Metodi di studio
Il primo microscopio ottico
Un microscopio semplice
Hooke, 1665
Un moderno microscopio
Microscopi ottici da esercitazione
Anatomia di un microscopio
Fotocamera o
telecamera
Oculari
Stativo
Fonte di
illuminazione
Vite macrometrica
e micrometrica
Revolver con
obiettivi
Tavolino
traslatore
Condensatore
Diaframma
di campo
Anatomia di un microscopio
Anatomia di un microscopio
Anatomia di un microscopio
Microscopia Ottica
Microscopia Ottica
OSSERVAZIONI A FRESCO
•
Prime osservazioni
•
•
Il preparato si deteriora velocemente
Poco informative
•
Descrizioni brevi ed inesatte
Preparati in campo chiaro a
goccia schiacciata
Su un vetrino porta-oggetto
si pone una goccia di acqua
o soluzione fisiologica
Il materiale da osservare
viene posto sulla goccia ed
osservato
Preparati in campo chiaro
Un batterio
Campo chiaro, 1000x
Cellul
e
Microscopia Ottica
a Contrasto di fase
• Gli oggetti visti in campo chiaro hanno poco
contrasto
• Per migliorare le immagini è possibile sfruttare le lievi
differenze di indice di rifrazione del materiale da
osservare rispetto al mezzo circostante
• Applicando nel condensatore delle variazioni di fase alla luce
che raggiunge il preparato e applicando variazioni opposte
nell’obiettivo
• I raggi luminosi che sono stati modificati generano
fenomeni di interferenza che rendono più chiari o più scuri
gli oggetti illuminati
Microscopia Ottica a
Contrasto di fase
Permette, tramite
sistema di lenti di
osservare le cellule a
fresco
Le varie parti della
cellula appaiono come
strutture con diverse
tonalità di grigio
Un batterio
400x
Un lievito
(S. cerevisiae)
400x
Una muffa
(G. candidum)
400x
Osservazione in campo scuro
Un particolare tipo di
condensatore
nell’osservazione in campo
scuro consente di deviare i
fasci di luce in modo che le
lenti frontali dell’obiettivo
siano attraversati soltanto
dai raggi di luce diffratti o
diffusi dal preparato.
Gli oggetti appariranno
chiari su uno sfondo scuro.
In questo modo è possibile
osservare oggetti anche al
di sotto del potere di
risoluzione del microscopio
ottico
Osservazione in campo scuro
Uso di colorazioni per migliorare
il contrasto dei preparati
Utilizzando diverse classi di coloranti è possibile
migliorare il contrasto delle immagini al microscopio
Coloranti vitali
Le cellule possono essere colorate senza fissazione e
sono quindi solo minimamente alterate dal trattamento
Oggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per
colorare selettivamente specie diverse o strutture
cellulari diverse
Coloranti che richiedono fissazione
Le cellule devono essere disidratate prima della
colorazione, con possibile alterazione delle strutture
cellulari e della forma delle cellule
Preparazione di un Campione
Biologico per la Microscopia Ottica
•
Acquisizione del campione e taglio
in pezzi
•
•
(1cm3)
Biopsia, intervento chirurgico, autospia
postmortem
Prelevato rapidamente utilizzando strumenti
adatti (bisturi)
•
Fissaggio del campione
(immobilizzare, "uccidere" e preservare)
•
Generalmente per mezzo di aldeidi reattive
(formaldeide)
•
Cross-link delle macromolecole, in
particolare le proteine
•
Si ottiene un effetto indurente sui tessuti
"molli"
•
Deve essere fatto rapidamente per evitare
che gli enzimi persenti degradino il tessuto
•
Disidratazione del campione
attraverso passaggi in soluzioni a
