionaria.
Se il campione è molto diluito, occorre depositare il
campione più volte e perciò è utile asciugare la macchia
con un phon in modo da evitare un allargamento eccessivo.
Camera cromatografica
Recipiente, generalmente, di vetro di forma e volume opportuno dotato di
un coperchio a tenuta;
L’eluente deve essere versato nel recipiente, in modo da raggiungere il
livello di 0,5-1 cm; poi si chiude il coperchio e si lascia a condizionare;
Eluizione
Lo sviluppo del cromatogramma è uno sviluppo ascendente
Lo sviluppo ascendente della lastrina è quello più comunemente
impiegato, l’eluente migra verso l’alto attraverso uno strato di fase
stazionaria per capillarità
•
Quando lo sviluppo è completato estrarre la lastra dalla camera
cromatorafica;
•
Segnare il fronte del solvente;
•
Asciugare la lastrina all’aria o con l’aiuto di un phon, se le sostanze non
sono termolabili si può porre il tutto in una stufa per qualche minuto a
100-105°C;
•
Cerchiare con la matita le macchie visibili…
Visualizzazione dei risultati
Rivelazione con luce UV
Presenza di cromofori
lampada UV (254 e 366 nm)
Se invece le sostanze da rivelare non possiedono cromofori, si può
usare una lastra la cui fase stazionaria, prima o dopo l’eluizione,
viene impreganata di una sostanza fluorescente ai raggi UV.
Illuminando la lastra con le apposite lampade, si osservano delle
macchie scure su sfondo fluorescente.
Un indicatore di fluorescenza molto usato è un silicato di zinco e
magnesio attivato che a 254 nm da una fluorescenza verde.
La silice delle lastrine per TLC F254 è imbevuta di Fluoresceina, una sostanza in
grado di assorbire la luce ultravioletta a 254 nm e riemettere luce per
fluorescenza.
Quando la piastrina è esposta alla luce UV, appare di una intensa colorazione
verde.
Quanto sulla lastrina sono presenti dei composti in grado di assorbire la
radiazione
UV,
ma
non
di
riemettere
luce
per
fluorescenza,
corrispondenza delle macchie dei composti compare una colorazione viola.
in
Lampada UV
Rivelazione di due composti
Tre
deposizioni
a
concentrazione
differente. Una elevata concentrazione
diminuisce l’efficienza della separazione
Rivelazione con reagenti chimici
-I vapori di iodio sono un agente di rivelazione di uso generale, non specifico,
adatto per la maggior parte dei composti organici.
La posizione delle macchie va segnalata non appena si estrae la lastrina dalla
vasca, poiché lo iodio evapora rapidamente per esposizione all’aria e le macchie
scompaiono.
-Possiamo bruciare le sostanze organiche
spruzzando acido solforico ed anidride cromica.
Esempi di soluzioni coloranti di uso generale per in TLC
ATTENZIONE A LAVORARE SOTTO
CAPPA E CON PROTEZIONI IN QUANTO
IL PIÙ DELLE VOLTE SI TRATTA DI
SOSTANZE ALTAMENTE
TOSSICHE E NOCIVE.
Una volta individuate tutte le macchie di sostanza, esse possono essere caratterizzate
dal fattore di ritardo (Rf), che esprime l’affinità relativa della sostanza per il sistema
fase mobile/fase stazionaria:
Per un dato sistema cromatografico, il fattore di ritenzione di una
sostanza è una costante caratteristica della stessa in condizioni
sperimentali riproducibili!!!
Il fattore di ritenzione dipende da:
• natura chimica e attività della fase stazionaria;
• struttura dei pori presenti nei granuli della fase
stazionaria;
• spessore dello strato;
• temperatura e grado di saturazione dell'ambiente;
• composizione della fase mobile.
-
I valori di Rf possono essere usati per identificare una sostanza per confronto con degli
standard;
-
Il valore di Rf non è una costante fisica ed il confronto DEVE ESSERE FATTO SOLO tra
macchie presenti sulla stessa lastrina e sviluppate nello stesso modo e
contemporaneamente;
- Due sostanze che hanno lo stesso valore di Rf, nelle medesime condizioni cromatografiche,
potrebbero essere identiche; invece quelle che hanno diversi valori di Rf sicuramente non
lo sono!