concentrazione crescente di etanolo
•
Paraffina (materiale usato per l'inclusione)
non è solubile in H2O
•
Eliminazione dell'etanolo e
passaggi in xilene
•
Paraffina non è solubile nemmeno
nell'etanolo
•
Inclusione del campione in in
mezzo appropriato paraffina o
resina
•
Tessuti sono "molli" e fragili
•
Diversi passaggi in paraffina calda
•
La paraffina occupa lo spazio
precedentemente occupato dall'H2O
•
La paraffina fredda si indurisce e permette
di sezionare il campione
Taglio per mezzo di
un microtomo, che
produce sezioni dello
spessore di 1-10 mm
Montaggio delle
sezioni su vetrini per
microscopia
Sezione non colorata
Colorazione delle sezioni con il
metodo più appropriato
I coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina lo
xilene attraverso passaggi in etanolo
Colorazione automatizzata
Colorazioni
•
Colorazione
•
•
Con un colore brillante di certe
componenti del tessuto
Contro colorazione
•
Del resto del tessuto con un
colore contrastante
Ematossilina/Eosina
•
Ematossilina
•
Ha affinità per le molecole cariche
negativamente (DNA, RNA ed alcune
proteine)
•
Eosina
•
Ha affinità per le molecole cariche
positivamente (proteine del citosol)
Perchè questa "slide" è blu …
•
•
•
Se una porzione di
tessuto o di una cellula
si colora di blu/porpora,
viene detta basofila
È colorata
dall'ematossilina
Nuclei e ribosomi
generalmente sono
basofili
… e questa rossa ?
•
•
•
Se una porzione si
colora in rosso
/arancio/rosa, viene
detta acidofila o
eosinofila
È colorata dall'eosina
Sono le proteine del
citosol
Altre colorazioni
•
PAS
•
•
(Acido Periodico-Reattivo di Schiff)
Per sostanze ricche in
zuccheri (muco)
Tricromica o HazanMallory
•
•
Adiposo Bianco
Per i tessuti connettivi
Le fibre si colorano in blu
•
Con E&E sono rosa
Le aree bianche sono lipidi
•
Osmio o Sudan black
•
•
•
Per grasso/lipidi/mielina
I lipidi non incorporano
coloranti acquosi
Mielina
Argento ed oro
•
Per fibre delicate e
processi cellulari
Cellule nervose
•
Giemsa
•
•
Per le cellule del sangue
Simile ad E&E
Cellule del sangue
E le aree "bianche"?
•
I fluidi presenti nei tessuti
o negli spazi interstiziali
non si colorano con E&E
•
•
•
Sangue, linfa etc.
Si riconoscono come ampi
spazi bianchi
Anche i lipidi ed il grasso
non si colorano
Mesenchima
Interpretate il campione !!!
•
•
Dovete pensare in 3 dimensioni
Sezioni seriali sono l'ideale per
l'interpretazione e la ricostruzione
Ricostruzione per mezzo di
sezioni seriali
“Artefatti”
•
Shrinkage
•
•
•
Lascia dello spazio
aggiuntivo
Disidratazione e
fissaggio
Fratture al piano di
taglio
•
•
Tagli netti e ben
visibili
Lama deteriorata
•
Colorante precipitato
•
•
Tessuto "pinzato"
•
•
•
Macchie di colore a
"grano di pepe”
Strumento per
l'excisione deteriorato
Durante o dopo il
sezionamento
Pieghe
•
Durante il montaggio
Microscopia Elettronica
Microscopia Elettronica a
Trasmissione
•
Elettroni hanno una
lunghezza d'onda
corta
•
•
•
Alta risoluzione
Sezioni molto sottili e
coloranti elletrondensi
Gli elettroni passano
attraverso il campione
La maggiore risoluzione
del TEM permette di
visualizzare strutture
non visibili con il
microscopio ottico
Risoluzione dell'occhio:
0.2 mm = 200 µm
Risoluzione del MO:
200 nm = 2,000
Angstroms
Risoluzione del TEM:
2 Angstroms
1 mm = 1000 µm
1 µm = 1000 nm
1 nm = 10 Angstroms
Pinocitos
i
Preparazione di Campioni
Biologici per TEM