LA QUALITÀ DELLE PRESTAZIONI DI UNA TLC :
SELETTIVITÀ: è una misura della differenziazione del comportamento degli analiti nel
sistema cromatografico
Fattore di ritenzione o di ritardo (Rf) come:
CAPACITÀ: massima quantità di
campione che può essere utilmente
caricato sulla lastrina.
EFFICIENZA: attitudine del sistema a conservare compatta la macchia durante la
corsa cromatografia; si quantifica con il cosiddetto numero di piatti teorici N.
Un piatto teorico è la più piccola zona adiacente in cui il soluto raggiunge un equilibrio
tra fase mobile e stazionaria.
Numero di piatti teorici (N) :
wi: larghezza della macchia del composto i-esimo.
Maggiore è N maggiore sarà la risoluzione e, quindi, tanto più compatte saranno le macchie al termine
dell’eluizione.
L'efficienza dipende da:
• Granulometria: deve essere la più piccola possibile, pur consentendo velocità di flusso
dell'eluente non troppo basse;
• Distribuzione granulometrica: deve essere la più piccola possibile;
• Qualità dell'impaccamento: lo strato sottile deve essere il più uniforme e omogeneo
possibile;
• Geometria delle particelle: le particelle devono essere il più possibile sferiche.
RISOLUZIONE (Rs): attitudine del sistema a fornire alla fine della corsa cromatografica
delle macchie ben distanziate.
selettività
efficienza
risoluzione
TLC bidimensionale
Il materiale da cromatografare è posto su un angolo della lastra come singola
macchia, successivamente viene sviluppato in una direzione e dopo essiccamento
è sviluppato con un altro eluente in una direzione perpendicolare alla prima
Usi più comuni della TLC







Per determinare il numero di componenti una miscela;
Per determinare l'identità di sostanze;
Per la messa appunto delle condizioni più adatte allo svolgimento di una
cromatografia su colonna;
Per controllare il progresso di una reazione chimica;
Per determinare l'efficacia di una purificazione;
Per monitorare l’andamento di una cromatografia su colonna;
Per svolgere analisi microanalitiche.
Vantaggi
Semplicità di esecuzione
Rapidità d’esecuzione
Tecnica molto economica
Richiede minime quantità di sostanza
Tecnica sensibile
Le lastrine possono essere trattate
con una varietà di sostanze chimiche
che impartiscono alla fase stazionaria
un’ampia gamma di proprietà
Svantaggi
Numero di piatti teorici limitato
ESERCITAZIONE DI LABORATORIO
Analisi qualitativa di una miscela di amminoacidi
ESERCITAZIONE - Analisi qualitativa di una miscela di amminoacidi
METODO
Cromatografia monodimensionale ascendente. Una miscela di amminoacidi è separata su lastrina a gel
di silice usando alcool butilico – acqua – acido acetico come solvente di sviluppo e ninidrina come
agente localizzatore.
SOLUZIONI
Soluzioni a titolo noto di amminoacidi:
1.
Alanina
1 mg/cm3 di soluzione alcolica 0,5 M HCl
2.
Lisina
1 mg/cm3 di soluzione alcolica 0,5 M HCl
3.
Triptofano
1 mg/cm3 di soluzione alcolica 0,5 M HCl
4.
Glicina
1 mg/cm3 di soluzione alcolica 0,5 M HCl
Soluzione che contiene una miscela incognita di amminoacidi
Glicina
Triptofano
Lisina
PROCEDIMENTO
Segnare con la matita una linea a 1,5 cm dal bordo inferiore della lastrina.
Depositare circa 5 microlitri di miscela incognita in porzioni.
Depositare circa 5 microlitri di di ciascuna soluzione di amminoacido a titolo noto, a fianco del
campione incognito a distanza di 1 cm.
Asciugare con il phon.
Sviluppare il cromatogramma ponendo la lastrina nel solvente (alcool butilico / acqua / acido
acetico nel rapporto 4:2:1) per 30 minuti circa.
Asciugare la lastrina e spruzzare con soluzione di ninidrina.
Scaldare cautamente per parecchi minuti fino a comparsa delle macchie colorate (brune per
Glicina e violette per Alanina, Lisina e Triptofano.
1. Valutare per ciascun componente il fattore di
ritardo (Rf) e il numero di piatti teorici (N).
2. Risalire alla composizione del campione incognito.
GESTIONE DEI RIFIUTI
•Versare il solvente di scarto dei campioni TLC e quelli contenuti nelle
camere cromatografiche nei contenitore “Rifiuto Solventi Organici (TLC)”.
•Porre tutti i capillari usati per la TLC nel contenitore “Vetri rotti”.
•Le camere cromatografiche per la TLC, svuotate del solvente, devono
essere lasciate con il coperchio aperto sotto cappa e quando asciutte devono
essere riposte nel relativo scatolo. Non lavarle ne con acqua, ne con acetone
e neanche con sapone!
Separazione TLC di estratto di
pomodoro
• Analizzare un concentrato di pomodoro
• Estrarre sostanze principali: licopene e βcarotene
• Eseguire la tecnica cromatografica TLC
• Separare ed identificare componenti
Pigmenti nel concentrato di pomodoro:
LICOPENE: sostanza appartenente alla classe dei carotenoidi, è il
principale responsabile del colore rosso del pomodoro e di altri
pigmenti gialli e rossi caratteristici di alcuni frutti e verdure
(albicocca, pompelmo, cocomero, uva). E’ presente nel sangue e in
natura si trova sottoforma di isomeri strutturali di tipo trans e in
particolare nella frutta e nella verdura fresca la percentuale risulta
essere di 30mg/kg. Possiede un’altissima capacità antiossidante e
antiradicali liberi, per questo viene utilizzato in molteplici applicazioni
terapeutiche. Attualmente viene studiato per curare le malattie
degenerative delle cellule.
• β-Carotene: sostanza appartenente alla classe dei carotenoidi,
determina il pigmento giallo-arancio di prodotti naturali, ad esempio
della carota.
Descrizione dell’esperienza:
Materiale utilizzato:
•
•
•
•
Bilancia tecnica
Pipette graduate
2 becker, beuta, matraccio
Cotone idrofilo
Sostanze utilizzate:
•
•
•
•
•
50g pomodoro concentrato
Diclorometano
N-esano
Alcool etilico 95%
Sodio solfato anidro
Procedimento:
• Pesare nel becker 50g di concentrato di pomodoro e aggiungere
70ml di etanolo al 95% e agitare bene con la spatola;
• Mettere un po’ di cotone sul fondo di un imbuto e filtrare la miscela
pressando leggermente
• Trasferire in becker la componente solida rimasta sul filtro;
• Trattare con 50ml di Diclorometano ed agitare per 5minuti;
• Filtrare in un imbuto munito di cotone e raccogliere il filtrato in una
beuta.
• Si anidrifica con sodio solfato anidro. Portare a piccolo volume in
pallone da 100ml in rotavapor e portare a secco.
SEMINA
La semina viene
effettuata
con il nostro campione da
analizzare,tramite un
apparecchio chiamato
microsiringa o con un
semplice capillare per
punto di fusione; questo
procedimento deve
essere fatto
accuratamente
OSSERVAZIONI
• Il β-carotene è la
componente che sale con
maggiore velocità sulla
lastra a causa della
maggiore affinità con
l’eluente.
• Il licopene invece viene
rallentato perché instaura
dei legami con la fase
stazionaria che è il gel di
silice.
Licopene
β-carotene
Campione
ANALISI DATI
• L’analisi dei dati si basa su
un fattore chiamato: Rf
Rf= corsa della macchia /corsa
dell’eluente
Ogni sostanza ha un Rf
diverso.
ANALISI A UV
Qualora non sia possibile
osservare direttamente le
macchie di campione sulla
superficie della lastrina caso molto frequente - si
può ricorrere
all'osservazione sotto luce
ultravioletta o alla reazione
con reagenti che
sviluppano composti
colorati
CONFRONTO SPETTRI
• LICOPENE STANDARD
• LICOPENE ESTRATTO
CONFRONTO SPETTRI
• β – CAROTENE STANDARD
• β – CAROTENE ESTRATTO
CONCLUSIONI
• La tecnica TLC permette di separare i
componenti principali di una miscela;
• le sostanze estratte sono pure, cioè molto
simili agli standard.
• E’ possibile estrarre i componenti dal
pomodoro.