•
Acquisizione del campione e taglio in
pezzi (1cm3)
•
Fissaggio del campione con
glutaraldeide e poi tetrossido di osmio
•
L’osmio è un metallo pesante che si lega ai lipidi,
rendendoli elettrondensi (neri)
•
Coloranti non legano i lipidi, che nelle sezioni
appaiono chiari
Disidratazione dei campioni tramite
passaggi in soluzioni a concentrazione
crescente di etanolo
Inclusione dei campioni in piccoli blocchi
di resina
Taglio dei campioni inclusi con un ultramicrotomo dotato di lama al diamante
(a volte vetro)
La superfice da analizzare deve essere di
circa 0.2 mm
Lo spessore della sezione varia da 40 a
100 nm (di solito 65-80 nm)
Montaggio delle sezioni su di una
griglia
Colorazione delle sezioni con
nitrato o acetato di uranile e
citrato di piombo
Visualizzazione al TEM
Fotografia, sviluppo ed analisi
delle immagini
Freeze-fracture
•
Il tessuto prelevato viene
congelato a -140/150 °C
•
Con un martelletto viene
provocata la frattura,
secondo le linee di forza del
tessuto
•
Evaporazione e deposizione di
metalli pesanti
•
Eliminazione materia organica
Autoradiografia
Utilizzando isotopi radioattivi si possono
marcare strutture cellulari ben definite e
visualizzarle poi tramite microscopia
ottica od elettronica
Ottico
Elettronico
Microscopia Elettronica a Scansione
SEM fa una
scansione della
superfice del
campione
Produce immagini
3-D
Preparazione dei campioni
per SEM
•
Acquisizione del campione
•
Trattandolo con cura in modo da
non danneggiare la superficie
•
Fissazione e disidratazione
•
Non si include
•
Poggiato su di un
supporto e ricoperto
con un metallo
•
•
•
•
•
Oro, cromo, palladio,
carbone
Deve essere elettronconducente (non
elettrondenso)
Visualizzato al
microscopio
Fotografato
Si possono analizzare
le componenti chimiche
tramite raggi X
Microscopia a Fluorescenza
•
Il campione viene colorato con
anticorpi oppure sostanze specifiche
coniugate con fluorocromi
•
La luce utilizzata ha lunghezze d’onda
specifiche per eccitare i fluorocromi
•
I fluorocromi emettono radiazione blu,
rossa o verde
Microscopia a Fluorescenza
Microscopia Confocale
•
•
•
•
•
•
La luce monocromatica, di lunghezza d’onda
breve, è emessa da una sorgente laser,
attraverso un diaframma e deviata da uno
specchio dicroico, che permette il
passaggio di determinate lunghezze d’onda
Le lenti dell’obbiettivo focalizzano la luce
in un punto del piano ottico del campione
I fluorocromi usati per colorare vengono
eccitati ed emettono a lunghezza d’onda
maggiore, in grado di attraversare lo
specchio e focalizzarsi nel piano del
diaframma
Il foto-moltiplicatore amplifica l’intensità
del segnale e lo trasmette al computer che
elabora l’immagine
La luce che proviene dai piani superiori o
inferiori al piano focale non passa
attraverso il diaframma e non contribuisce
alla formazione dell’immagine
Diversi punti dello stesso piano e dei paini
consecutivi vengono illuminati e registrati
mediante la scansione col laser
QuickTime™ and a
Motion JPEG A decompressor
are needed to see this picture.
Metodi analitici
Come si analizzano gli organelli o la
struttura fine?
Metodiche che permettono l’isolamento dei
componenti cellulari intatti
Centrifugazione, semplice o differenziale
Permette l’isolamento sia delle cellule da un
tessuto sia delle singole componenti cellulari
Centrifugazione
Centrifugazione differenziale